分離核酸的方法、試劑及套組的製作方法

2023-05-25 10:53:16

專利名稱：分離核酸的方法、試劑及套組的製作方法
技術領域：
本發明是有關於一種分離核酸的方法，且特別有關於一種單一步驟的核酸分離方 法與核酸分離試劑。
背景技術：
近年來，分子診斷、藥物基因體學、轉譯醫學及刑事鑑定等興起，各種核酸分析的 需求也急速增加，然而，不論要進行何種的核酸分析，首先必須要求高純度的核酸，以及方 便、快速的核酸分離方法。在進行分析時，由於待測物質在液態樣本中存在的時間非常短暫，且樣本中的雜 質會影響在檢測的準確度，因此發展出一種核酸的分離技術，即利用一固相載體結合核酸， 或是以管柱內壁作為固相載體，再加入微珠至管柱中，利用微珠結合核酸後再將微珠分離 出來。此外，目前也發展出利用磁珠分離核酸的方法，主要是利用磁珠結合核酸，再利用磁 性將結合核酸的磁珠分離出來。隨著核酸分離的需求愈來愈頻繁，所需操作的樣本來源也愈來愈廣泛，由於磁性 分離技術不需離心或抽真空等步驟，因此可節省處理時間及成本。此外，磁性分離的純化過 程快速、操作方便、因此目前磁性分離已逐漸發展成為主要的核酸分離方法。目前市面上常見的核酸分離技術主要是先處理複雜樣本將核酸釋出，再利用固相 結合分離核酸，固相分離部分應用Boom Patent (美國第5234809號專利)的Chaotropic Salt (離液鹽)將樣品中的核酸吸附至矽材料(Silica)上，經過清洗步驟之後，再使用衝提 (elution，洗脫)緩衝液將矽材料上的核酸衝洗下來，達到分離核酸的效果。此外，美國第 6274386號專利則是應用含矽表面材料的磁性固相載體吸附核酸。然而，不論如何，所有的核酸分離方法皆需經過溶解(lysis)、萃取、沉澱、清洗、衝 提等5個步驟，其所花費的時間較長、且容易汙染。因此，本發明提供一快速且方便的核酸 分離方法及試劑(組合物)，可省去傳統繁複及耗時的多步驟核酸分離方法。

發明內容
本發明是提供一種分離核酸的方法，該方法包括將一分離試劑與一含有核酸的生 物樣本混合後，所述分離試劑會使核酸自生物樣本中分離出來並結合至一固相載體上，不 需樣本前處理即可以單步驟分離核酸，其特徵在於使用的分離試劑包括1 40wt%的聚 乙二醇(PEG)和/或大於30wt%的低分子量醇類、鹽類及表面活性劑，通過改變核酸溶解度 結合至固相載體。本發明另提供一種分離核酸的試劑，該試劑包括1 40wt%的聚乙二醇(PEG)和 /或大於30wt%的低分子量醇類、一鹽類、一表面活性劑、以及一固相載體。本發明還提供一種分離核酸的套組，該套組包括一分離試劑，其含有1 40wt% 的聚乙二醇(PEG)和/或大於30wt%的低分子量醇類、鹽類、表面活性劑、固相載體和/或 蛋白質水解酶，以及一容器。
較佳的，本發明中所述低分子量醇類的分子量為30 lOOg/mol。所述低分子量醇類為乙醇。所述低分子量醇類的重量濃度為40 60%。所述聚乙二醇的重量濃度為5 20%。所述固相載體包括金屬、金屬氧化物、矽化物或聚合物。所述固相載體包括磁性物質。所述鹽類包括鹼金族、鹼土族和/或銨鹽商化物。所述表面活性劑包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35 或 CHAPS。所述試劑還包括一蛋白質水解酶。所述試劑還包括一糖類。其中所述試劑包括一多糖類或多糖類衍生物。其中所述 多糖類包括肝糖、澱粉、低聚糖、葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、幾丁聚糖、黏多糖、肽聚糖。所述試劑與生物樣本的混合反應溫度為約50°C 80°C。所述生物樣本與試劑的混合酸鹼值為pH 6 9。所述生物樣本包含有一或多個核酸。所述生物樣本包含有細胞物質。所述生物樣本包括原核生物、真菌、病毒、細胞、血液、羊水、腦脊液，或來自皮膚、 肌肉、結膜、胎盤或腸胃道的組織及其組織液。本發明的方法還可包括在所述生物樣本與試劑混合後，進行一清洗程序。該方法 還包括在所述清洗程序後，進行一衝提程序。本發明的套組還可包括一清洗緩衝液和/或一衝提緩衝液。其中所述清洗緩衝液 可去除鹽類及蛋白質。其中所述衝提緩衝液可將核酸由固相載體上衝洗下來。本發明的套組中，所述容器用於盛裝分離試劑。為了讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特列舉較佳實 施例，並配合附圖，作詳細說明。


圖1為DNA瓊膠電泳分析。
