序列對稱性的修飾的IgG4雙特異性抗體的製作方法

2023-05-25 13:34:31

序列對稱性的修飾的IgG4雙特異性抗體的製作方法
【專利摘要】本公開內容涉及IgG4類別的對稱雙特異性抗體，其包含兩條各自包含可變結構域、CH1結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一條重鏈中：CH1結構域中的與輕鏈的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種胺基酸置換；和任選地，位於上鉸鏈區中的一個或多個胺基酸被半胱氨酸置換，其中每一條重鏈的恆定區序列相似或相同並且每一條重鏈中的可變區不同，本公開內容還涉及包含所述抗體的製劑、上述抗體的每一種抗體在治療中的用途以及用於製備所述抗體和製劑的方法。
【專利說明】序列對稱性的修飾的I gG4雙特異性抗體
[0001] 本發明涉及相較於野生型抗體具有改變的二硫鍵排列的雙特異性IgG4抗體和產 生改良抗體的方法。在其它方面，本公開內容提供了用於製備雙特異性抗體的有效的方法。
[0002] 包括重組蛋白、單克隆抗體（mAb)和基於核酸的藥物的生物製藥產業正在快速成 長。抗體工程已導致抗體片段或替代形式的設計和產生。當選擇基於抗體的蛋白作為治療 劑時，將優選的分子形式與其它方面例如產品收率、蛋白質質量和貯藏穩定性一起考慮。
[0003] 所有免疫球蛋白（Ig)分子的基本結構包括通過二硫鍵偶聯的兩個相同的重鏈 (HC)和兩個相同的輕鏈（LC)。每一個LC由可變結構域（')和恆定結構域（CJ組成。基 於HC，識別了 5個主要Ig類別：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。對於IgG，HC由一個可變結構 域（Vh)和3個恆定結構域（C Hl-3)組成。CH2和CH3結構域形成分子的Fc部分，該部分負 責刺激效應子功能並且通過賦予IgG分子柔性的鉸鏈區連接於Fab片段（V h'和QA)。兩 個抗原識別位點位於'和Vh結構域的末端。IgG進一步細分成4個不同的同種型：IgGl、 IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0004] Fe-介導的效應子功能，即抗體依賴性細胞毒性（ADCC)或補體依賴性細胞毒性 (CDC)是同種型依賴性的。每一同種型已進化來在體內執行特定功能。IgGl同種型因其延 長的半衰期、增強的ADCC活化和補體活化而目前最廣泛地用作治療劑。其它同種型在對於 靶和期望的效應適當時被用作治療劑。例如，當僅中和靶抗原並且效應子功能不太重要時， 可使用替代的同種型例如IgG2和IgG4。或者，可考慮具有再工程化的Fe/效應子功能的 IgG。
[0005] IgG2也具有最小相關的效應子功能，但易於二聚化，該現象未完全弄清楚。
[0006] 由於其效應子功能誘導的相對缺乏，IgG4仍然是有用的同種型。然而，IgG4還具 有一些固有的實際困難，即其更短的血清半衰期及其進行"Fab-臂交換"的能力，"Fab-臂 交換"也稱為動態重鏈交換或重鏈交換，其中一個抗體的重鏈及其連接的輕鏈與另一個抗 體的重鏈及其連接的輕鏈交換，從而形成另一個由兩個重鏈和兩個連接的輕鏈組成的完整 抗體（van der Neut Kolfschoten 等人，2007Science 317, 1554-1557)。
[0007] 在體內，Fab-臂交換導致雙特異性抗體，所述抗體，由於它們具有不同的可變結構 域，可同時銜接（co-engage)不同的靶抗原。這產生高百分比的循環IgG4,已觀察到該循 環IgG4是雙特異性的，但功能上是單價的。（Schuurman, J.，Van Ree, R.，Perdok, G. J.，Van Doom, H. R. , Tan, K. Y. , Aalberse, R. C. , 1999. Normal human immunoglobulin G4can be bispecific: it has two different anti gen-combining sites. Immunology 97,693-698)。
[0008] 在體外，當通過非還原性SDS-PAGE分析IgG4抗體時，已觀察到它們形成所謂的 "半分子"，每一個半分子包含因重鏈間二硫鍵不存在（通常因鉸鏈區內重鏈內二硫鍵的形 成而導致的）而引起的單個共價締合的重鏈-輕鏈對。"半分子"的重鏈可與其重鏈配對伴 侶非共價締合，締合通過CH3:CH3結構域相互作用維持。在溶液中，使用方法例如尺寸排阻 色譜法實際觀察到這樣的"半分子"是完全尺寸的，即約150kDa，但在非還原性SDS-PAGE上 其包含75kDa LC:HC配對（所謂的"半分子"）。
