降解石油的細菌及其應用的製作方法
2023-05-25 10:34:31
專利名稱：降解石油的細菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域中一株降解石油的微生物及其應用，特別涉及一株降解石油的細菌及其應用。
背景技術：
當今世界正在進行一場以生物工程及應用為標誌的新技術革命，而生物開發能源技術成為生物工程中經濟潛力最大、最有希望和前途的領域之一，現代化分析儀器和手段也使微生物科學進入一個嶄新的發展時期，這些因素推動了微生物強化採油技術的研究和應用。
石油是一種非再生的能源，經過一次採油和二次採油後，地層中仍有約60％-70％的原油無法開採出來。如何提高採收率，從地下採出更多的原油，多年來一直是許多國家不斷研究的課題。目前普遍採用的是用化學方法開採原油，如鹼、表面活性劑、聚合物組成的ASP三元複合驅油體系(牟建海，李幹佐.[J].化工科技市場.2000，23(7)17)。從1980年以來，很多國家開展了用微生物方法提高原油採收率的技術，經過二十多年的努力，該技術取得了極大進展。這種使用化學或生物製劑提高採收率的技術被稱為三次採油技術，國外亦稱強化採油(EOR，Enhanced OilRecovery)技術。為了將它們區分開來，用微生物提高採收率技術也可以稱為四次採油技術或微生物強化採油(MEOR，Microbial Enhanced Oil Recovery)技術，它是指利用微生物生產有用的代謝產品或者利用微生物能夠分解碳氫化合物的性能，從而提高原油採收率的技術。
微生物強化採油技術是一項科技含量高、發展迅猛的新技術，是現代生物技術在採油工程領域中開拓性的應用，對於高含水和接近枯竭的老油田更顯示出其強大的生命力。微生物強化採油技術主要包括兩類(李虞庚.石油微生物學.[M].上海上海交通大學出版社.1996)一類是利用微生物產品如生物聚合物和生物表面活性劑作為油田用化學劑進行驅油，稱為微生物地上發酵提高採收率工藝，即生物工藝法，目前該技術在國內外已趨成熟；另一類是利用微生物及其代謝產物提高採收率，主要是利用微生物地下發酵和利用油層中固有微生物的活力，稱為微生物地下發酵提高採收率方法。
降解石油微生物的分離是實現微生物強化採油技術的基礎，菌種的好壞是微生物採油的關鍵。目前，已分離得到一些降解石油的微生物，如賓夕法尼亞原油協會的Beck報導了用硫酸鹽還原菌進行釋放原油的實驗，研究表明硫酸鹽還原菌在細菌石油分解中出現的良好效果(1947年)，該實驗後來由厄普德格拉斐和雷恩進一步證實(1954年)。拉裡維雷(1955年)觀測了銅綠假單胞菌、分枝桿菌、枯草芽孢桿菌、脂解酶念球菌等在甘油等培養物中的表面張力，表面張力下降明顯，但利用烴類並不好。
發明創造內容本發明的目的是提供一株能夠降解石油的細菌。
能夠降解石油的菌株是短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT，已於2004年04月08日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC №1142。
短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT CGMCC №1142自黑龍江省大慶市的第一採油廠的油水樣中分離得到，其菌落乳白色，溼潤，直徑0.2mm-0.4mm，細胞為杆狀；細胞直徑＞1μm；形成芽孢，芽孢膨大，芽孢非圓形；生理生化特徵如表1所示表1.短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT生理生化特徵
注「+」表示生長或反應陽性；「-」表示不生長或反應陰性。
實驗證明，短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT CGMCC №1142能有效地改善原油的性質，原油酸值提高14倍以上，輕組份增加，含蠟含膠降低率30-50％，原油流變性變好，油水間界面張力降低，發酵液中有機酸等物質含量增加；其代謝原油途徑為次末端氧化，產生了一種新型脂類表面活性劑。該菌株可廣泛應用於採油工程領域特別是微生物強化採油領域。
