矽膠載體蛋白a免疫吸附材料及其製備方法
2023-05-25 13:10:36 2
專利名稱:矽膠載體蛋白a免疫吸附材料及其製備方法
技術領域:
本發明涉及醫學領域的血液淨化材料,即矽膠載體蛋白A免疫吸附材料的製備方法。
背景技術:
血液淨化是近年出現的新的臨床治療方法,主要是通過清除存在於血液中的致病物質及代謝毒素實現治療疾病的目的。葡萄球菌蛋白A能特異性地與人體免疫球蛋白,特別是與免疫球蛋白IgG結合。大量的臨床證據表明,蛋白A吸附柱能有效地清除血液中的免疫球蛋白,對因免疫球蛋白的質的改變及量的增多導致的疾病如自身免疫性疾病有很好的治療效果。
免疫吸附療法是血液淨化的重要方法,是近年來興起的一種治療疑難病症的新方法,其特徵是通過在體外建立的人體血液循環支路使血液通過免疫吸附柱吸附除去患者血液中的致病物質,淨化人體內環境,達到治療疾病的目的。免疫吸附柱中含有的免疫吸附材料可與血液中的致病物質(如免疫球蛋白IgG)特異結合,而對血液中的其它成分則無損害。蛋白A(protein A)是某些金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白質,其氨基末端有4個高度類同的Fc結合區,可與人血漿中的抗體及其免疫複合物的Fc段特異結合,蛋白A與抗體及其免疫複合物結合後又可被pH 2.3-2.5的酸性溶液解離。由於免疫吸附療法是直接從血液中去除致病物質,其療效顯著,副作用小,是一個具有廣泛應用前景的治療方法。免疫吸附治療的關鍵是免疫吸附柱的研製,具體的說就是免疫吸附柱中免疫吸附材料的製備。
為了得到機械性能穩定的蛋白A免疫吸附材料,必須將蛋白A端位氨基或端位羧基通過化學鍵偶聯於載體材料(即骨架)上才能製備成吸附材料。目前,臨床上使用的蛋白A免疫吸附材料採用的載體材料主要是瓊脂糖凝膠、矽膠、聚乙烯醇、聚丙烯酸等。文獻報導的蛋白A與載體的連接一般採用蛋白A的端位氨基通過偶聯劑與載體的羥基或羧基連接,偶聯試劑一般採用溴化氰、活性羰基咪唑、氨烷基三甲(或乙)氧基矽等。由於溴化氰是劇毒物質,合成過程對人體和環境危害較大;並且用溴化氰方法偶聯的蛋白基團容易脫落,所以這一合成工藝不甚理想。氨烷基三乙氧基矽與矽膠偶聯法,製備工藝複雜。
賈凌雲發明了用瓊脂糖凝膠製備蛋白A免疫吸附材料的新方法(申請號01106107.3,公開號CN1367181A),其採用二羰基咪唑活化法,載體材料仍為瓊脂糖凝膠。雖然該法剔除了劇毒物質溴化氰,其製備和使用都更安全,但其製備過程經過四步化學反應才合成吸附材料,原理如下(a)瓊脂糖凝膠與N,N-二羰基咪唑反應形成含有咪唑氨基甲酸鹽的活性瓊脂糖凝膠;(b)咪唑氨基甲酸鹽的活性瓊脂糖凝膠與二氨基二丙基胺反應形成二氨基二丙基(DAPDA)的瓊脂糖凝膠;(c)二氨基二丙基(DAPDA)的瓊脂糖凝膠與戊二醛反應形成含醛基活性基團的瓊脂糖凝膠;(d)含醛基活化基團的瓊脂糖凝膠與蛋白A反應形成蛋白A吸附材料。
該法製備路線長、方法複雜,因此得到的吸附材料價格昂貴。另外瓊脂糖凝膠機械穩定性能、耐酸鹼性能差,過柱速度慢,吸附柱復用次數少,使用成本高;發明內容本發明的目的在於提供一種無毒、無害、機械穩定性和熱穩定性以及化學穩定性能更好的矽膠載體蛋白A吸附材料。
本發明的另一目的是提供一種反應路線較短、操作簡便、原材料易得的上述吸附材料的製備方法。
本發明的再一目的是提供上述吸附材料在血液淨化中的應用。
矽膠是一種矽酸凝膠,具有大的比表面積,優良的機械穩定性、熱穩定性和動力學特性。矽膠載體蛋白A免疫吸附材料,是選擇一種即可與矽膠上羥基偶聯又可與蛋白A偶聯的偶聯活化試劑,以增加材料上與蛋白A偶聯的強度,提高材料的化學穩定性和吸附性能,從而減少臨床應用的副作用,提高臨床效果。