[0009] 鉸鏈中位置241 (根據Kabat編號系統編號的）上的Ser至Pro的突變減少通過非 還原SDS-PAGE顯示的這些"半分子"的出現（Angal, S?等人，1993. A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody as observed during SDS-PAGE analysis Mol Immunol 30, 105-108)。此外，該點突變不 影響IgG4的緻密結構，從而允許IgG4保持其減弱的活化補體的能力。
[0010] 在S241P突變發現後，已研究了 IgG4的其它突變，以理解IgG4抗體的重鏈間相 互作用、減小IgG4效應子功能和增強結構穩定性。在Schuurman等人（Schuurman, J等 A,2001.The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4are in equilibrium with intra-heavy chain disulphide bonds. Molecular Immunology 38,1-8)中，使用 IgG4 突 變體研究觀察到的IgG4的重鏈間二硫鍵的不穩定性。在突變體Ml中，參與重鏈-輕鏈間 (CfCm)二硫鍵的Cys 131 (根據EU編號系統編號的，或根據Kabat編號系統編號的Cys 127)被絲氨酸替代，發現該突變體導致輕鏈二聚體和重鏈二聚體的形成。在突變體M2中， 參與鉸鏈中的重鏈間二硫鍵的半胱氨酸226 (按照EU編號系統編號的226或按照Kabat編 號系統編號的239)被絲氨酸替代，發現該突變體相較於IgG4具有更穩定的重鏈間連接，並 且阻止重鏈內二硫鍵的形成。
[0011] 還已研究了 IgG4抗體的CH2和CH3結構域中的突變以減少IgG4抗體的聚集體形 成。US 2008/0063635Takahashi等人已研究了 IgG4的突變體，在所述突變體中CH3結構 域中的位置409 (根據EU編號系統編號的409或根據Kabat編號系統編號的440)上的精 氨酸被賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸置換，以抑制在低PH下的聚集體形成。還教導 了 L235、D265、D270、K322、P329 和 P331 (按照 EU 編號系統編號的 L235、D265、D270、K322、 P329和P331或按照Kabat編號系統編號的L248、D278、D283、K341、P348和P350)上的其 它突變，以減小CDC活性。W02008/145142Van de Winkel等人公開了穩定的IgG4抗體，所 述抗體通過位置409上的精氨酸殘基、位置405上的Phe殘基或位置370上的Lys (根據EU 編號系統編號的R409、F405和K370或根據Kabat的編號系統編號的R440、F436和K393) 的置換而具有減小的進行Fab-臂交換的能力，即使在鉸鏈區中的S228P (根據EU編號系統 編號的S228或根據Kabat編號系統編號的S241)突變不存在的情況下亦如此。
[0012] 本發明提供了新型突變抗體，其具有有利的性質，包括相較於野生型抗體，特別地 野生型IgG4抗體和片段，改良的生物物理性質。具體地，已令人驚訝地發現，IgG4抗體的 重鏈中的與輕鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵的半胱氨酸殘基的位置的改變提供了相較於野 生型IgG4抗體具有增強的穩定性的IgG4抗體。還已發現突變IgG4抗體能夠形成具有有 利的Fab-臂交換性質的雙特異性抗體。
[0013] 在體外Fab-臂的交換可通過使用高濃度的抗體和/或使用化學刺激劑例如穀胱 甘肽來促進以產生穩定的且適合用作治療劑的雙特異性形式。這已用於醫藥生物製品領 域，因為雙特異性實體可能難以作為單個構建體表達。
[0014] 發明概述
[0015] 在一個方面，本發明提供了 IgG4種類的對稱雙特異性抗體，所述抗體包含兩條各 自包含可變區、CH1結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一條重鏈中：