圖1為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的溶油照片圖2為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT產表活劑的溶血照片圖3為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌數隨培養天數的變化圖4為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌數與氮源濃度曲線圖5為液體石蠟和原油為碳源時對短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌數的影響曲線圖6為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT作用原油前後的培養瓶照片圖7為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT作用後原油全烴色譜8為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT作用前後原油流變性變化曲線圖9為空白油樣芳烴分子量圖10為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT作用後油樣芳烴分子量圖11a為空白油樣非烴顯微-紅外分析圖譜圖11b為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT作用後油樣非烴顯微-紅外分析圖譜圖12為烷烴微生物氧化一般途徑圖13為烷烴次末端氧化途徑圖14a為有機酸混合標樣的色譜14b為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT樣品中有機酸色譜15a為乙酸的質譜15b為丙酸的質譜15c為丁酸的質譜15d為異戊酸的質譜16a為有機醇標樣的色譜16b為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT樣品的有機醇色譜17為乙醇的質譜18a為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT樣品中提取的B1物質的紅外光譜18b為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT樣品中提取的B2物質的紅外光譜18c為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT樣品中提取的C物質的紅外光譜圖具體實施方式
實施例中的百分比濃度均為質量百分比濃度。
實施例1、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的分離短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的分離分為取樣和富集培養，篩選和純化兩個步驟，具體方法如下1、取樣和富集培養取黑龍江省大慶市的第一採油廠的油水樣後立即富集培養，使所需的菌種在數量上佔優勢，抑制不需要的菌種生長。富集培養基用的是無機鹽培養基K2HPO40.1-1％，NaH2PO40.1-0.5％，(NH4)2SO40.05-0.2％，MgSO4·7H2O 0.01-0.5％，FeCl20.001-0.01％，CaCl20.001-0.01％，酵母浸粉0.02-0.2％，原油0.5-20％；pH 6.8-7.5121℃，滅菌15-20min。45℃120rpm搖床培養5-7天。
2、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的篩選和純化篩選用的兩種選擇性培養基是原油無機鹽固體培養基和血平板培養基。
a.原油無機鹽固體培養基上的篩選這種選擇性培養基中除了原油之外未加任何碳源，篩選出的菌種就是可以以原油為唯一碳源生長的菌種。在無菌條件下製備步驟1所述的富集無機鹽固體培養基平板，把稀釋後的原油倒入製備好的無機鹽固體培養基平板上(原油的加入量為1ml原油/L培養基)，待原油均勻地平鋪在無機鹽平板表面凝固後，將步驟1中的富集培養液均勻塗布在平板上。45℃培養3-5天，結果如圖1所示，可以明顯地看出長菌地方的原油被利用，無機鹽平板上的原油層變薄形成透明圈。選擇能形成透明圈的菌種，待進一步純化。
b.血平板培養的篩選將步驟1中的富集培養液均勻塗布在血平板上。45℃培養1-2天，結果如圖2所示，表明培養後的菌落周圍形成明顯的溶血透明圈，挑選這樣的菌落待進一步純化。由於生物表面活性劑具有能夠溶血的特性，溶血的單菌落即是產生生物表面活性劑的菌種。血平板培養基的組成牛肉膏0.3％，蛋白腖1％，酵母膏0.01％，氯化鈉0.5％，瓊脂2％，羊血5％。