本發明的技術方案是一種矽膠載體蛋白A吸附材料是一種活化矽膠與蛋白A的偶聯高分子材料具有如下的結構 其中氧剩餘鍵可與氫連接,也可能與矽連接,或與另一個烷基矽連接。其中 代表矽膠表面的矽氧鍵,-CH2(CH2)n-為C3~18的直鏈烷撐基,優選C3~6 為蛋白A。
上述矽膠材料由以下方法獲得以矽膠為基質,採用滷代烷基三滷化矽為活化劑和偶聯試劑,將蛋白A以共價鍵方式固定在矽膠載體上,具體是1、用含單分子水膜的矽膠與滷烷基三滷化矽反應得到滷烷基矽膠活化劑; 矽膠含水量為1%~5%(重量比),優選方案2%~3.5%(重量比),最佳方案3.0%(重量比),即矽膠含水1.67mmol/g。
滷烷基三滷化矽X3SiCH2(CH2)nY優選方案X、Y為Cl、Br,最佳方案為X=Cl,Y=Br。滷烷基三滷化矽與單分子水膜的矽膠反應配比為與矽膠含水量等摩爾比。
吸附性能與n的關係n越大,矽膠表面烷基化率就越低,偶聯蛋白A密度也越低。n越小,矽膠表面烷基化就越高,偶聯蛋白A密度也越高。由於蛋白A是一個具有42000分子量的大分子,與其特異性結合的抗體及其複合物是幾十萬到上百萬分子量的更大分子,蛋白A要保持其吸附能力,需要保證與固體材料鍵合後,其空間立體結構不變形,同時大分子抗體及其免疫複合物與蛋白A的接觸也需要有足夠的空間,蛋白A免疫吸附材料的微環境對其吸附能力的影響很大。如果在材料表面與蛋白A之間加入一定長度的橋聯臂,使蛋白A與材料表面保持一定的距離,將保證其立體空間結構不變,使固定化後的蛋白A有很好的柔性和足夠的空間,有利於與抗體和免疫複合物的鍵合,材料上蛋白A吸附效率的提高,使得在免疫吸附柱吸附容量一定的情況下,蛋白A的用量減少,其特異性吸附也更好。橋聯臂分子的長度對材料上固定的蛋白A活性影響很大,橋聯臂過短,不利於蛋白A活性的發揮;橋聯臂過長易發生摺疊現象,並且,偶聯密度低。本發明選擇方案為n=2~17,優選方案為n=2~5的中等長度的橋聯臂為最適,並且原料易得。本發明選擇溴丙基三氯化矽、氯丙基三氯化矽、溴丁基三氯化矽、溴己基三氯化矽作錨定劑。
2、滷烷基矽膠活化劑與蛋白A 的反應製備矽膠偶聯蛋白A吸附材料,反應式 反應性能與Y的關係蛋白A與烷基化的矽膠反應活性取決於Y,Y=Cl時,反應活性低,不利於蛋白A與矽膠的偶聯。Y=I,試劑昂貴,本發明最佳方案為Y=Br,反應活性適中,原料易得。未反應的溴活性基,可用乙醇胺或二乙醇胺取代。
蛋白A與烷基化矽膠的配比由於蛋白A價格昂貴,材料的主要成本取決於蛋白A,因此反應時配比應根據應用時的要求及使用成本確定。本發明推薦方案為滷烷基矽膠與蛋白A的重量比為10~3∶1,優選5∶1。
本發明的基本原理是Fischer和Rosenberg等(USP5695882,USP5997748)提出了一種矽膠烷基化合成路線,其方法是首先用酸清洗矽膠表面,隨後溼潤矽膠,使矽膠表面覆蓋單分子水膜。再用短鏈的錨定劑溴烷基三氯化矽(如Cl3SiCH2(CH2)2Br)等與矽膠表面作用,形成溴烷基矽膠活化劑。溴烷基上的碳原子與矽膠表面的矽原子以共價鍵結合,化學性質穩定。本發明是利用Fischer和Rosenberg等人的方法合成滷素烷基矽膠活化劑(1)再與蛋白A反應得到矽膠偶聯蛋白A吸附材料(2)。
基於以上敘述,本發明的顯著優勢和效果是(1)選用矽膠作為蛋白A吸附材料的載體,並用滷烷基三氯化矽作偶聯試劑,簡化了合成工藝,增加了可與蛋白A鍵合的活性基團的含量,提高了單位體積吸附抗體的數量;也增加了蛋白A與矽膠偶聯的穩定性;(2)通過在矽膠活性材料表面和蛋白A之間引入一定長度的烷基橋聯臂,為蛋白A與抗體及抗體抗原複合物的結合創造了足夠的空間,改善了材料的微環境,從而提高了蛋白A的活性和對抗體的結合效率,減少了蛋白A的用量,降低了生產成本;(3)矽膠偶聯蛋白A免疫吸附材料機械穩定性能、化學穩定性能好,過柱速度快,吸附效率高。