[0016] a. ChI結構域中與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種胺基酸 置換；和
[0017] b.位於上鉸鏈區中的一個或多個胺基酸被半胱氨酸置換，
[0018] 其中每一條重鏈的恆定區序列相似或相同並且每一條重鏈中的可變區不同。
[0019] 在一個實施方案中，ChI結構域中與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨 酸是按照Kabat編號系統編號的位置127上的半胱氨酸，例如如圖Ib中顯示的。
[0020] 在一個實施方案中，ChI結構域中按照Kabat編號系統編號的位置127上的鏈間半 胱氨酸在一條或兩條重鏈中被另一種胺基酸置換。
[0021] 位於上鉸鏈區中的被半胱氨酸置換的一個或多個胺基酸可選自按照Kabat編號 系統編號的226、227、228、229、230、237和238，如圖訃中顯示的（上鉸鏈區中加以下劃線 的胺基酸）。在一個實施方案中，位於上鉸鏈區中的被半胱氨酸置換的一個或多個胺基酸是 選自227、228、229和230 (根據Kabat編號系統編號的）的位置上的一個或多個胺基酸，如 圖Ib和2a中顯示的。
[0022] 在一個實施方案中，位置229上至半胱氨酸的突變減少Fab-臂交換。
[0023] 在一個實施方案中，使用與位置241上至非極性胺基酸（例如，選自脯氨酸、丙氨 酸、甘氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸）的突變組合的位置230上至半胱氨酸的 突變。
[0024] 在一個實施方案中，可使用至極性殘基（例如選自精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸、組 氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和酪氨酸例如蘇氨酸）的突變來增加 Fab-臂。
[0025] 在一個實施方案中，提供了使用位置241上至非極性胺基酸（例如選自脯氨酸、丙 氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸）的突變。
[0026] 在其它方面，本發明還提供了種類IgG4的對稱雙特異性抗體，其包含兩條各自包 含可變區、C hI結構域和鉸鏈區的重鏈，其中在每一條重鏈中：
[0027] a.根據Kabat編號系統編號的位置127上的半胱氨酸被另一種胺基酸置換；和
[0028] b.根據Kabat編號系統編號的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被 另一種胺基酸置換，
[0029] 其中每一條重鏈的恆定區序列相似或相同並且每一條重鏈中的可變區不同。
[0030] 本發明提供的抗體不具有效應子功能，並且可顯示相較於野生型IgG4抗體的有 利性質，例如增強的穩定性，例如增強的熱穩定性。
[0031] 然而不希望受理論束縛，假定根據本公開內容的抗體的修飾鉸鏈解除IgG4分子 固有的內張力，從而促進增強的穩定性。
[0032] 可以例如在體外通過使用高濃度的抗體和/或使用交換的化學刺激劑例如穀胱 甘肽促進IgG4抗體的重鏈交換的天然過程，以有利於根據本公開內容的雙特異性IgG4抗 體的製備。
[0033] 本公開內容的抗體可以是有益的，因為它們具有對於野生型IgG4分子的增強的 穩定性和/或改善的重鏈交換。本發明的抗體可顯示相較於野生型IgG4減少的重鏈交換， 這提供雙特異性抗體，所述雙特異性抗體在體內顯示極少的與野生型IgG4的交換或無所 述交換（因其相較於IgG4減小的對交換的傾向性以及還因相較於天然循環IgG4抗體相對 低的體內雙特異性抗體濃度而導致的）。
[0034] 然而不希望受理論束縛，據認為相似類型的構建體（如根據本發明描述的那些構 建體）之間的交換比本公開內容的構建體與野生型IgG4之間的交換更加有利。
[0035] 本發明的雙特異性抗體可顯示在高於體內濃度的濃度例如0. 5mM或更低的濃度 下相較於IgG4野生型減少的重鏈交換。雖然本發明的雙特異性抗體顯示了相較於野生型 IgG4減少的重鏈交換，但它們確實顯示了相較於IgGlwt和IgG4S241P的一定程度的重鏈交 換，這足以在體外從兩個具有不同抗原特異性的抗體產生雙特異性抗體。本文中的構建體 的恆定區中的對稱性有利地使抗體的內張力減小至最低，從而有助於穩定性。