c.將通過上述選擇性培養基得到的單菌落顯微鏡下染色觀察，如果不純，再一次地利用上述的培養基分離，直到得到純的菌落。為了獲得厭氧和兼性的菌種，把通過上述的兩種選擇性培養基獲得的菌種在厭氧工作站中45℃培養5天，獲得以原油為唯一碳源的一株菌HT，該菌株具有良好的產表面活性劑、產酸、改善原油物性等特性。
可選用下述兩種方法對該菌株進行長期的菌種保藏①低溫保藏取處於對數生長期的菌種，用15％無菌甘油作保護劑在-70℃保存；②冷凍乾燥製備乾粉離心發酵液得到菌體，用脫脂牛奶作保護劑，冷凍乾燥製成乾粉。
實施例2、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的培養條件和過程優化實驗為了提高培養液中的菌數及有利的代謝產物，對篩選的短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的培養條件和過程進行優化，以得到較理想的實驗條件。其中包括培養時間及最適的氮源及無機鹽量的優化。具體方法如下1、培養時間的優化短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的菌種接入液體培養基K2HPO40.5％，NaH2PO40.5％，(NH4)2SO40.1％，MgSO4·7H2O 0.1％，FeCl20.005％，CaCl20.001％，酵母浸粉0.1％，液體石臘10％，pH 6.8-7.5，在45℃分別120rpm培養1、3、5、7、9、11、13、15、17天，用血球計數板計菌數；結果如圖3所示，表明當發酵液培養到30小時時對數生長結束，進入平穩期，菌數最大為6×109個/ml，平穩期可以保持到第6天左右，後菌數緩慢下降。
培養基的優化是以菌數多少為標準的，當以得到菌體為目的時，培養時間為30小時，培養基的碳源為液體石蠟。但以得到菌體代謝產物或對原油產生最好效果為目的時，培養基的碳源為原油，時間與液體石蠟為碳源時並不一樣。根據實驗結果，要使該菌株對原油產生最佳效果，包括乳化、降粘、降解等作用，該菌株代謝產物積累或對原油作用最佳時間為3-15天。
2、氮源(NH4)2SO4對的菌數影響短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的菌種以相同的接種量接入分別加入濃度為0.1％、0.15％、0.175％、0.2％、0.225％、0.25％、0.3％(質量百分比)(NH4)2SO4的液體培養基K2HPO40.5％，NaH2PO40.5％，MgSO4·7H2O 0.1％，FeCl20.005％，CaCl20.001％，酵母浸粉0.1％，液體石臘10％，pH 6.8-7.5中後，在45℃分別120rpm培養30小時，血球計數板計菌數。結果如圖4所示，表明當(NH4)2SO4濃度為0.2％和0.225％時菌數最高，達到2.4×1010個/ml。
3、無機鹽K2HPO4和NaH2PO4的最適量在微生物生長代謝過程中，鉀、鈉離子和磷酸根離子既作為細胞重要的組成物質又作為重要的代謝調控物質，在菌體生長和發酵過程中起著重要的作用，它們在培養基中的含量多少，勢必影響微生物的生長及發酵液中目的代謝產物的產量。同時，無機鹽K2HPO4和NaH2PO4在培養液中又是pH緩衝液，對細胞在發酵生產過程中PH值的調節起到十分重要的作用。利用正交試驗設計，將短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT的菌種以相同的接種量接入分別加入表2所示濃度的K2HPO4和NaH2PO4液體培養基(NH4)2SO40.1％，MgSO4·7H2O 0.1％，FeCl20.005％，CaCl20.001％，酵母浸粉0.1％，液體石臘10％，pH 6.8-7.5中後，在45℃分別120rpm培養30小時，血球計數板計菌數。結果如表2所示表2.無機鹽K2HPO4和NaH2PO4實驗結果實驗 K2HPO4 NaH2PO4菌數(個/ml)編號 (質量百分比濃度％)1 0.060.151.7×1082 0.080.151.7×1093 0.1 0.153.7×1094 0.120.151.0×1095 0.060.2 9.0×1086 0.080.2 1.0×10107 0.1 0.2 2.4×10108 0.120.2 1×10109 0.060.257.33×108100.080.253.7×109110.1 0.259×109120.120.256.7×109表2表明，當兩種無機鹽K2HPO4和NaH2PO4的量分別為0.1％和0.2％時細菌濃度最高，而且這個濃度時溶液pH值在7左右，在發酵過程中溶液的pH基本保持不變，易於對菌種發酵過程進行控制。因此，這兩種無機鹽在此濃度既可以為該菌株生長提供足夠生長的養分，又可以對發酵液PH值起到很好的緩衝作用。