具體實施例方式本發明是提供一種分離及/或純化核酸的方法。在本發明的方法中，將一分離試 劑與一生物樣本混合及反應後可分離出生物樣本中的核酸。在一實施例中，本發明的分離試劑包括1 40wt%的聚乙二醇(PEG)，較佳為5 20wt%的聚乙二醇。在另一實施例中，本發明的分離試劑包括大於30wt%的低分子量醇類，較佳為 40 60wt%的低分子量醇類，其中低分子量醇類的分子量為約30 lOOg/mol。在一實施 例中，低分子量醇類為乙醇。在另一實施例中，本發明的分離試劑可同時包括聚乙二醇及低分子量醇類。本發明的分離試劑更包括一鹽類、一表面活性劑、一蛋白質水解酶、以及一固相載體。本發明所述的鹽類可為任何適用於分子生物實驗的鹽類，包括一鹼金族或鹼土族 及 / 或胺鹽，例如，Li+、Na+、K+、Rb\ Cs+、Fr+、Gu+ (guanidine)、Be2+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Ra2+ 和/或NH4+。在一實施例中，本發明的鹽類可包括一滷族元素，特別為Cl—。一般來說，常 用的鹽類為 Gu-HCl (guanidinehydrochloride)、LiCl、NaCl、Tris-HCl、Gu-SCN (guanidine thiocyanate)或其類似物。本發明所述的表面活性劑可為離子型表面活性劑、兩性表面活性劑或非離子型 表面活性劑，其中較佳為非離子型表面活性劑與兩性表面活性劑，非離子型表面活性劑的 種類並無特別限制，較佳為聚氧化乙烯類(polyoxyethylene)的非離子型表面活性劑， 如Tween-20 (吐溫20)、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、NP40 (壬基酚聚氧乙烯 醚)或Brij35(聚氧乙烯月桂醚)等。非離子表面活性劑的使用量或濃度不限制，例如， 可為0.01%至40%，較佳為5%至20%，兩性表面活性劑的種類並無特別限制，較佳為 CHAPS (3- {(3-cholamidopropyl) dimethylammonio} -propanesulfonate，3_ [3_ (膽酉先胺丙 基)二甲氨基]丙磺酸內鹽)，兩性表面活性劑的使用量或濃度不限制，例如可為0.01%至 20%，較佳為至10%。本發明所述的蛋白質水解酶，可為任何具有水解蛋白質功效的物質，例如嗜熱菌 蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶(bromelain)、鹼性水解蛋白酶(Alcalase)、蛋白 酶K(Protease K)、風味蛋白酶(Flavorzyme)或鹼性益瑞蛋白酶(Esperase)等，較佳為蛋 白酶 K(Protease K)。本發明所述的分離試劑可添加多糖類(polysaccharides)，包括肝糖 (glycogen)、澱粉(starch)、低聚糖(oligosaccharides)、葡聚糖(dextran)、纖維素 (Cellulose)JlCi^II (agarose)、幾丁聚糖(chitosan)、黏多糖(mucopolysaccharides) > 或肽聚糖(peptidoglycan)，可增加小分子核酸與固相載體的結合能力，提高核酸產率及純度。本發明所述的生物樣本為一種含有核酸的生物樣本。本發明的生物樣本並無特別 限制，可為任何具有核酸、染色體和/或質體的樣本。在一實施例中，本發明的生物樣本可 為真菌、原核生物(細菌)、病毒、動物細胞或植物細胞。在另一實施例中，本發明的生物樣 本可為動物的血液、羊水、腦脊液、或來自皮膚、肌肉、口腔黏膜、胎盤、腸胃道或其它器官的 組織液。應注意的是，本發明的生物樣本不需經由任何前處理，可直接與分離試劑反應，即 可分離出所需要的核酸。本發明所述的核酸可為任何天然或人工合成的DNA或RNA分子，包括單鏈DNA分 子、雙鏈DNA分子、RNA、LNA、PNA、核酸-蛋白質複合體和/或核酸-糖類複合體等。本發明的分離試劑與生物樣本混合後，於一適當的條件下進行一反應步驟。反應 步驟的溫度可為室溫、50°C 80°C，較佳為60 70°C ；pH值可為6 9，較佳為7 8，反 應時間可為5 30分鐘，較佳為10 20分鐘，最佳為15分鐘。應注意的是，生物材料可 直接與本發明的分離試劑反應，而不須進行任何的前處理。加入分離試劑後，若生物樣本為含有細胞型態的複雜生物樣本或全血檢體，分離 試劑可使細胞破裂釋出核酸，且樣本中的核酸會因為溶解度改變而被分離出來，不需事先 進行樣本離心、細胞分離、細胞溶裂等前處理步驟。本領域的技術人員可選用任何適合的方法進一步純化核酸，例如分離的核酸可利用酒精清洗來得到更高純度的核酸。在另一實施例中，分離的核酸可與固相載體結合後，再衝提出來。本發明的分離試 劑除了會改變核酸的溶解度外，也會改變核酸的結構，使核酸更易於貼覆在固相載體上，以 達到分離的目的。本發明的固相載體可為一種磁性物質、金屬、金屬氧化物、矽化物、聚合物。固相載 體的表面可以化學鍵修飾。在一較佳實施例中，固相載體的表面具有糖類(碳氫化合物)， 例如，纖維素、硝化纖維素、葡聚糖或其類似物。在另一實施例中，固相載體的表面具有一疏 水基團，例如,C1 C3tl烷基或C5 C3tl芳基等。