[0036] 因此，本發明還提供了產生對稱雙特異性抗體的方法，包括在有助於重鏈交換的 條件下將第一 IgG4抗體與第二IgG4抗體離體混合的步驟，其中第一抗體的可變區的抗原 特異性與第二抗體的可變區的抗原特異性不同。
[0037] 本公開內容的方法允許僅使用常規技術和天然發生的過程的刺激高效地製備雙 特異性對稱抗體。
[0038] 附圖概述
[0039] 圖Ia顯示IgGl野生型和IgG4野生型的人ChI和鉸鏈序列，其中鉸鏈殘基加以下 劃線，和K輕鏈恆定序列。
[0040] 圖Ib顯示：
[0041] 標明形成鏈間ChI二硫鍵的半胱氨酸（加以下劃線的）的人K輕鏈恆定序列；
[0042] 人IgGl、2、3和4重鏈N-末端ChI殘基和鉸鏈區序列，其中標明了（加以下劃線 的）形成鏈間Q-C hI二硫鍵的半胱氨酸位置（對於IgGl在上鉸鏈中，以及對於IgG2、3和 4在N-末端ChI中）；
[0043] 人IgD重鏈N-末端ChI殘基和鉸鏈區序列的部分，其中標明了（加以下劃線的） 形成鏈間C hI二硫鍵的N-末端ChI序列中的半胱氨酸位置；
[0044] 人IgM重鏈N-末端C0U C-末端ChI殘基和選擇的N-末端CH2殘基，其中標明了 (加以下劃線的）形成鏈間Q-C hI二硫鍵的N-末端ChI中半胱氨酸位置；和
[0045] 其中加以下劃線的殘基的IgG3和IgG4的上鉸鏈、IgD的鉸鏈中的殘基以及IgM的 C-末端ChI和CH2中的殘基表示其中一個或多個殘基可在本發明的抗體中被半胱氨酸置換 的位置。
[0046] 圖2a顯示與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI半胱氨酸殘基（C127)和 IgGl野生型、IgG4野生型的上鉸鏈殘基和核心鉸鏈殘基，以及其中突變被引入本發明的 IgG4抗體的位置。
[0047] 圖2b顯示與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI半胱氨酸殘基（C127)和 IgG3野生型的鉸鏈殘基，以及其中本發明的IgG3抗體中1個或多個殘基被半胱氨酸置換的 位置。
[0048] 圖2c顯示與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI半胱氨酸殘基（C127)和IgM 野生型的選擇的C0I和CH2殘基，和其中本發明的IgM抗體中一個或多個殘基被半胱氨酸置 換的位置。
[0049] 圖2d顯示與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的(^1半胱氨酸殘基（C128)和IgD 野生型的鉸鏈殘基，和其中本發明的IgD抗體中一個或多個殘基被半胱氨酸置換的位置。
[0050] 圖3a顯示被引入根據本發明的IgG4抗體的突變。
[0051] 圖3b顯示圖3a中顯示的IgG4抗體的突變的重鏈中的殘基的位置，和可與輕鏈 (LC)中的半胱氨酸或與另一個突變的重鏈（HC)形成的預測的二硫鍵。其中半胱氨酸可與 LC或HC中的半胱氨酸鍵合，加以下劃線的鏈是預測的主要的二硫鍵排列。
[0052] 圖4a顯示引入根據本發明的IgG4抗體的突變。
[0053] 圖4b顯示圖4a中顯示的IgG4抗體中的半胱氨酸殘基的位置，和可與輕鏈（LC) 或重鏈（HC)中的半胱氨酸形成的預測的二硫鍵。其中半胱氨酸可與LC或HC中的半胱氨 酸鍵合，加以下劃線的鏈是預測的主要的二硫鍵排列。
[0054] 圖5顯示根據本發明的IgG4抗體的ChI和鉸鏈區的序列。
[0055] 圖6顯示根據本發明的IgG4抗體的CH1、鉸鏈區、CH2和C H3的序列。
[0056] 圖7顯示根據本發明的抗體的Western印跡分析，上方的凝膠顯示使用抗人Fc抗 體的結果，底部的凝膠顯示使用抗K抗體的結果。
[0057] 圖8顯示根據本發明的抗體的Western印跡分析，最上方的凝膠顯示使用抗人Fc 抗體的結果，底部的凝膠顯示使用抗人K抗體的結果。
[0058] 圖9顯示根據本發明的抗體的Western印跡分析，最上方的凝膠顯示使用抗人Fc 抗體的結果，底部的凝膠顯示使用抗人K抗體的結果。
[0059] 圖10顯示根據本發明的抗體的Western印跡分析，最上方的凝膠顯示使用抗人Fc 抗體的結果，底部的凝膠顯示使用抗人K抗體的結果。
[0060] 圖11顯示本發明的抗體的Thermofluor分析的結果，該結果顯示Fab和Cg2結構 域的熱穩定性。
