編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A及其應用的製作方法

2023-05-25 22:29:16

專利名稱：編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因，該基因編碼的蛋白質可用於降解纖維素。
背景技術：
生物質能是由植物的光合作用固定於地球上的太陽能。每年，太陽輻射到地球表面的能量為2. 6 X IO21千焦耳，這個能量大部分通過光合作用以碳源的形式儲藏起來。這個以碳源形式儲藏的能量大大超過了目前人類每年所消耗的2. IXlO17千焦耳的能(DemainA. L，Newcomb M.，Wu J. H.，2005，Cellulase, clostridia，and ethanol. Microbiol. Mol.Biol. Rev.，69 (I) :124-154.)纖維素是世界上儲量最大的生物質，佔地球總生物量的40%。這麼大的生物質來源，可以提供取之不盡的能源供應(Lin Y. , and S. Tanaka, 2006, Ethanol fermentationfrom biomass resources:current state and prospects. Appl.Microbiol.Biotechnol.，69 (3) :627-642.)。而且纖維素是一種廉價的可再生自然資源,每年通過光合作用產生的纖維素高達I. 55X IO9噸，其中有近80%沒有被人類所利用。因此纖維素的利用與轉化對於解決世界能源危機、糧食和飼料短缺、環境汙染等問題具有重要意義。纖維素是由吡喃型-D-葡萄糖通過β -I, 4糖苷鍵連接而成的多聚物，一般由7，000 - 15，000個葡萄糖組成。利用纖維素酶降解纖維素轉化生產的燃料酒精代替石油作為能源可解決世界面臨的能源危機，是可持續發展的戰略(Mielenz J. 2001, Ethanol productionfrom biomass: technology and commercialization status. Current Opinion inBiotechnology, 4:324-329.)。這是備受世界關注的問題。 纖維素的生物降解涉及到一組複合的纖維素酶系，酶系由三種作用方式不同但相互協同作用的酶組成①內切葡聚糖酶(endo-Ι, 4_β -D-glucanase, EC3. 2. I. 4)，這類酶作用於纖維素分子內部的非結晶區，隨機水解β_1，4-糖苷鍵，產生大量的短纖維素鏈。這些纖維素鏈產生了新的末端；②外切葡聚糖酶(exo-1, 4-β-D-glucanase, EC3. 2. I. 91),這類酶作用於纖維素鏈的末端，水解β_1，4糖苷鍵，每次從鏈上切下一個纖維二糖分子；
③β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, EC3. 2. 1.21),這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子，以消除二糖的底物抑制作用。在三類纖維素酶的協同作用下才能降解纖維素(Zverlov V.V. , G. A. Velikodvorskaya, and ff. H. Schwarz, 2002, A newly described cellulosomalcellobiohydrolase,CelO, from Clostridium thermocellum:investigation of theexo-mode of hydrolysis, and binding capacity to crystalline cellulose.Microbiology, 148(1) :247-255.)。其中內切葡聚糖酶優先作用於無定形纖維素，切割β_1，4主鍵，進而由外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶完成徹底降解(Glazer Α. N. ,NikaidoH. , Microbial Biotechnology. New York:ff. H. Freeman and Company,1995.)。
國內外對纖維素酶有近40多年的研究，生產纖維素酶的生物也非常廣泛，絕大部分纖維素酶主要是由微生物發酵而產生，如細菌、真菌(木黴、青黴和麴黴)、放線菌等(Immanuel, R. Dhanusha, P. Prema, et al, 2006, Effect ofdifferent growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteriaisolated from coir retting effluents of estuarine environment. InternationalJournal of Environmental Science and Technology,3:25 - 34.),目前石開究最清楚的是裡氏木黴(Shin CS, Lee JP, Lee JS, et al，2000，Enzyme production ofTrichoderma reesei Rut C—30 on various lignocellulosic substrates. AppliedBiochemistry and Biotechnology,84/86:237245.)。除此之外，部分動物體內也可以產生纖維素酶，如牛的胃、木蠹蛾的唾液和蝸牛的胃液等都含有豐富的纖維素酶(DuanCJj Feng JX.，2010，Mining metagenomes for novel cellulase genes. BiotechnolLett. 32(12) :1765-75. ) 目前，纖維素酶已經被廣泛地應用於多個領域，主要有食品、釀酒、環保、飼料加工、紡織、農業、日化等方面。在水果和蔬菜加工中由於植物細胞壁的主要成分是果膠、纖維素和半纖維素等，因此，在水果與蔬菜加工的過程中適當使用纖維素酶，可將纖維素水解成葡萄糖等有效成分。