以上的優勢在臨床治療上將表現為降低病人的治療費用,同時治療時間縮短,安全性、可靠性增加。體外血漿吸附試驗表明,本發明的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料對免疫抗體IgG具有特異性吸附。
具體實施例以下詳述本發明的最佳實施例實施例1
單分子水膜矽膠的製備在裝有溫度計、機械攪拌器、冷凝器的1000ml三口燒瓶中,加入粉狀矽膠(粒徑50~150μm)100g,1mol/L硝酸400ml,在攪拌下加熱回流6小時;冷卻後過濾,並用去離子水洗滌至濾液呈中性。然後用400ml甲醇洗滌,抽乾後,在120℃乾燥2~4小時,冷卻備用。
將上述製備的乾燥矽膠攤開於玻璃器皿中,並置於飽和溴化鈉的潮溼空氣中15小時左右稱量,重量增加3.0%左右時停止吸水,即可用於下步反應。
實施例2溴丙基矽膠的製備在裝有機械攪拌器的乾燥500ml三口燒瓶中,放入150ml乾燥正己烷和21g商品試劑溴丙基三氯化矽(83mmol),攪勻後加入51.5g吸水矽膠(吸水量83mmol),室溫攪拌1小時。真空排除產生的HCl,繼續反應10小時,過濾。每次用150ml正己烷洗滌三次,真空乾燥3小時後,產物在110℃烘烤2小時。得溴丙基化矽膠約54.5g(每克含溴丙基活化基團0.55mmol),轉化率36.0%。
實施例3氯丙基矽膠的製備在裝有機械攪拌器的乾燥500ml三口燒瓶中,放入150ml乾燥正己烷和17.6g商品試劑氯丙基三氯化矽(83mmol),攪勻後加入51.5g吸水矽膠(吸水量83mmol),室溫攪拌1小時。真空排除產生的HCl,繼續反應10小時,過濾。每次用150ml正己烷洗滌三次,真空乾燥3小時後,產物在110℃烘烤2小時。得氯丙基化矽膠約53.3g(每克含氯丙基活化基團0.58mmol),轉化率37.7%。
實施例4矽膠偶聯蛋白A吸附材料的製備(1)溴丙基化矽膠與蛋白A的偶聯在裝有攪拌器、溫度計及冷凝器的500ml三口燒瓶中,加溴丙基化矽膠50g(含溴丙基活化基27.5mmol),加入0.1mol/L的磷酸緩衝液300ml,pH值控制在8.0~8.5範圍內,加入10g蛋白A。在25℃恆溫反應12小時以上,回收未反應的蛋白A,再加入乙醇胺10ml反應3小時停止反應,過濾。用0.1mol/L的磷酸緩衝液,每次用200ml洗滌三次。蒸餾水每次100ml洗滌三次,甲醇浸泡洗滌一次,過濾,室溫真空乾燥。得到53.5g矽膠偶聯吸附材料,每克含蛋白A 0.065克。
(2)氯丙基化矽膠與蛋白A的偶聯在裝有攪拌器、溫度計及冷凝器的500ml三口燒瓶中,加氯丙基化矽膠50g(含氯丙基活化基29.0mmol),加入0.1mol/L的磷酸緩衝液300ml,pH值控制在8.0~8.5範圍內,加入10g蛋白A。在25℃恆溫反應12小時以上,回收未反應的蛋白A,再加入乙醇胺10ml反應3小時停止反應,過濾。用0.1mol/L的磷酸緩衝液,每次用200ml洗滌三次。蒸餾水每次100ml洗滌三次,甲醇浸泡洗滌一次,過濾,室溫真空乾燥。得到52.7g矽膠偶聯吸附材料,每克含蛋白A 0.051克。