[0061] 圖12顯示本發明的抗體的Thermofluor分析的結果，該結果顯示Fab和Cg2結構 域的熱穩定性。
[0062] 圖13顯示本發明的抗體的Thermofluor分析的結果，該結果顯示Fab和Cg2結構 域的熱穩定性。
[0063] 圖14顯示本發明的抗體的Thermofluor分析的結果，該結果顯示Fab和Cg2結構 域的熱穩定性。
[0064] 圖15顯示選擇的本發明的抗體的熱穩定性的等級評定。
[0065] 圖16顯示IgGl野生型、IgG4野生型和各種突變體在兩個GSH濃度上和不同的時 間點上的重鏈交換。
[0066] 圖17顯示IgG4野生型和各種突變體在兩個GSH濃度上和不同時間點上的重鏈交 換。
[0067] 圖18顯示IgG4野生型和各種突變體在兩個GSH濃度上不同時間點上的重鏈交 換。
[0068] 圖19顯示各種突變體在0. 5mM GSH上相較於野生型IgG4的重鏈交換的百分比變 化。
[0069] 圖20顯示各種突變體在5mM GSH上相較於野生型IgG4的重鏈交換的百分比變化。
[0070] 圖21顯示在位置241上具有替代殘基的IgG4突變體的對稱臂交換分析。IgG4WT 交換高於IgG4P。S241G和S241A的交換活性彼此相似並且顯著更低，約為IgG4WT的一半。 S241T以與IgG4WT相似的水平交換。
[0071] 序列概沭
[0072] SEQ ID NOs: 1-223 顯示各種鉸鏈。
[0073] SEQ ID NO:224 顯示天然 IgGl 鉸鏈。
[0074] SEQ ID NO: 225 顯示天然 IgG4 鉸鏈。
[0075] SEQ ID NO:226顯示IgGl野生型抗體的CHl和鉸鏈區序列。
[0076] SEQ ID NO: 227顯示IgG4野生型抗體的CHl和鉸鏈區序列。
[0077] SEQ ID NO:228顯示人野生型K輕鏈的恆定區的部分。
[0078] SEQ ID NO:229顯示IgG4下鉸鏈序列（說明書的22頁）
[0079] SEQ ID NO: 230顯示人IgGl抗體的ChI結構域的N-末端序列的部分。
[0080] SEQ ID NO:231顯示人IgGl抗體的鉸鏈區。
[0081] SEQ ID NO: 232顯示人IgG2抗體的ChI結構域的N-末端序列的部分。
[0082] SEQ ID NO:233顯示人IgG2抗體的鉸鏈區。
[0083] SEQ ID NO: 234顯示人IgG3抗體的ChI結構域的N-末端序列的部分。
[0084] SEQ ID NO:235顯示人IgG3抗體的鉸鏈區。
[0085] SEQ ID NO: 236顯示人IgG4抗體的ChI結構域的N-末端序列的部分。
[0086] SEQ ID NO: 237顯示人IgG4抗體的鉸鏈區。
[0087] SEQ ID NO: 238顯示人IgGD抗體的ChI結構域的N-末端序列的部分。
[0088] SEQ ID NO: 239顯示人IgGD抗體的鉸鏈區的部分。
[0089] SEQ ID NO: 240顯示人IgGM抗體的ChI結構域的N-末端序列的部分。
[0090] SEQ ID NO: 241顯示人IgGM抗體的ChI結構域的C-末端序列的部分。
[0091] SEQ ID NO: 242顯示人IgGM抗體的CH2結構域的部分。
[0092] SEQ ID N0:243 至 278 分別顯示抗體 6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28?、44卩、1、4、5、5卩、9、10、11、12、13和14的〇 11結構域 和鉸鏈區序列。
[0093] SEQ ID N0:279顯示野生型IgG4CH2和CH3結構域的序列。
[0094] SEQ ID N0:280顯示野生型IgG4CH2和野生型IgGlCH3結構域的序列。
[0095] SEQ ID N0:281 至 306 分別顯示抗體 6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28P 和 44P 的 ChI 結構域、鉸鏈區、CH2 結構域和 CH3 結 構域序列。
[0096] SEQ ID N0:306 至 316 分別顯示抗體 1、4、5、5P、9、10、11、12、13 和 14 的 ChI 結構 域、鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域序列。
