一株粘液真桿菌及其應用的製作方法

2023-05-25 22:13:06

一株粘液真桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株粘液真桿菌及其應用。本發明所提供的粘液真桿菌具體為粘液真桿菌（Eubacterium?limosum）ZL-II，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?No.6846；本發明所提供的應用具體為所述粘液真桿菌（Eubacterium?limosum）ZL-II?CGMCC?No.6846在生產腸二醇中的應用。本發明所提供的粘液真桿菌（Eubacterium?limosum）ZL-II?CGMCC?No.6846在生物轉化天然產物製備植物雌激素類成分腸二醇中具有重要應用，本發明所提供的生產腸二醇的工藝簡單、生產成本低、無環境汙染，適宜於大規模生產，具有重要的經濟效益。
【專利說明】一株粘液真桿菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株粘液真桿菌及其應用，特別涉及一株粘液真桿菌及其在生產腸二醇中的應用。
【背景技術】
[0002]近年來植物雌激素類物質因其廣泛的生理、藥理學作用已引起廣泛關注。腸二醇(enterodiol, END)是國際公認的植物雌激素，具有類雌激素和抗雌激素雙向調節作用，以及抑制腫瘤、抗氧化、預防和治療心血管疾病等多方面藥理活性。
[0003]腸二醇主要存在於哺乳動物體內，亦被稱為哺乳動物木脂素。目前獲得腸二醇的主要途徑為化學合成方法，但化學合成法成本較高，且汙染環境。研究結果表明人體腸道菌群能夠轉化植物中的多種木脂素類成分而生成為腸二醇，常見的木脂素類成分包括開環異落葉松樹脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside, SDG)>開環異落葉松樹月旨(secoisoIariciresinoI, SECO)>羅漢松月旨酌'(matairesinol,MAT)、落葉松樹脂醇(lariciresinol, LCS)> 松脂醇(pinoresinol, PRS)> 松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinoldiglucoside, PDG)> 丁香樹月旨酌'(syringaresinol, SYG)> 牛蒡苷兀(arctigenin, ATG)>7-羥基羅漢松脂酌O-1iydroxymatariresinol, HYM)> 牛蒡子苷(arctiin, ARC)、芝麻脂素(sesamin)。富含 此類成分的主要植物資源有亞麻籽(flaxseed)、牛蒡子(ArctiiFructus)、海藻(seaweed)、油菜子(rapeseed)、黑小麥(triticale)、大豆(soybean)、燕麥(oat bran)、玉米糠(corn bran)、麩皮等。
[0004]亞麻籽被認為是含有腸二醇前體物質最豐富的植物資源，榨油後的殘渣(亞麻籽柏)中SDG的含量可達到12~24mg/g。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一株粘液真桿菌及其應用。
[0006]本發明所提供的粘液真桿菌是人體腸道活性菌，自中國人體的腸道內容物中分離得到，具體為粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1I,該菌株已於2012年11月20日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.6846。
[0007]本發明的另一個目的是提供一種生產腸二醇的菌劑。
[0008]本發明所提供的生產腸二醇的菌劑的活性成分為上述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1CGMCCN0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
[0009]所述生產腸二醇的菌劑中的三株菌可分別獨立包裝，使用時混合；也可以混合包裝。
[0010]上述菌劑在生產腸二醇(END)中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0011]所述應用中，可以下述物質中的至少一種作為底物:開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷、開環異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素；亞麻籽、牛蒡子、海藻、油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩。其中前11種物質為11種化學成分，後9種物質來自於9種植物。在實際應用中，根據需要對所述後9種物質進行適當的加工，如研磨粉碎獲得粗粉，從而利於反應的進行，使反應更加充分。
[0012]在本發明的一個實施例中，所述9種物質經研磨粉碎後獲得粗粉粒徑為200 μ m~1000 μ m。[0013]在所述應用中，具體為以上述三株菌的活性混合菌液進行底物轉化反應獲得腸二醇。所述活性混合菌液可由所述三株菌的混合菌液進行増菌獲得，也可由所述三株菌分別單獨増菌後再混合而獲得。所述増菌條件為25~40°C厭氧培養10-36小時。
[0014]本發明的又一個目的是提供一種活性成分為所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 的菌劑。
[0015]本發明還保護所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 或所述活性成分為所述粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I CGMCC N0.6846的菌劑在脫甲基中的應用。
[0016]在本發明中，所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum)ZL_II CGMCC N0.6846在脫甲基中的應用具體體現在將開環異落葉松樹脂酚(SECO)經所述脫甲基後轉化為4，4' -二羥基腸二醇(4，4' -dihydroxyenterodiol, DHEND)。