4、以液體石蠟和原油為碳源時，對菌數的影響在菌種篩選中已經證明短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT可以利用原油為碳源生長。以K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源為2％液體石蠟或4％原油為培養基在45℃發酵短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT，取培養1天、3天、5天、7天、10天、15天的培養液，血球計數板計菌數，測不同碳源對菌種生長的影響。結果如圖5所示，表明以液體石蠟為碳源的培養基中，菌數在第一天時已達到很高的值，可保持到第7天，10天後菌數明顯下降。以原油為碳源的培養物中菌數在第5天時達到很高的數量，在測量到十五天時，仍保持一個平穩的值。以液體石蠟為碳源時，菌數可很快達到最大值。這是因為液體石蠟是一種飽和烷烴的混合物，該菌株較容易利用。因此，在地面發酵時可以在很短的時間得到足夠的培養物。在第7天後，由於細胞代謝產物的積累和營養物質的減少以及細胞自融等影響，菌數開始減少。而以原油為碳源時3-5天時菌數達到較高的值，並可保持很長時間，這有利於微生物在地下在加入很少量的其它碳源的條件下利用原油為碳源生長繁殖，長時間保持很高的菌數，對原油產生作用，達到驅油的效果。
根據該實驗結果確定了培養基的配方K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2。碳源為2％液體石蠟或4％原油。
實施例3、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT對原油的降解1、分散乳化效果短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌種在含有K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源為10％原油的培養基中45℃，120rpm搖床培養5天後的結果如圖6所示，表明與對照(未加菌)相比，發酵液的顏色明顯加深，而且，作用後原油具有不掛瓶的特點。由於微生物以原油為唯一碳源生長，改變了原油的性質，使原油的組分發生了變化。圖6中，左側培養瓶為對照，右側培養瓶為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)HT的發酵培養液。發酵後的原油在顯微鏡下觀察，發現原油中有菌液存在。細菌存在油水界面上，並以油為碳源，適應環境產生驅油物質，從而起到乳化、潤溼、分散原油的作用。
2、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT作用前後原油全烴色譜圖取步驟1中發酵5天後的原油按常規方法作原油的全烴分析。結果如表3和圖7所示，表3表明從全烴色譜分析各項參數的變化看到，該菌株可選擇性的降解原油中的某些高碳數烷烴，長鏈烴含量相對減少，短鏈烴或低鏈烴含量相對增加，原油的輕質組分增加；另外，∑C21/∑C22和C21+C22/C28+C29是描述油氣運移的參數，那麼∑C21/∑C22和C21+C22/C28+C29的比值增加，表示原油運移的方向，隨著高分子化合物含量相對減少，輕組分化合物含量相對增加。圖7表明由於高分子量烴類的熱降解而向低碳數範圍轉移，色譜圖逐漸變為前高鋒型，正烷烴碳數分布曲線向輕組份方向移動。原油的流動性變好。
表3.菌株HT發酵後的原油的飽和烴色譜檢測結果
3、原油流變性變化情況短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌種在含有K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源為10％原油的培養基中45℃，分別在120rpm搖床培養5天後，按常規方法分析微生物作用前後原油流變性，結果如圖8所示，表明作用後原油流變性明顯變好，粘度降低。當轉子轉數為6l/s時，作用前原油粘度為101mPa·s，該菌株作用後原油粘度降低到56.9mPa·s，原油粘度降低了43.7％。
