一種基於昆蟲防禦素的構象型肽庫、其構建方法和應用的製作方法

2023-05-25 14:08:21 1

專利名稱：一種基於昆蟲防禦素的構象型肽庫、其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型構象型肽庫，具體涉及以昆蟲防禦素C末端的一段區域為骨架蛋白，並在此基礎上構建的新型構象型肽庫。本發明還涉及此肽庫的構建方法及在多肽配體篩選中的應用。
目前用於篩選的噬菌體肽庫以線性肽庫為主，它是將線性多肽的基因融合到噬菌體pIII或pVIII蛋白的N端，將短肽以全價展示的方式呈現於噬菌體的表面。因為序列和空間結構限制，線性肽庫在實際操作中遇到一些問題首先因為全價展示的方式可容納的片段大小有限(＜38胺基酸)，不利於在長度上增加肽庫的複雜性；其次全價展示本身因為展示的價位較高也不利於篩選到高親和力的配基；最主要的是展示的線性肽其構象通常認為是自由的和可變化的。這種構象的變化性一方面增加了從中篩選到某種特定靶分子特異性配基的可能性。同時，也會因構象的無限制性而增加不利於多肽與靶分子結合的因素進而影響多肽的篩選。因此目前很多研究策略是希望通過對構象的限制獲得更高親和力的克隆，比如通過在線性肽兩端引入半胱氨酸使形成環肽，或在骨架蛋白基礎上引入隨機區，賦予隨機肽一定的精細構象等。構象型肽庫的概念因此孕育而生，受到人們的廣泛關注(ladner RC R Trends Biotechnol1995，13426-430)。
以天然蛋白作為限制其結構的骨架，並在此基礎上利用組合肽庫技術進行分子改構引入多樣性，是構建構象型肽庫的首選方法。目前，已有一些蛋白被開發利用為構建組合文庫的骨架蛋白，大體上可分為四類環肽，免疫蛋白樣的蛋白骨架，細菌受體，DNA-結合蛋白。這些蛋白本身具有不同的拓撲結構，隨機區位於不同形態的突出表面。並已在靶分子高親和力配基的篩選研究中得到成功的運用。
昆蟲防禦素的結構如

圖1所示，由40個胺基酸組成，一級序列為ATCDLLSGTG INHSACAAHC LIRGNRNNYC NGKGVCVCRN，其三級結構中包含有三個二級結構單元，其中第15到23位點形成一個α螺旋，26到30位點及34到40位點之間分別形成兩個B片層，這三個結構域由兩個環區連接分別是23-26位點與32-34位點。分子內部有六個半胱氨酸，形成三個二硫鍵。該分子分子量較小，三維結構簡單而且穩定，有穩定的二級結構域，間隔的環區有利於引入多樣性。因此該蛋白作為構建肽庫的骨架蛋白已非常適合。為便於今後應用，我們對該蛋白進行了優化。並使用insight II Homology系統進行改造後分子的計算機模建，用於預測改造後分子的摺疊情況。
改造的內容分以下幾個方面一、分子截短。昆蟲防禦素分子的結構域集中於分子的C末端，而N末端的11個胺基酸不參與結構的形成以游離末端的形式存在，但同時卻增大了分子量。因此我們將N末端的11個胺基酸截取。分子大小改變為29個胺基酸。二、鹼性胺基酸的替換。抗菌肽本身有抑菌活性，並且已明確其抑菌活性和分子內部的鹼性胺基酸有直接關係。因此，我們將鹼性胺基酸在不影響蛋白本身三維結構的基礎上替換成別的胺基酸。從N末端依次為13位與第19位的組氨酸，均替換為異亮氨酸；30位的半胱氨酸替換成丙氨酸；39位的精氨酸替換成蘇氨酸。改造後分子的一級序列為NISACAAICL IRGNRNNYAN GKGVCVCTN。將改造後的肽進行分子模建，改造後分子的模建結果顯示，分子可正確摺疊，並保持原有的三維結構。只是因為分子截短，缺少一個二硫鍵，蛋白分子摺疊更緊密。這並不影響蛋白的作為骨架蛋白的結構的穩定性。
本發明的構象型肽庫可以通過以下技術方案進行構建。
1.簡併寡核苷酸的設計首先根據三個核苷酸編碼一個胺基酸的簡併原理採用NNK(K代表等量的G或T)以降低密碼子的偏性和終止密碼子的數目。這樣只有一個琥珀型密碼子TAG外，12個胺基酸各有一個密碼子，5個胺基酸各有兩個密碼子，3個胺基酸各有三個密碼子。當文庫在琥珀終止密碼抑制型的菌株中表達時，TAG編碼穀氨酸。由於編碼不同胺基酸的個數不同，在這樣的隨機肽庫中，某些胺基酸出現的頻率要比其他的胺基酸高。這是不可避免的。但採用這種方法，已使得胺基酸的分布儘量的均衡。
2.化學合成法獲得骨架蛋白的基因合成的單鏈DNA必須轉變成雙鏈DNA才能被克隆載體上。合成的隨機序列的兩端要帶有酶切位點。克隆的策略與引物序列如圖2所示。