[0017]所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 或所述活性成分為所述粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1I CGMCC N0.6846 的菌劑在生產 4，4' -二羥基腸二醇中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0018]在上述應用中，可以開環異落葉松樹脂酚作為底物。
[0019]在本發明上述所有的應用中，均採用厭氧培養的方式進行菌液培養，從而轉化底物。
[0020]所述厭氧培養的溫度可為25~40°C。在本發明的實施例中，具體為37°C。
[0021]為了使產物如腸二醇的產量達到峰值，通常需要在上述培養條件下培養:1-10天時間。
[0022]本發明的還一個目的是提供一種生產腸二醇的方法。
[0023]本發明所提供的生產腸二醇的方法具體依次包括如下步驟:
[0024](I)將菌體含量均為5~9X 107cfu/mL的粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1ICGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847三株菌的菌液按照體積比1:1:1的比例混合，得到混合菌液；
[0025](2)取步驟(1)中得到的混合菌液，按照體積比1:10的比例接種到厭氧液體培養基中，37°C厭氧培養24h，得到増菌液；
[0026](3)將步驟(2)獲得的増菌液，按照體積比1:10的比例接種到發酵培養基中，同時向培養體系中加入如下(al)_ (a4)中任一底物，37°C厭氧培養3~10天(如8天)，從培養液中獲得腸二醇:
[0027](al)終濃度為 2(T40mg/mL (如 20mg/mL 或 40mg/mL)的亞麻籽柏；[0028](a2)終濃度為0.5mg/mL的開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷；
[0029](a3)終濃度為30mg/mL的底物A ;所述底物A為如下中的至少一種:牛蒡子、海藻、
油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩；
[0030](a4)終濃度為0.5g/mL的底物B ;所述底物B為如下中的至少一種:開環異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素。
[0031]在上述方法中，所述厭氧液體培養基由蛋白腖、酵母粉、大豆粉、牛肉粉、葡萄糖、氯化鈉、可溶性澱粉、半胱氨酸、磷酸二氫鉀、氯化血紅素、維生素Kl和水按照15.0g:5.0g:
5.0g:5.0g:5.0g:5.0g:3.0g:0.5g:2.5g:0.005g:0.0Olg:1L 的比例混合配製而成，pH7.3±0.2。
[0032]所述庖肉培養基由蛋白腖、牛肉粉、酵母粉、NaH2PO4、葡萄糖、可溶性澱粉和水按照30.0g:5.0g:5.0g:5.0g:3.0g:2.0g:1L 的比例混合配製而成，pH 7.8。
[0033]當步驟(3)中為(al)所述底物時，步驟(1)中所述發酵培養基具體為無碳源培養基；所述無碳源培養基由NaCl、NH4Cl, PBS和水按照3.0g:1.0g:100mL:900mL的比例混合配製而成，pH 6.4 ;所述PBS由KH2PO4' K2HPO4和水按照26.0g:18.5g:1L的比例混合配製而成。當步驟(3)中為(a2)_ (a4)所述底物時，步驟(1)中所述發酵培養基具體為庖肉培養基或厭氧液體培養基。
[0034]本發明還涉 及一種分離純化發酵液中腸二醇的方法。厭氧培養:TlO天后，離心取上清液，用大孔樹脂色譜柱進行分離純化，採用乙醇-水溶液或甲醇-水進行梯度洗脫，收集含有腸二醇的洗脫液，減壓濃縮乾燥，得到腸二醇；所述大孔樹脂色譜柱具體可為XAD-2大孔樹脂或DlOl大孔樹脂。
[0035]本發明所提供的粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 在生物轉化天然產物製備植物雌激素類成分腸二醇中具有重要應用。本發明所提供的生產腸二醇的工藝簡單、生產成本低、無環境汙染，適宜於大規模生產，具有重要的經濟效益。
[0036]保藏說明
[0037]分類命名:粘液真桿菌
[0038]拉丁名:(Eubacteriumlimosum)
[0039]參椐的生物材料:ZL-1I
[0040]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0041]保藏機構簡稱:CGMCC
[0042]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0043]保藏日期:2012年11月20日
[0044]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.6846
[0045]分類命名:遲緩埃格特菌
[0046]拉丁名:(Eggerthellalenta)
[0047]參椐的生物材料:ZL-1II
[0048]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0049]保藏機構簡稱:CGMCC
[0050]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號[0051]保藏日期:2012年11月20日
[0052]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.6847
[0053]分類命名:單形擬桿菌
[0054]拉丁名:(Bacteroidesuniformis)
[0055]參椐的生物材料:Strain-1
[0056]保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0057]保藏機構簡稱:CGMCC
[0058]地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號
[0059]保藏日期:2011年5月25日
[0060]保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.4897
【專利附圖】