4、原油含蠟、含膠變化在步驟2中分析了原油烷烴分布情況後，為了進一步探討菌株作用前後原油含蠟、膠的變化情況，按常規方法做了原油含蠟、含膠變化實驗，結果如表4所示，表明菌種作用前後原油的蠟和膠質的含量都有不同程度的變化，該菌株作用後原油含蠟量由空白的20.2％下降至12.6％，含膠量由空白的19.8％下降至15.1％。
表4.菌種作用前後原油蠟、膠的變化表
5、原油中芳烴的變化取步驟1中發酵5天後的原油按常規方法進行GC-MS，分析原油芳烴中菲系列的相對含量，結果如表5所示，表明該菌株選擇性地降解了菲系列中的不同組分，引起MPI、DPI指數的變化。原油中的菲系列一般認為是來自甾萜化合物的裂解。由於烷基在菲環上位置不同，穩定性也有差異，一般處在β位的甲基，如3-甲基和2-甲基菲較穩定，在α位的1-甲基、4-甲基菲以及處於中位的9-甲基菲比較活躍，二甲基菲也有相似規律，從αα型、αβ型至ββ型，穩定性依次增高，該菌株作用後，原油的MPI和DPI指數均有一定的提高，說明菲系列中化學性質較為活躍的組分易被該菌株降解。其總離子流圖如圖9和圖10所示。
表5.HT菌株作用前後原油中芳烴GC-MS分析結果序號 樣品名稱 菲系列含量(％) MPIDPI1空白油7.26 0.67 0.872HT油 7.21 0.72 0.91備註MPI＝1.5×(2-甲基菲+3-甲基菲)/(菲+1-甲基菲+9-甲基菲)DPI＝4×(二甲基菲①+二甲基菲②+二甲基菲③+二甲基菲④)/(菲+二甲基菲⑤+二甲基菲⑥+二甲基菲⑦)6、原油中非烴的變化取步驟1中發酵5天後的原油採用顯微-紅外法分析該菌株作用前後原油中非烴成分和結構的變化，結果如圖11a和圖11b所示，圖11a表明2924cm-1和2853cm-1處的吸收峰分別代表甲基和亞甲基的C-H不對稱和對稱伸縮振動，亞甲基佔優，因為一般甲基的C-H伸縮振動峰在2960cm-1和2870cm-1處，被亞甲基峰覆蓋，加上722cm-1峰為長碳鏈(n＞4)中亞甲基的吸收峰，說明原油非烴以長碳飽和鏈為主，而且支鏈程度不大；1461cm-1和1376cm-1處甲基、亞甲基的C-H彎曲振動峰是以上推斷的旁證。1601cm-1處的吸收峰可能是C＝N、C＝C雙鍵伸縮振動引起的，但根據指紋區910cm-1以下的不明顯紅外吸收峰(與苯環的取代位置有關)，可以推斷原油非烴中含有一定量的芳烴成分。1650-1900cm-1範圍內的吸收峰主要表現為羰基化合物，如醛、酮、酸、酯、酸酐以及醯胺等的C-O伸縮振動，從紅外光譜上看，該範圍內峰的吸收強度弱，且成寬帶形，可能是因為原油非烴中含有少量帶羰基的混合化合物。圖11b表明該菌株作用後與微生物作用前相比主要區別是在2483cm-1處出現新的紅外吸收峰，峰形寬而鈍，這是由於羥基在分子間或分子內形成氫鍵而產生的，但在1603cm-1處沒有明顯的紅外吸收峰，說明氫鍵不是因為樣品中含有水而引起。根據峰形特徵和化學位移的偏移規律，推斷該菌株作用後原油菲烴中有一定量的羧酸生成，羧酸內由於羰基和羥基的強烈締合，依據羧酸含量的不同紅外吸收峰可從3300cm-1延續到2500cm-1以下。
為了進一步證實，測定了該菌株作用前後原油非烴的酸值，結果如表6所示，表明該菌株作用以後，原油非烴的酸值增加到原來的14倍，說明該菌株在對原油不同組分的降解過程中發生了生物氧化反應，生成了高碳有機酸，提高了原油的酸值。
表6.HT菌株作用前後原油非烴酸值分析結果序號 樣品名稱 非烴酸值(％) 酸值增加(倍)1 空白油 0.1037
2 HT油1.479914.277、原油中飽和烴生物降解機理分析從以上的研究可以看出，該菌株對原油的降解以氧化降解為主要途徑。大多數微生物對烷烴的主要氧化途徑都可以用圖12概括，首先是對烷烴進行末端氧化(或β-氧化)生成脂肪酸，再按β-氧化途徑降解烷烴，並伴生醯基-CoA參與微生物的代謝活動。一般地，對於一特定的烷烴，微生物降解產物脂肪酸是一彼此相差兩個碳的混合酸，只是降解條件和碳數的不同，混合酸的碳數分布各異。該菌株對原油降解的成分分析結果表明，混合肪酸酸的碳數集中在C2-C20範圍內。這說明該菌株對原油的生物氧化可能從一較為特殊的途徑——次末端氧化(subterminal oxidation)開始(如圖13)。原油中高碳鏈飽和烴首先經次末端氧化生成兩種中碳鏈的脂肪酸，再進行末端氧化和β-氧化。