實施例5矽膠載體偶聯蛋白A免疫吸附柱的血漿吸附實驗將上述方法合成的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料50g,放入燒杯中用生理鹽水浸泡1小時再裝於φ20×100mm的柱中,用生理鹽水充分衝洗柱子。再將100ml人體血漿經過吸附柱,過柱速度為20ml/min,生理鹽水洗脫柱中血漿直到在280nm的吸收值為零。用0.2mol/L,pH=2.3甘氨酸-HCl緩衝液洗脫柱中吸附的抗體及其免疫複合物,收集洗脫液。吸附柱再用約150ml的平衡緩衝液平衡柱子,用約150ml的生理鹽水衝洗掉平街緩衝液,再生過程完畢。經測定,洗脫液中吸附物主要為抗體。吸附柱經50次吸附、洗脫、再生後,吸附效率未發現顯著變化。
權利要求
1.矽膠載體蛋白A免疫吸附材料,是一種活化矽膠與蛋白A的偶聯高分子材料,具有如下的結構 其中 代表矽膠表面的矽氧鍵結構,-CH2(CH2)n-為C3~18的直鏈烷撐基, 為蛋白A。
2.權利要求1所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料,其中-CH2(CH2)n-為C3~6的直鏈烷撐基。
3.權利要求1或2所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料的製備方法,其特徵是以矽膠為基質,採用滷代烷基三滷化矽為活化劑和偶聯試劑,將蛋白A以共價鍵方式固定在矽膠載體上,具體是(1)、用含單分子水膜的矽膠與滷烷基三滷化矽反應得到滷烷基矽膠活化劑; X3SiCH2(CH2)nY中X、Y為滷素;(2)、滷烷基矽膠活化劑與蛋白A 的端位氨基偶聯反應製備矽膠偶聯蛋白A吸附材料
4.權利要求3所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料的製備方法,其中矽膠含水量重量比為1%~5%。
5.權利要求4所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料的製備方法,其中矽膠含水量重量比為2%~3.5%。
6.權利要求3所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料的製備方法,其中滷烷基三滷化矽X3SiCH2(CH2)nY中X為Cl,Y為Br,並且滷烷基三滷化矽與單分子水膜的矽膠反應配比為與矽膠含水量等摩爾比。
7.權利要求3~6之一所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料的製備方法,其中滷烷基矽膠活化劑與蛋白A的重量比為3~10∶1。
8.權利要求7所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料,其中滷烷基矽膠活化劑與蛋白A的重量比為5∶1。
9.權利要求1~2之一所述的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料在血液淨化中的應用。
全文摘要
本發明涉及到用於血液淨化的矽膠載體蛋白A免疫吸附材料及其製備方法。公開了一種活化矽膠與蛋白A的偶聯高分子材料,該材料是以矽膠為基質,採用滷代烷基三滷化矽為活化劑和偶聯試劑,反應得滷烷基矽膠活化劑,再與蛋白A端位的氨基偶聯,將蛋白A以共價鍵方式固定在矽膠載體上。該材料的合成方法簡便、工藝路線短、製備安全;其物理、化學性質穩定,蛋白A偶聯密度高,對免疫抗體的吸附效率高,降低了生產和使用成本。
文檔編號A61L33/12GK1686578SQ20051003426
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月26日 優先權日2005年4月26日
發明者陳校園, 許春生 申請人:廣州康盛生物科技有限公司