在另一實施例中，固相載體的表面可具有一 親水基團，例如，羥基、羰基、羧基、酯類、胺基、硫基等。此外，在反應步驟後，可依序進行一清洗程序及衝提程序。清洗程序包括加入一清洗緩衝液，以移除多餘的鹽類及蛋白質。本發明所述的清 洗緩衝液可為任何適合的清洗緩衝液，其主要為移除核酸上的蛋白質、聚糖類、脂質或細胞 碎片。一般來說，清洗緩衝液可包含醇類及鹽類，醇類可為乙醇或聚乙二醇。鹽類可為低於 3M的氯化鈉或其類似物。一般來說，清洗緩衝液的體積及清洗次數以足以移除雜質(蛋白 質、聚糖類、脂質或細胞碎片)，但不影響核酸產量為佳。在清洗程序後可進行一衝提程序。衝提程序包括加入一衝提緩衝液將核酸由固相 載體上衝提出來。衝提緩衝液可為水、TE、TAE或TBE或其類似物。本發明的分離和/或純化核酸的方法使用單一試劑，以單一步驟完成，可快速、簡 便地獲得高純度及高產量的核酸。更重要的是，生物樣本不需經由任何前處理，可直接與分 離試劑反應，即可分離出所需要的核酸。本發明另提供一種核酸的分離試劑，至少包括1 40wt%的聚乙二醇(PEG)及/ 或大於30wt%的低分子量醇類。本發明的分離試劑可進一步包括上述的鹽類、表面活性劑、固相載體和/或蛋白 質水解酶。本發明還提供一種分離核酸的套組，包括一分離試劑，其含有1 40wt%的聚乙 二醇(PEG)和/或大於30wt%的低分子量醇類、鹽類、表面活性劑及固相載體、一清洗緩衝 液、一容器，以及一使用說明書。實施例1.全血的核酸分離在此實施例中使用的分離試劑含有不同濃度的PEG (0 %、5 %、10 %、15 %、20 %、 30% )、鹽類為3M胍鹽酸鹽(Gu-HCl)、表面活性劑為5% Tween-20及0. 5 μ g的磁性固相載 體，並含有蛋白質水解酶及6M尿素。取720 μ 1的本發明分離試劑直接與200 μ 1的人類全血混合，於56°C下，反應10 分鐘後，可將核酸分離結合至磁性固相載體上，去除水溶液後，以清洗緩衝液加以洗滌，最 後加入200 μ 1無菌去離子水衝提10分鐘後將磁性固相載體上衝提出來的核酸做分析。此 實施例使用的清洗緩衝液為70% Κ0Η。由表一可知，本發明的分離方法不需前處理全血樣本中的紅血球，可有效地直接 將DNA由全血中分離出來，可自200 μ 1的人類全血中分離出約1 3yg DNA，純度(A26tl/ A280)約為 1.3 1.6。
表一、DNA分離的效果
PEG濃度(% )DNA分離量(μ g)DNA 純度(A26。/A28。)00. 731. 3151. 681. 55103. 211. 62152. 851. 46202. 121. 35301. 031. 26另外，在分離試劑中使用不同濃度的乙醇(40%、50<%及60(%)、鹽類為3M胍鹽酸 鹽(Gu-HCl)、表面活性劑為5% Tween-20及0. 5 μ g的磁珠作為固相載體，並含有蛋白質水 解酶及6M尿素，清洗緩衝液為70%的Κ0Η。可自200 μ 1的人類全血分離出約2 μ g DNA, 純度(A26Q/A28Q)約為 1. 3 1. 6。2.全血及血漿的核酸分離在此實施例中使用的分離試劑含有10%的PEG、鹽類為6M胍鹽酸鹽、表面活性劑 為10% Tween-20,以及0. 5 μ g的磁性固相載體、蛋白質水解酶及6M的尿素。取720 μ 1的本發明分離試劑直接與200 μ 1的人類全血或離心分離後的血漿混 合，於56°C下，反應10 15分鐘後，可將核酸分離結合至磁性固相載體上，去除水溶液後， 以清洗緩衝液加以洗滌，最後加入200 μ 1無菌去離子水衝提10分鐘後將磁性固相載體上 衝提出來的核酸做分析。此實施例使用的清洗緩衝液為70%的Κ0Η。實施例的對照組中，以市售的!Iomega公司的Megahrb 試劑套組作為正對照 組，代表傳統的分離方法，即包括溶解(lysis)、萃取、沉澱、清洗、衝提等5個步驟。將所分 離的DNA進行分析，其結果如表二所示。結果顯示本發明的分離試劑在全血樣本或經過離 心前處理的血漿樣本，皆可由200 μ 1樣本純化出DNA約5 μ g，純度(K2Jk2J約為1. 89，本 發明的分離試劑可直接用於複雜樣本純化核酸，不需離心的樣本前處理。表二、DNA分離的效果
樣本DNA分離量(pg)DNA 純度(AM0/A28a)傳統的方法 (NkgaZorb )全血2.25 ± 0.861.58 士 0.12血漿5.38 ±0.21.81 ±0.07本發明的方法全血4.5 士 0.31.89 土 0.07血漿5.13 ±0.211.89 ±0.09 在另一實施例中，使用相同的分離試劑，並以市售的!Iomega公司的Megahrb 試劑套組作為正對照組。每次實驗重複3次。由表三結果可知，本發明的分離試劑及方法可有效地直接將DNA由全血中分離出 來，且其分離效果與市售產品相當，200 μ 1全血樣本可分離出DNA量約5 μ g，此以本發明分 離試劑所分離的DNA具有較高的純度，且重複誤差較小，純度(A26tZA28tl)約為1.9士0.051， 純化的核酸樣本可應用於聚合酶反應分析(Polymerase Chain Reaction，PCR)。表三、DNA分離的效果