【附圖說明】
[0061]圖1為ZL-1I菌株的16S rRNA基因序列同源性分析及鑑定結果。其中，StrainZL-1I菌株即表示ZL-1I菌株。
[0062]圖2為三株菌 的不同接種方式轉化亞麻籽柏產生腸二醇(END)的結果比較圖。其中，「單獨接菌」表示三株菌單獨増菌24h再混合後接種；「混合接菌」表示三株菌混合後増菌24h再接種。
[0063]圖3為以開環異落葉松樹脂酌.二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside, SDG)為底物的三株菌隨機組合培養48h的HPLC色譜圖。其中，Strain I表示單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 ；Strain ZL-1I 表不粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 ；Strain ZL-1II 表不遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
[0064]圖4為三株菌在開環異落葉松樹脂酹二葡萄糖苷(secoisolariciresinoldiglucoside，SDG)轉化產生不同產物(SEC0，DHEND, END)過程中的作用。其中，Strain I表示單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 ；Strain ZL-1I 表不粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I CGMCC N0.6846 ；Strain ZL-1II 表不遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
【具體實施方式】
[0065]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0066]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0067]下述實施例中所涉及的培養基如下:
[0068]厭氧液體培養基(購自北京陸橋技術有限責任公司，產品目錄號CM1513)。成分(g/L):蛋白腖15.0 ;酵母粉5.0 ;大豆粉5.0 ;牛肉粉5.0 ;葡萄糖5.0 ;氯化鈉5.0 ;可溶性澱粉3.0 ;半胱氨酸0.5 ;磷酸二氫鉀2.5 ;氯化血紅素0.005 ;維生素K10.001, pH
7.3±0.2。
[0069]庖肉培養基:稱取32g庖肉培養基基礎(購自北京陸橋技術有限責任公司，產品目錄號CM605)溶於1.0L蒸餾水中，搖勻，加石蠟油覆蓋，121° C高壓滅菌20min待用。所製得的庖肉培養基(IL)中含有如下組分:蛋白腖(30.0g)，牛肉粉(5.0g)，酵母粉(5.0g)，NaH2PO4 (5.0g)，葡萄糖(3.0g)，可溶性澱粉(2.0g)，pH 7.8。
[0070]無碳源培養基=NaCl(3.0g), NH4Cl(LOg), PBS (IOOmL)，去離子水 900 (mL)，pH
6.4。使用前分裝於IOmL連蓋塑料離心管，每管5mL ;表面覆蓋ImL液體石蠟；121°C高壓蒸汽滅菌 20min ;室溫放置備用。PBS =KH2PO4 (26.0g)，K2HPO4 (18.5g)，去離子水(IL)。
[0071]下述實施例中，所涉及的化合物標準品信息如下:
[0072]開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(Sigma Aldrich，N0.S0202)、開環異落葉松樹月旨酌'(Sigma Aldrich, N0.60372)、羅漢松月旨釀(Sigma Aldrich, N0.04157)、落葉松樹月旨酉享(Sigma Aldrich, N0.06892)、松月旨酉享(Sigma Aldrich, N0.40674)、松脂醇二葡萄糖苷(Sigma Aldrich, N0.10789)、丁香樹月旨釀(Sigma Aldrich, N0.6288)、牛蒡苷兀(SigmaAldrich, N0.1777)、7-羥基羅漢松脂酚(Sigma Aldrich, N0.42945)、牛蒡子苷(Sigma Aldrich, N0.sc-202064)、芝麻脂素(Sigma Aldrich, N0.S9314);腸二醇(SigmaAldrich, N0.45198)。
[0073]下述實施例中所涉及的樣本中腸二醇(END)、4，4' - 二羥基腸二醇(DHEND)和開環異落葉松樹脂酚(SECO)的HPLC檢測方法如下:
[0074]取200 μ L培養液,加入400 μ L水飽和正丁醇萃取,4800rpm/min離心10min,取上清液320 μ L於離心管中，氮氣吹乾,加入200 μ L色譜甲醇，10000rpm/min離心3min,取上清液 20 μ L 進 HPLC 檢測。色譜柱:Zorbax SB-C18 (4.6_ X 25cm, 5 μ m,美國 Agilent 公司);保護柱 Zorbax SB-C18 (4.6mmX 12.5mm, 5 μ m,美國 Agilent 公司);流動相:水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫:(T30min (A:B體積比由100:0線性梯度變化至50:50)，3(T40min (A:B體積比由50:50線性梯度變化至0:100);流速1.0mL/min ;檢測波長280nm ;溫度25。。。
[0075]下述實施例中將涉及到腸二醇的含量測定，腸二醇的標準曲線為:
[0076]精密稱定2.08mg腸二醇對照品，加入IOmL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，配成208.0 μ g/mL對照品母液。將對照品母液逐級稀釋，分別得到濃度為208.(Tl.30 μ g/mL的對照品溶液。吸取上述溶液分別進樣20 μ L，進行HPLC分析。以腸二醇峰面積(Y)對腸二醇進樣量(X，mg/mL)進行回歸計算，得回歸方程:Y=9668X+13.17(R2=0.9990)，線性範圍為
1.30~208.0 μ g/mL。定量限(S/N=10)為 1.3 μ g/mL ;檢測限(S/N=3)為 0.33 μ g/mL。