3.將基因克隆入pCANTAB 5E載體本發明的肽庫是通過使用pCANTAB 5E載體(Amersham PharmaciaBiotech，Quarry Bay，Hong Kong)，不限於此載體，而展示在絲狀噬菌體M13表面。將片段退火補平形成具有平滑末端的雙鏈，經過Sfi I與Not I的雙酶切，將其插入pCANTAB 5E表達載體。並通過電轉化的方法將重組子導入到宿主菌內獲得初級文庫。
4.基因的表達考慮到該庫的構建目的是為篩選到高親和力的克隆，我們採用了3+3型載體進行構建，該庫噬菌體的包裝過程，也就是基因的表達需要藉助輔助噬菌體如M13K07的超感染。經鑑定，該文庫的庫容量為8.3×108cfu。並通過測序對肽庫的胺基酸偏性進行分析，結果證明，該肽庫有一定的多樣性適合用於篩選。
腫瘤壞死因子受體(TNFR1)肽配基的篩選、骨形態發生蛋白單抗(McAbBMP-2)抗原表位的篩選和腫瘤壞死因子(TNFα)結合肽的篩選等實驗表明，本發明的構象型肽庫可用於篩選生物大分子的肽類配基。
我們運用親和篩選的方法以TNFR1為靶對該構象型肽庫進行篩選。五輪以後P/N達到34。對最終輪次中挑選的噬菌體單克隆進行親合活性與競爭抑制活性的檢測。陽性率高。陽性克隆測序證明該親和肽有明顯的序列特徵。以McAbBMP-2為靶篩選抗原表位。篩選四輪後P/N值為45，以TNFα為靶進行篩選陽性噬菌體也明顯得到富集。
本發明具有以下優點一、因為構象的確定性減小了分子結合過程中因構象改變而損失的熵，同時結構限制使疏水位點在適當的情況下可暴露於骨架蛋白的表面，增加篩選到高活性配基的可能性。有利於篩選到有較高親和力的克隆。二、這種活性源於骨架蛋白的正確摺疊產生的構象，相對穩定。即使當與其它蛋白或結構域融合表達時也較易於維持，可以通過重組蛋白表達的方法產生，方法較為簡單方便。三、由於其保持了初始蛋白的三維結構易於對結合肽的構象進行分類，便於應用計算機對多肽的構象進行預測，那麼從原子水平揭示分子間的相互作用將更為簡化，從而為設計能夠模擬靶分子多肽配基的小分子模擬肽奠定基礎。
圖3為以TNFR1為靶的篩選噬菌體的富集結果圖4為以McAbBMP-2為靶的篩選抗原表位噬菌體的富集結果圖5為以TNFα為靶的篩選結合肽的噬菌體富集結果實施例1、對昆蟲防禦素分子進行改造1，通過英特網下載昆蟲防禦素分子構象分析資料(網址www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/3d，其PDB號為1LFC，並用RasMol動態觀察昆蟲防禦素分子的結構。可以看到該分子有三個穩定的結構域，環區是進化中的高變區域，若插入外源片段對蛋白本身的結構影響不大。
2，分子的結構改造，以儘量不影響骨架蛋白的天然構象為前提，遵循二級結構正確形成對胺基酸組成和排列的要求進行如為了維持β-片層結構，應儘量使極性胺基酸與非極性胺基酸間隔的排列方式等。對改造後的分子使用insightII Homology系統進行模建。結果提示從理論上推測改造後的分子結構基本保持不變。
實施例2、pCANTAB 5E-1lfc的構建1，寡聚核苷酸的設計與合成。隨機區採用NNK(T/G)的簡併寡核苷酸的設計，骨架部分根據骨架蛋白的胺基酸序列將其依照大腸桿菌偏愛的密碼子翻譯成核酸序列，並在兩端加入酶切位點及保護鹼基。化學合成法獲得兩條寡核苷酸鏈。
2，肽庫基因的獲得。分為兩步1，退火，反應體系為等摩爾兩條核苷酸鏈，10×退火緩衝液(500mM Tris，pH8.0，500mM NaCl，10mM EDTA)，加水補足50μl。水浴鍋中加熱至95℃，緩慢冷卻至室溫。2，補平，在補平反應體系中進行，體系中包括10×klenow緩衝液，10mM dNTPs，klenow酶(NewEngland Biolab公司產品)和退火反應體系。將退火產物補平成平滑末端