權利要求
1.一種分離核酸的方法，該方法包括將一分離試劑與一含有核酸的生物樣本混合後，所述分離試劑會使核酸自生物樣本中 分離出來並結合至一固相載體上，其特徵在於所述分離試劑包括1 40wt%的聚乙二醇和/或大於30wt%的低分子量醇類、一鹽類 及一表面活性劑，其通過改變核酸的溶解度使核酸結合至所述固相載體。
2.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述低分子量醇類的分子量為30 lOOg/mol。
3.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述低分子量醇類為乙醇。
4.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述低分子量醇類的重量濃度為40 60%。
5.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述聚乙二醇的重量濃度為5 20%。
6.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述固相載體包括金屬、金屬氧化物、矽 化物或聚合物。
7.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述固相載體包括磁性物質。
8.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述鹽類包括鹼金族、鹼土族和/或銨鹽 滷化物。
9.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述表面活性劑包括Tween-20、Triton X-100、NP40、Brij35 或 CHAPS。
10.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述試劑還包括一蛋白質水解酶。
11.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述試劑還包括一糖類。
12.如權利要求11所述的分離核酸的方法，其中所述試劑包括一多糖類或多糖類衍生物。
13.如權利要求12所述的分離核酸的方法，其中所述多糖類包括肝糖、澱粉、低聚糖、 葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、幾丁聚糖、黏多糖、肽聚糖。
14.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述試劑與生物樣本的混合反應溫度 為 50°C 80°C。
15.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述生物樣本與試劑的混合酸鹼值為 pH 6 9。
16.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述生物樣本包含有一或多個核酸。
17.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述生物樣本包含有細胞物質。
18.如權利要求1所述的分離核酸的方法，其中所述生物樣本包括原核生物、真菌、病 毒、細胞、血液、羊水、腦脊液，或來自皮膚、肌肉、結膜、胎盤或腸胃道的組織及其組織液。
19.如權利要求1所述的分離核酸的方法，該方法還包括在所述生物樣本與試劑混合 後，進行一清洗程序。
20.如權利要求19所述的分離核酸的方法，該方法還包括在所述清洗程序後，進行一 衝提程序。
21.一種分離核酸的試劑，該試劑包括1 40wt%的聚乙二醇和/或大於30wt%的低 分子量醇類、一鹽類、一表面活性劑、以及一固相載體。
22.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述低分子量醇類的分子量為30 lOOg/mol。
23.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述低分子量醇類為乙醇。
24.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述低分子量醇類的重量濃度為40 60wt%o
25.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述聚乙二醇的重量濃度為5 20wt%。