[0097] SEQ ID N0:317、318、320 和 321 顯示各種鉸鏈序列。
[0098] SEQ ID No:319是抗體序列中的位置。
[0099] 本發明的優詵實施方案的詳沭
[0100] 現將更詳細地描述本發明。
[0101] 本文中使用的對稱抗體為其中重鏈在可變區外部的區域中具有相似或相同的序 列的抗體或抗體片段。
[0102] 如本文中所使用的，相似的是其中胺基酸序列在分析的全序列上具有95%或更高 的，例如96、97、98或99%的同一性。可使用本領域技術人員已知的軟體評估百分比同一 性。
[0103] 如本文中使用的，相同的是指其中在分析的序列上例如全序列上具有100 %的序 列同一,I"生。
[0104] 在一個實施方案中，本公開內容的抗體的重鏈序列例如通過鏈間二硫鍵，例如天 然存在於對應野生型片段中的鍵或通過基因工程而存在於鏈中期望的位置中的鍵共價連 接。
[0105] 在一個方面，本公開內容的抗體的特徵在於重鏈序列或片段都具有IgGl型鉸鏈。
[0106] 野生型IgGl的上鉸鏈和核心鉸鏈具有序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID No:224)。
[0107] 野生型IgG4的上鉸鏈和核心鉸鏈具有序列EPKYGPPCPSCP(SEQ ID No:225)。
[0108] 本文中使用的IgGl型鉸鏈意欲指其中一個或多個例如1至5個，例如1、2或3個 胺基酸被插入IgG4鉸鏈，特別地在EPKYGPP(SEQ ID No:319)與CPSC之間，和/或IgG4鉸 鏈中的胺基酸YGPP的一個或多個被替代，例如替代為對應於IgGl鉸鏈中的胺基酸，特別地 G (來自IgG4鉸鏈中的YGPP)被C替代或其中Y (來自IgG4鉸鏈中的YGPP替代）被C或S 替代。
[0109] 因此，本發明還提供了包含具有上鉸鏈、核心鉸鏈和下鉸鏈的IgG4重鏈的對稱雙 特異性抗體，其中本文中的重鏈或每一條重鏈中的所述上鉸鏈和核心鉸鏈具有13至17例 如15個胺基酸的長度。
[0110] 在一個實施方案中，具有第一 IgG4重鏈的對稱雙特異性抗體具在長度為15個氨 基酸的上鉸鏈和核心鉸鏈。
[0111] 在一個實施方案中，重鏈的上鉸鏈和核心鉸鏈包含在IgG4鉸鏈中發現的天然12 個胺基酸和另外3個胺基酸，例如3個丙氨酸殘基或3個甘氨酸殘基或其組合。
[0112] 在一個實施方案中，鉸鏈具下列序列之一：
【權利要求】
1. IgG4類別的對稱雙特異性抗體，其包含兩條各自包含可變結構域、CH1結構域和鉸鏈 區的重鏈，其中在每一條重鏈中： ChI結構域中的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種胺基酸置 換；和 任選地，位於上鉸鏈區中的一個或多個胺基酸被半胱氨酸置換，其中每一條重鏈的恆 定區序列相似或相同並且每一條重鏈中的可變區不同。
2. 權利要求1的對稱雙特異性抗體，其中所述鉸鏈區是IgGl型鉸鏈。
3. 權利要求1或2的對稱雙特異性抗體，其中所述抗體是分離的。
4. 權利要求1至3的任一項的對稱雙特異性抗體，其中一條或兩條重鏈中的C0I結構 域的根據Kabat編號系統編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種胺基酸置換。
5. 權利要求1至4的任一項的對稱雙特異性抗體，其中位於第一重鏈的上鉸鏈區中的 被半胱氨酸置換的一個或多個胺基酸選自根據Kabat編號系統編號的227、228、229和230 位置上的胺基酸。
6. 權利要求5的對稱雙特異性抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置230上的甘 氨酸被半胱氨酸置換。
7. 權利要求5的對稱雙特異性抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置229上的酪 氨酸被半胱氨酸置換。
8. 權利要求5的對稱雙特異性抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置228上的賴 氨酸被半胱氨酸置換。
9. 權利要求5的對稱抗體，其中根據Kabat編號系統編號的位置227上的絲氨酸被半 胱氨酸置換。
10. 權利要求1至9的任一項的對稱雙特異性抗體，其中一條或兩條重鏈中根據Kabat 編號系統編號的位置239上的半胱氨酸和位置242上的半胱氨酸被另一種胺基酸置換。