3，pCANTAB 5E-llfc重組克隆的構建。分為三步1)，酶切，分別對載體與基因片段進行Sfi I和Not I的雙酶切。酶切體系為40μl 10×酶切緩衝液，補平產物192μl，酶SfiI 5μl(10單位/μl)，100×BSA 4μl，補水至400μl。50℃水浴12小時。酶切後產物加入高鹽緩衝液至NaCl的濃度為150mM，及Not I限制性內切酶。37℃水浴6小時，終產物用超濾管純化回收(Millpore公司產品)。2)，載體的去磷酸化和片段的回收，酶切後回收的載體進行去磷酸化處理，載體片段3μg，10×CIAP緩衝液5μl，牛小腸鹼性磷酸酶2μl(Takara公司產品，10U/μl)，加水補足50μl。50℃水浴30分鐘，75℃15分鐘。用酚氯仿抽提的方法純化去磷酸化的載體DNA。酶切後的片段用聚丙烯醯胺電泳純化。3)，pCANTAB 5E和基因片段lfc以摩爾比1∶5混合，10×T4 DNA連接緩衝液40μl，T4 DNA連接酶(12u/μl)10μl，加水至總體積400μl，分裝後，16℃水浴過夜。
4，轉化與表達。TG1大腸桿菌為本室保存，復甦活化冷凍的菌株後，按《分子克隆實驗指南》科學出版社，第二版的電轉化感受態細胞的製備方法製備感受態細胞。取感受態細胞50μl，加入純化濃縮後的連接產物1μl，輕輕旋轉以混勻內容物，用電轉儀(Bio-Rad公司產品)進行轉化，然後移入轉化管，每管加入900μl LB培養基(含有2％葡萄糖)，37℃水浴15分鐘後，37℃搖床輕搖45分鐘；離心收集菌體，用200μl培養基重懸後，均勻塗於瓊脂平板培養基上(加氨苄至終濃度為100μg/ml)，室溫晾乾後，37℃倒置培養過夜。共鋪了30個平板，每板上長出數千個克隆，用2×YT培養基將克隆洗下，混勻後，分管凍存。
5，釋放噬菌體。噬菌粒文庫病毒的包裝需要有輔助噬菌體的幫助，取5ml的凍存菌用2×YT培養基(含有100μg/ml氨苄青黴素，2％葡萄糖)稀釋。37℃搖床高速培養至OD值0.5，然後以感染複數值為10加入輔助噬菌體，37℃高速培養1小時。1000g離心10分鐘收集菌體，用2×YT培養基(100μg/ml氨苄青黴素，50μg/ml卡納黴素)重懸菌體。37℃培養過夜。
6，噬菌體的純化。噬菌體的純化通過兩次PEG-NaCl沉澱來完成，過夜菌離心收集後，取上清加入1/5體積的PEG-NaCl，冰浴1hr沉澱噬菌體，沉澱用PBS重懸，加入PEG-NaCl二次純化，冰浴後離心收集。
實施例3.以TNFα、TNFR1和McAbBMP-2為靶對進行篩選1，親和篩選過程採用微孔板法進行篩選，首先包被抗原100μg/ml 4℃過夜；用1％BSA-PBS室溫封閉1hr後，加入稀釋的重組噬菌體1012pfu/孔，室溫孵育2hr；為了洗去非特異結合的噬菌體，分別用1×PBS與1×PBST洗板20次；用100μlPH2.2 Gly-HCL洗脫特異結合的噬菌體移入新離心管中，同時加入15μl Tris-HCl PH9.1進行中和。
2，洗脫噬菌體的滴度測定洗脫的phage取10μl進行滴度測定，將噬菌體10被梯度稀釋，分別取每中相應的稀釋度10μl接種至200μl早對數期的TG1中，感染一個小時後，將菌液鋪SOBAG平板，倒置37℃過夜。培養12-16hr後。通過平板上的克隆數獲得洗脫的噬菌體的滴度。
3，噬菌體的擴增洗脫的噬菌體在投入下一輪篩選之前要先進行擴增。擴增的具體步驟同實施例2中5，6。
權利要求
1.一種新型蛋白骨架，具有下式所示序列NX1SACAAX1CLIRGNRNNYX2NGKGVCVCX3N式中，X1為組氨酸殘基(H)或異亮氨酸殘基(I)；X2為半胱氨酸殘基(C)或丙氨酸殘基(A)；X3為精氨酸殘基(R)或蘇氨酸殘基(T)。
2.以權利要求1所述的蛋白骨架為基礎構建的肽庫。
3.權利要求2所述肽庫的構建方法，包括簡併寡核苷酸的設計、化學合成法獲得骨架蛋白的基因、將基因克隆入pCANTAB 5E載體和基因的表達等步驟。
4.權利要求2所述的肽庫在生物醫藥領域中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新型構象型噬菌體隨機展示肽庫。該肽庫以昆蟲防禦素C末端的一段區域為基本的蛋白骨架，在保持其天然構象的基礎上引進隨機區，構建具有簡單二級結構的隨機肽庫。這一類肽庫因其分子量小，可溶性好，隨機區突出於分子表面易篩選得到高親和力配基等特性，可以在蛋白質工程研究，及新藥開發，疫苗研製等多領域得到廣泛應用。
文檔編號A61K38/17GK1445238SQ02104458
公開日2003年10月1日 申請日期2002年3月19日 優先權日2002年3月19日
發明者趙安, 薛沿寧, 張 傑, 高波, 鄭莉, 王會信 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所