另一方面，還可使植物細胞壁發生不同程度變化，如軟化、膨脹、崩潰等，提高果蔬的可消化性，並使其口感更好；在白酒及其酒精生產中以纖維素為原料發酵生產酒精，使用的是二段法，即先用纖維素酶將纖維素糖化，再經酵母發酵成酒精；在茶葉加工中用酶法低溫抽提，即先用纖維素酶將茶葉的細胞壁裂解抽提其中的有效成分，最後將含有有效成分的抽提液濃縮乾燥便可製成可溶性茶。與傳統的熱浸提法相比，此方法可提 高有效成分的得率，同時還可保持茶葉原有的色香味；在活性物質的提取中，如澱粉、蛋白質、活性多糖等物質的提取過程中，加入纖維素酶能大幅提高產品的收率(杜翠嬌，任河，杜建敏等，2011，纖維素酶及其應用，食品工程，2 6-7.)以內切葡聚糖酶為關鍵詞查找國家知識產權局專利檢索資料庫，共出現69項發明專利。其中有23項發明專利是描述編碼內切葡聚糖酶的基因及其應用，而其他46項是與內切葡聚糖酶在各種領域上的應用有關。在這23項與編碼內切葡聚糖酶的基因及其應用相關的發明專利中的內切葡聚糖酶基因分別來自於各種細菌、黴菌、未培養微生物或人工合成的，在這23項專利中還沒有一個內切葡聚糖酶基因是來自於鏈黴菌的。

發明內容
本發明從廣西南寧篩選到的鏈黴菌GX6的基因組中克隆到一個編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因，在大腸桿菌宿主細胞中表達該基因生產內切葡聚糖酶，並能以纖維素為原料降解生成葡萄寡糖。本發明涉及一個編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。是從鏈黴菌GX6的基因組中克隆得到。該內切葡聚糖酶基因Cel5A的序列是由1605個鹼基組成，含有完整的內切葡聚糖酶基因Cel5A的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF), Cel5A基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。SEQ ID NO :2的蛋白質是基因Cel5A編碼的內切葡聚糖酶產物Cel5A，由535個胺基酸組成，和Cel5A催化功能域同源性最高的是與Streptomyces sp. el4 (鏈黴菌el4)的endoglucanase El (內切葡萄糖苷酶El)，兩者的一致性=411/473 (87%)、相似性=435/473 (92%)。基因Cel5A在大腸桿菌中表達的重組產物Cel5A能夠分解纖維素。本發明還涉及含有本發明基因的表達載體，及用於轉化本發明基因的宿主。本發明提供了一個編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因，該基因所編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶在分解纖維素的用途。


圖I是篩選含有內切葡聚糖酶基因Cel5A重組 菌株的CMC選擇平板圖。圖2是內切葡聚糖酶Cel5A的SDS-PAGE圖。從圖I 了解到，含有內切葡聚糖酶基因Cel5A的重組菌株能夠在CMC選擇選平板上形成透明圈。從圖2 了解到，內切葡聚糖酶Cel5A純化物的分子量為56kDa。
具體實施例方式下述實施方法是為了更好的解釋本發明，而不應該被解釋為限制本發明的目的。在本發明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系XLl-blue，購自TaKaRa公司，表達載體pQE30和表達宿主M15，購自Qiagen公司，CMC(carboxylmethylcellulose,羧甲基纖維素鈉，購自Sigma公司以及購自TaKaRa、MBI的限制性內切酶、修飾酶等試劑。下面將通過實施例對本發明作詳細描述I)鏈黴菌Streptomyces GX6基因組DNA的提取鏈黴菌Sti^ptomyces GX6的基因組DNA是按照BioFlux公司的細菌基因組DNA提取試劑盒 Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目錄號 BSC12S1)的使用說明來提取的。將提取好的鏈黴菌Sti^ptomyces GX6的基因組DNA送華大基因公司測定基因組序列。2)鏈黴菌Sti^ptomyces GX6的基因組序列中編碼內切葡聚糖基因序列的分析將獲得的鏈黴菌Streptomyces GX6的基因組序列用NCBI (National Centerfor Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. rov)上的軟體 ORFfinder (http://www. ncbi. nlm. nih. Rov/Rorf/orfiR. cri)和Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進行分析。結果共獲得 3 個與內切葡聚糖酶具有較高同源性的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF),本發明只涉及其中一個0RF。3)編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A的核苷酸序列分析基因Cel5A的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)由1605個核苷酸組成,序列如SEQ ID NO :1。其中，Cel5A基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。4)編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A編碼的產物Cel5A的胺基酸序列分析