11. 權利要求1至10的任一項的對稱雙特異性抗體，其中第一重鏈中的根據Kabat編 號系統編號的位置239上的半胱氨酸被另一種胺基酸置換。
12. 權利要求1至11的任一項的對稱雙特異性抗體，其中第一重鏈中的根據Kabat編 號系統編號的位置242上的半胱氨酸被另一種胺基酸置換。 13. IgG4類別的對稱雙特異性抗體，其包含兩條各自包含可變結構域、ChI結構域和鉸 鏈區的重鏈，其中在每一條重鏈中根據Kabat編號系統編號的位置127上的鏈間半胱氨酸 被另一種胺基酸置換；並且根據Kabat編號系統編號的位置239上的半胱氨酸和/或位置 242上的半胱氨酸被另一種胺基酸置換，其中每一條重鏈的恆定區序列相似或相同，並且每 一條重鏈中的可變區不同。
14. 權利要求10至13的任一項的對稱雙特異性抗體，其中第一重鏈的位置239上的半 胱氨酸和/或位置242上的半胱氨酸被不包含巰基的胺基酸置換。
15. 權利要求14的對稱雙特異性抗體，其中所述不包含巰基的胺基酸為絲氨酸。
16. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其中位置127上的半胱氨酸被不包含巰 基的胺基酸置換。
17. 權利要求16的對稱雙特異性抗體，其中所述不包含巰基的胺基酸為絲氨酸。
18. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其中一條或兩條重鏈經突變在根據 Kabat編號系統編號的胺基酸226與243之間插入3個胺基酸。
19. 權利要求18的對稱雙特異性抗體，其中一條或兩條重鏈經突變在根據Kabat編號 系統編號的位置238與239之間插入3個胺基酸。
20. 權利要求19的對稱雙特異性抗體，其中3個丙氨酸被插入第一重鏈的根據Kabat 編號系統編號的位置238與239之間。
21. 權利要求19的對稱雙特異性抗體，其中在一條或兩條重鏈的根據Kabat編號系統 編號的位置238與239之間插入了蘇氨酸、組氨酸和另外一個蘇氨酸。
22. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其中一條或兩條重鏈的根據Kabat編號 系統編號的位置241上的絲氨酸被脯氨酸置換。
23. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其中在一條或兩條重鏈中，位置230上的 甘氨酸被半胱氨酸置換，位置227上的絲氨酸被脯氨酸置換，位置229上的酪氨酸被絲氨酸 置換，位置237上的脯氨酸被天冬氨酸置換，位置238上的脯氨酸被賴氨酸置換，位置238 與239之間插入了蘇氨酸-組氨酸-蘇氨酸的胺基酸序列並且位置241上的絲氨酸被脯氨 酸置換。
24. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其中兩條重鏈都包含Ch2結構域和/或 CH3結構域。
25. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其中每一條重鏈中的鉸鏈區是相同的。
26. 權利要求1至25的任一項的對稱雙特異性抗體，其中每一條重鏈包含長度為12至 17個胺基酸，例如長度為15個胺基酸的上鉸鏈區和核心區。
27. 任何前述權利要求的對稱雙特異性抗體，其還包含一條或兩條輕鏈。
28. -種表達載體，其包含編碼權利要求1至27的任一項中定義的抗體的序列。
29. -種宿主細胞，其包含權利要求28中定義的載體。
30. -種權利要求1至27的任一項中定義的抗體，其用於治療疾病或障礙。
31. -種產生對稱雙特異性抗體的方法，其包括在有助於重鏈交換的條件下將第一 IgG4抗體與第二IgG4抗體離體混合的步驟，其中第一抗體中的可變區的抗原特異性與第 二抗體中的可變區的抗原特異性不同。
32. 權利要求31的方法，其中所述有助於重鏈交換的條件是還原條件，例如在適當的 緩衝劑存在的情況下。
33. 權利要求31或權利要求32的方法，其中所述第一 IgG4抗體和所述第二IgG4抗體 各自包含權利要求1至26的任一項中定義的ChI結構域和鉸鏈區。
【文檔編號】C07K16/00GK104321341SQ201380016707
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年2月22日 優先權日:2012年2月22日
【發明者】D·P·胡姆皮雷斯, S·J·彼得斯 申請人:Ucb醫藥有限公司