26.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述鹽類包括鹼金族、鹼土族和/或銨 鹽滷化物。
27.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述表面活性劑包括Tween-20、 Triton X-100、NP40、Brij35 或 CHAPS。
28.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中所述固相載體包括金屬、金屬氧化物、 矽化物或聚合物。
29.如權利要求21所述的分離核酸的方法，其中所述固相載體包括磁性物質。
30.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中該試劑還包括一蛋白質水解酶。
31.如權利要求21所述的分離核酸的試劑，其中該試劑還包括一糖類。
32.如權利要求31所述的分離核酸的試劑，其中該試劑包括一多糖類或多糖類衍生物。
33.如權利要求32所述的分離核酸的試劑，其中所述多糖類包括肝糖、澱粉、低聚糖、 葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、幾丁聚糖、黏多糖或肽聚糖。
34.一種分離核酸的套組，該套組包括一試劑，包括1 40wt%的聚乙二醇和/或大於30wt%的低分子量醇類、一鹽類、一表 面活性劑、一固相載體和/或蛋白質水解酶，以及一容器。
35.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述低分子量醇類的分子量為30 100g/mol。
36.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述低分子量醇類為乙醇。
37.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述低分子量醇類的重量濃度為40 60wt%o
38.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述聚乙二醇的重量濃度為5 20wt%。
39.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述鹽類包括鹼金族、鹼土族和/或銨 鹽滷化物。
40.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述表面活性劑包括Tween-20、 Triton X-100、NP40、Bri j35 或 CHAPS。
41.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述固相載體包括金屬、金屬氧化物、 矽化物或聚合物。
42.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述固相載體包括磁性物質。
43.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述試劑還包括一蛋白質水解酶。
44.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述試劑還包括一糖類。
45.如權利要求44所述的分離核酸的套組，其中所述試劑包括一多糖類或多糖類衍生物。
46.如權利要求45所述的分離核酸的套組，其中所述多糖類包括肝糖、澱粉、低聚糖、 葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、幾丁聚糖、黏多糖或肽聚糖。
47.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中該套組還包括一清洗緩衝液和/或一 衝提緩衝液。
48.如權利要求47所述的分離核酸的套組，其中所述清洗緩衝液可去除鹽類及蛋白質。
49.如權利要求47所述的分離核酸的套組，其中所述衝提緩衝液可將核酸由固相載體 上衝洗下來。
50.如權利要求34所述的分離核酸的套組，其中所述容器用於盛裝分離試劑。
全文摘要
本發明提供一種簡易快速分離核酸的方法。本發明的方法包括提供一核酸分離試劑，將其與含有一或多個核酸的生物樣本混和，於一適當反應條件下，可使核酸自生物樣本中以單步驟分離出來，不需樣本前處理。所述試劑含有1～40wt％的聚乙二醇(PEG)和/或大於30wt％的低分子量醇類、鹽類及表面活性劑，通過改變核酸溶解度，使核酸結合至固相載體上而進行分離。此外，本發明另提供一種分離核酸的試劑及套組。
文檔編號C12N15/10GK102115739SQ200910217168
公開日2011年7月6日 申請日期2009年12月31日 優先權日2009年12月31日
發明者巫昆展, 林嘉芸, 林玉娟, 江佩馨, 蘇秀卿, 蘇鈺婷 申請人:財團法人工業技術研究院