內切葡聚糖酶基因Cel5A編碼一個含534個胺基酸的蛋白質，用DNAStar軟體預測該蛋白質的理論分子量大小為55966. 20道爾頓。用簡單組件結構研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析內切葡聚糖酶 Cel5A 的組件結構，結果是自N端的I 一 34位胺基酸殘基是信號肽序列，73 - 390位胺基酸殘基為糖基水解酶家族5 (glycosyl hydrolase)的纖維素酶功能域和438 — 531位胺基酸殘基為碳水化合物結合功能域。5)編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A的克隆和表達使用上遊引物5 』 -ATAGGATCCGCCGGGGCCACCACCGCAGCGCCCG-3 』和下遊引物 5 』 -ATCAAGCTTTCAGCTCGCGGTGCAGCTCACGCTC-3，，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增內切葡聚糖酶基因Cel5A，用限制性內切酶BamHI和HindIII酶切內切葡聚糖酶基因Cel5A後，與經BamHI和HindIII酶切的表達載體PQE30進行連接。再將連接產物用CaCl2法轉化到大腸桿菌 XLl-blue中，塗布到含100μ g/mL氨苄青黴素的LA平板上。轉化得到的單菌落點板至含有100 μ g/mL氨苄青黴素和0. 5% (ff/V) CMC (羧甲基纖維素鈉)的LA平板上，將平板置於37°C恆溫箱培養6小時，對每個轉點菌落逐個滴加I μ 11% (W/V)的IPTG誘導表達，然後將平板置於37°C恆溫箱繼續培養6小時。時間到後，進行氯仿燻蒸破胞，再把平板置於37°C恆溫箱使表達的Cel5A酶與CMC反應5小時。用0. 1%的剛果紅溶液染色15分鐘後，再用IM的NaCl溶液脫色。觀察選擇平板。然後進一步提取在選擇平板上能形成透明圈的克隆子的質粒DNA，並將其命名為pQE-Ce15A,用限制性內切酶BamHI和Hindi 11完全酶切pQE_Cel5A後，進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果pQE-Cel5A除有一個約3. 4kb的DNA片段外，還有一條大小約為I. 6kb的DNA片段。將質粒pQE_Cel5A用CaCl2法轉化入大腸桿菌表達宿主M15，塗布到含100 μ g/mL氨苄青黴素和25 μ g/mL卡那黴素的LA平板上。挑取轉化得到的單菌落接種到含100 μ g/mL氨苄青黴素和25 μ g/mL卡那黴素的LB培養基中，37°C振蕩培養，待0D600為0. 4時，力口入IPTG使其終濃度為0. 5mmol/L，2(TC、180轉誘導22小時。IlOOOrpm離心3min，收集菌體，用4mL pH7. 0100mmol/L的磷酸緩衝液重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000rpm離心20min,取上清進行後面的蛋白質純化。按每4mL上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL衝洗緩衝液(50mmol/LNaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH8. 0)到柱子裡，緩慢攪拌，收集流出物。重複衝洗步驟 4 次。加入洗脫緩衝液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8. 0)洗脫蛋白質。收集洗脫的蛋白質溶液，用變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證，發現有目的大小的蛋白質條帶。6)編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶Cel5A酶活力的測定取2 μ I內切葡聚糖酶Cel5A的純化物，加入250 μ 11OOmmoI/L的ρΗ7. O磷酸緩衝液，與250 μ 12% CMC溶液混合，在37°C作用10分鐘後，加入1000 μ I DNS溶液，放置沸水中反應5分鐘，室溫冷卻，用分光光度計測吸光度0D53(i。吸光度測定值與不同含量的葡萄糖吸光度標準曲線圖作比較計算酶活。所述DNS試劑配製稱取I克NaOH用約40mL ddH20溶解，再稱取I克二硝基水楊酸、0. 2克苯酚、0. 05克無水亞硫酸鈉、20克四水酒石酸鉀鈉，將其溶解於約30mLddH20中，兩種溶液混合，定容到lOOmL。內切葡聚糖酶的酶活力單位(IU)定義為每分鐘催化產生Iymol還原糖所需的酶量。內切葡聚糖酶的比活力的定義每mg蛋白質所含的酶活力(U/mg)。內切葡聚糖酶 Cel5A的水解CMC比活力為34. 56U/mg。
權利要求
1.一個編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A，其特徵在於，其核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
2.權利要求I的基因所編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.—種表達載體,其特徵在於,它含有權利要求I所述的基因。
4.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求3所述表達載體轉化的原核細胞或真核細胞。
5.權利要求2所述的蛋白質在降解纖維素中的應用。
全文摘要
一個編碼糖基水解酶家族5的內切葡聚糖酶基因Cel5A及其應用,含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，上述基因編碼的內切葡聚糖酶Cel5A，含有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，以及該酶在分解纖維素中的應用。
文檔編號C12N1/15GK102888417SQ20121041839
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月27日 優先權日2012年10月27日
發明者龐浩, 黃日波, 韋宇拓, 杜麗琴, 韋航, 裴建新 申請人:廣西科學院