實施例4、菌株發酵液的分析(1)有機酸的定性分析結果利用6890N/5973N氣-質聯用儀(美國Agilent公司)，FFAP石英毛細管柱(0.25mm×30m)，載氣為高純氦氣，流量1ml/min，汽化室溫度250℃，柱溫採用程序升溫，開始溫度為160℃，速率為2℃/min，最終溫度為180℃，進樣量0.5μl，按照常規方法進行有機酸的定性測定，有機酸標樣的色譜圖如圖14a，在色譜條件下的保留時間如表7所示。
HT樣品的有機酸氣相色譜圖如圖14b。經質譜檢測和與有機酸標樣對照，HT樣品中含有四種有機酸即乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸，有機酸質譜檢測圖如圖15a、15b。15c和15d所示。
表7.有機酸標樣的保留時間乙酸 丙酸 丁酸 異戊酸保留時間(min)2.16 2.50 2.99 3.26(2)有機酸的定量分析結果①水樣蒸餾效果試驗該提取方法(量取預處理後的樣品100ml，置於蒸餾燒瓶中，加7ml磷酸酸化，蒸餾。當蒸餾燒瓶剩下少量溶液時，稍冷，再分兩次各加20ml蒸餾水繼續蒸餾。用NaOH溶液中和餾出液，用酸度計控制PH為8～9。用旋轉蒸發儀濃縮至5ml左右後，將試樣轉入l0ml容量瓶中，用鹽酸酸化至PH≤3，定容，待測有機酸)能充分地提取出各種有機酸，做了蒸餾效果試驗。即各取100ml五份HT發酵液，經上述方法處理進行測定，結果如表8所示表8.有機酸蒸餾效果試驗測定值變異系有機酸 標準偏(五次平均 數mg/L) (％)乙酸24.351.02 4.2丙酸20.410.73 3.6丁酸3.0820.16 5.3異戊酸 1.2690.37 1.6表8表明同一樣品五次測定結果重現性較好，說明採用蒸餾的方法可以充分地將水樣中的低分子量有機酸蒸出。
②HT樣品的有機酸定量分析短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌種在含有K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源為10％原油的培養基中，45℃，分別在120rpm搖床培養5天後的培養液分別做三個平行樣，利用6890N/5973N氣-質聯用儀(美國Agilent公司)，FFAP石英毛細管柱(0.25mm×30m)，載氣為高純氦氣，流量1ml/min，汽化室溫度250℃，柱溫採用程序升溫，開始溫度為160℃，速率為2℃/min，最終溫度為180℃，進樣量0.5μl測定峰值，得到有機酸濃度平均值，結果如表9所示，表明HT樣品中乙酸含量較大，以乙酸為主。
計算公式標樣濃度(mg/L)＝20/50×ρ×1000＝400ρ(ρ為標樣密度，g/ml) 表9.HT樣品中有機酸的定量分析結果濃度標準偏差 變異係數(％) 摩爾濃度(mmol/L)(mg/L)乙酸 574.0 45.3 7.9 9.5667
丙酸 8.318 0.44 5.3 0.1124丁酸 14.68 1.15 7.8 0.1668異戊酸 7.131 0.83 6.1 0.0699總酸量 9.9158mmol/L2、發酵液的有機醇定性和定量分析利用6890N/5973N氣-質聯用儀(美國Agilent公司)，FFAP石英毛細管柱(0.25mm×30m)，載氣為高純氦氣，流量1ml/min，汽化室溫度200℃，柱溫採用程序升溫，開始溫度為80℃，保留1分鐘，速率為4℃/min，最終溫度110℃，進樣量1.0μl，按照常規方法進行有機醇的定性測定，有機醇標樣的色譜圖如圖16a所示，表明在該色譜條件下，四種有機醇分離效果很好；在色譜條件下的保留時間如表10所示。
HT樣品的有機醇氣相色譜圖如圖16b所示。經質譜檢測，HT樣品中只含有乙醇(圖17)。
表10.有機醇標樣的保留時間乙醇 丙醇 丁醇 戊醇保留時間(min) 1.93 2.47 3.51 5.00HT樣品中的乙醇定量結果如表11。其中20μl乙醇定容在50ml容量瓶中，濃度為315.7mg/L，定量分析計算方法同有機酸。