[0077]實施例1、粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I的分離與鑑定
[0078]一、粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I 的分離
[0079]採集新鮮人或小鼠糞便標本，經庖肉培養基增菌，得到腸道菌群樣本，接種到5mL無碳源培養基中，加入底物亞麻籽柏(粒徑為200μm-1000μm) lOOmg，37°C厭氧培養48h。取IOyL無碳源培養基菌液，10倍梯度稀釋。取10 —6倍稀釋液塗平板，37°C厭氧培養24h。挑取其中的單菌落，接種到5mL無碳源培養基中，加入底物亞麻籽柏(粒徑為200 μ m-1000 μ m) IOOmg,培養2天後進行HPLC檢測，篩選可以產生腸二醇的單菌落。取10 μ L活性菌的菌液加入庖肉液體培養基增菌，10_5倍稀釋液塗平板，厭氧培養48h後觀察，有白色且較大(Strain-1)、黃色(ZL-1I)和透明且較小(ZL-1II)三種不同顏色和形態的菌落。
[0080]二、粘液真桿菌(Eubacterium limosum) ZL-1I 的鑑定
[0081]1、細菌基因組DNA提取
[0082]取ZL-1I菌種0.5mL接種到厭氧液體培養基5mL培養20h，取ImL菌液進行基因組DNA提取。細菌基因組提取使用試劑盒(天根公司，目錄號DP209)，按照試劑盒說明書操作，得到120 μ L基因組提取液。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，證實細菌基因組DNA提取成功。
[0083]2、16S rRNA擴增及測序
[0084]⑴引物設計:採用腸道菌通用引物，由上海生工公司合成。
[0085]正向引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
[0086]反向引物:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
[0087](2) PCR反應體系:見表1。
[0088]表1.PCR擴增反應體系(50 μ L )
【權利要求】
1.一株粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1I,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.6847。
2.生產腸二醇的菌劑，其活性成分為權利要求1所述的粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1I CGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1CGMCCN0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847。
3.權利要求2所述的菌劑在生產腸二醇中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於:所述應用中，以下述物質中的至少一種作為底物:開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷、開環異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素、亞麻籽、牛蒡子、海藻、油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩。
5.活性成分為權利要求1所述粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum) ZL-1ICGMCCN0.6846 的菌劑。
6.權利要求1所述的粘液真桿菌(Eubacteriumlimosum)ZL-1I CGMCC N0.6846或權利要求5所述的菌劑在如下(a)或(b)中的應用: (a)脫甲基； (10生產4，4' -二羥基腸二醇。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於:所述應用中作為底物的是開環異落葉松樹脂酚。
8.根據權利要求3、4、6和7中任一所述的應用，其特徵在於:所述應用中，採用厭氧培養的方式進行培養，實現底`物的轉化。
9.根據權利要求8所述的應用，其特徵在於:所述厭氧培養的溫度為25-40°C。
10.生產腸二醇的方法，依次包括如下步驟: (1)將菌體含量均為5~9X107cfu/mL的粘液真桿菌(Eubacterium limosum)ZL-1ICGMCC N0.6846、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis) Strain-1 CGMCC N0.4897 和遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta) ZL-1II CGMCC N0.6847三株菌的菌液按照體積比1:1:1的比例混合，得到混合菌液； (2)取步驟(1)中得到的混合菌液，按照體積比1:10的比例接種到厭氧液體培養基中，37°C厭氧培養24h，得到増菌液； (3)取步驟(2)中的所述増菌液，按照體積比1:10的比例接種到發酵培養基中，同時向培養體系中加入如下(al)_ (a4)中任一底物，37°C厭氧培養:TlO天，從培養液中獲得腸二醇: (al)終濃度為2(T40mg/mL的亞麻籽柏； (a2)終濃度為0.5mg/mL的開環異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷； (a3)終濃度為30mg/mL的底物A ;所述底物A為如下中的至少一種:牛蒡子、海藻、油菜子、燕麥麩、黑麥麩、小麥麩、大麥麩和玉米麩； (a4)終濃度為0.5g/mL的底物B ;所述底物B為如下中的至少一種:開環異落葉松樹脂酚、羅漢松脂酚、落葉松樹脂醇、松脂醇、松脂醇二葡萄糖苷、丁香樹脂酚、牛蒡苷元、7-羥基羅漢松脂酚、牛蒡子苷、芝麻脂素。
【文檔編號】C12P7/22GK103865822SQ201210532248
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優先權日:2012年12月11日
【發明者】楊東輝, 劉樹林, 朱紅雲, 李淼鑫 申請人:北京大學