表11.HT樣品乙醇的定量分析結果濃度(mg/L) 標準偏差 變異係數(％)摩爾濃度(mmol/L)乙醇 759.9 28.5 3.8 16.523、生物表面活性劑的鑑定(1)生物表面活性劑的初步鑑定①脂肽類生物表面活性劑的鑑定取短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌種在含有K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源為10％原油的培養基中，45℃，分別在120rpm搖床培養5天後的培養液50ml，用濃鹽酸調PH值至2，4℃靜置過夜，觀察是否有沉澱產生。結果表明該發酵液無沉澱產生，由此證明該發酵液中不含有脂肽類生物表面活性劑。
②紫外吸收鑑定對按常規方法提純後的生物表面活性劑做了紫外吸收測定，它們在紫外範圍內均無吸收。可以初步判斷不含有芳香族化合物。
(2)生物表面活性劑的元素分析對按常規方法提純得到的三種生物表面活性劑進行了C、H、N含量的測定，數據如表12所示表12.生物表面活性劑的元素分析結果C(％) H(％) N(％)HT中提取B1物質 73.06 11.293.50HT中提取B2物質 77.30 15.532.93HT中提取C物質66.33 8.71 2.38表12表明這三種生物表面活性劑N的含量都在3.5％以下，而文獻上報導的胺基酸中N的含量都在10％以上，可見，這三種生物表面活性劑不是胺基酸和脂肽類。並且用茚三酮溶液檢測，沒有出現胺基酸的特徵反應，進一步確定了上述結論。
(3)生物表面活性劑的紅外光譜分析HT樣品提純後得到的B1、B2物質的紅外譜圖分別如圖18a、18b所示，表明2924-2853cm-1、1456cm-1是甲基、亞甲基的C-H振動峰，沒有其它生物表面活性劑的特徵峰。
HT樣品提純後得到的C物質的紅外譜圖如圖18c所示，表明2922-2872cm-1、1455cm-1是甲基、亞甲基的C-H振動峰；在1724cm-1附近的峰為C＝O的伸縮振動；在1103cm-1附近為C-O-C的對稱伸縮振動，表明有酯的存在。在3382cm-1有明顯的O-H的伸縮振動峰，表明化合物中有羥基。
從紫外和紅外譜圖分析，HT樣品提純後得到的C物質為糖脂類表面活性劑。但用對糖類的定性方法即蒽酮試劑法測定，又不顯糖類的特徵反應。因此C物質應是一種新型脂類表面活性劑。
4、HT菌株發酵液的界面張力分析利用德國LAUDA公司生產的滴體積界面張力儀，在45℃動態情況下對短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT菌種在含有K2HPO40.1％，NaH2PO40.2％，(NH4)2SO40.2％，CaCl2·2H2O 0.001％，FeSO4·7H2O 0.001％，酵母0.1％，PH 7.0-7.2，碳源為10％原油的培養基中，45℃，分別在120rpm搖床培養5天後的培養液與原油間界面張力進行了檢測，檢測結果如表13所示，表明HT菌株可以很好的代謝生物表面活性劑。細菌的代謝產物中生物表面活性劑具有親水和疏水基團，在油水界面上定向排列，改善界面活性，降低界面張力。
表13.HT菌株發酵液的界面張力測定數據
權利要求
1.短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT CGMCC № 1142。
2.短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT CGMCC № 1142在採油工程領域中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株降解石油的細菌及其應用。本發明所提供的降解石油的細菌是短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT CGMCC № 1142。實驗證明，短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)HT CGMCC № 1142能有效地改善原油的性質，原油酸值提高14倍以上，輕組份增加，含蠟含膠降低率30－50％，原油流變性變好，油水間界面張力降低，發酵液中有機酸等物質含量增加；其代謝原油途徑為次末端氧化，產生了一種新型脂類表面活性劑。該菌株可廣泛應用於採油工程領域特別是微生物強化採油領域。
文檔編號E21B43/22GK1580240SQ20041003805
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月17日 優先權日2004年5月17日
發明者侯兆偉, 石梅, 楊振宇, 伍曉林, 李蔚, 樂建君 申請人:大慶油田有限責任公司