植物中類胡蘿蔔素的增強的製作方法

2023-05-14 02:20:01 4

專利名稱：：植物中類胡蘿蔔素的增強的製作方法
技術領域：
：本發明涉及增強植物、植物細胞、愈傷組織、組織、果實、根或植物的其它部分中類胡蘿蔔素和其它類異戊二烯(優選番茄紅素和P-胡蘿蔔素)的含量，和/或涉及增加植物的高度的方法，涉及由這種方法產生的植物、植物細胞、愈傷組織、組織、根或果實，涉及獲得類胡蘿蔔素(優選番茄紅素和P-胡蘿蔔素)的方法，涉及核酸構建體以及涉及這種核酸構建體的使用。
背景技術：
：在現代的疾病和病患中，癌和心血管疾病都排名靠前，並且影響很大一部分人群。已經將這些疾病與諸如活性氧簇(其引起對細胞膜、DNA和其它細胞功能的損傷)之類的因素關聯。因此，抗氧化劑已經成為十分普及的食品添加劑，在所有年齡群體中，許多食品(例如新鮮水果、果汁、植物提取液和片劑)都可以使用並且每天消費以保持健康。這類化學物質包括維生素C和維生素E、多酚、黃酮醇和類胡蘿蔔素。由於人不能合成任何這些物質，它們要從微生物來源的植物獲得。與活性氧簇猝滅有關的關鍵物質的其中一類是多元醇和多烯。眾所周知，番茄紅素(p-胡羅卜素的開鏈異構體)是一種最有效的抗氧化劑，為P-胡蘿蔔素的單線態氧猝滅能力的兩倍和a生育酚的單線態氧猝滅能力的10倍。此外，其為人血漿中最主要的類胡蘿蔔素(Kaliora等，2005)。番茄紅素在血漿中的穩定性及其優越的猝滅能力使其在其產生和疾病治療方面成為受到廣泛研究的化合物。它的11個共軛雙鍵和2個非共輒雙鍵使其表徵為紅色(在472"76nm下出現峰吸收度)。在另外可能的1056種異構體中，大約12種在自然界中發現為直鏈全反式異構體，為最穩定且在植物中發現的。這種化合物是多不飽和烴，為親脂性，並且對光、熱和氧化作用敏感(Faulks和Southon，2005)。番痴ir素和妖食番茄紅素富含於多種水果和蔬菜中，例如葡萄柚、番石榴汁、西瓜、番茄中。在番茄中，紅色大部分由番茄紅素引起並且高-番茄紅素水果表現出增強的紅色。在植物，發現番茄紅素為全反式形式，並且難以從不經烹飪的食物吸收。在油存在下加熱已經顯示了更好的可提取性，並且已經發現某些番茄產品(例如番茄汁、蕃茄糊、番茄醬和番茄沙司)具有更好(即更高量)的番茄紅素。已經顯示烹飪使番茄紅素異構化為順式構型，該構型增加了其生物利用率。此外在血清中，大多數番茄紅素為順式形式。據估計，每天需要35mg番茄紅素並且可能目前不是消費者當前攝入的部分(Faulks和Southon，2005)。活性氧簇(ROS)由許多途徑產生，憑藉這些途徑能量被轉移至基態三線態氧，使其成為高度活性的受激單線態氧。這種物質能夠造成脂、蛋白質和DNA損傷。ROS因而與衰老症狀、癌和心血管疾病有關。由於富含不飽和鍵以及這些鍵的共軛，類胡蘿蔔素分子可以猝滅來自單線態氧的能量。伴隨該步驟，類胡蘿蔔素獲得激發態，激發態的類胡蘿蔔素隨後通過與溶劑環境相互作用耗散為熱。完成一個猝滅反應後，類胡蘿蔔素再生以進行另一個反應。有些估計認為，類胡蘿蔔素可以猝滅大約1000個單線態氧後，它們才分解(Krinsky，1998、Bhuvaneswari和Nagini2005、Gruszecki和Strzalka，2005)。由於ROS引起的氧化損傷，已經將其與許多慢性疾病相關聯。繼而，又已經將抗氧化劑與保護脂類、膜、低密度脂蛋白、蛋白質和DNA免受損傷相關聯。更具體來講，已經證明番茄紅素能預防癌和心血管疾病。幾個研究已經發現，番茄紅素通過結合至親脂性部分，保護這種複合物免受氧化損傷。此外還建議將其用來防止致癌物質誘導的p53和Rb抗癌基因的磷酸化，並使細胞分裂停止於G0-G1期。其還是HMGCoA還原酶的抑制劑，HMGCoA還原是膽固醇生物合成的關鍵步驟。另外，通過結合至LDL和VLDL，其阻止了膽固醇氧化物的形成並因而防止了CVD的形成(Kaliora等，2005、Agarwal和Rao2000)。雖然有幾種轉基因方法已經導致在番茄中增加了番茄紅素，但是幾乎沒有發現天然的高番茄紅素變種。歷史上由CampbellSoup公司於1917在番茄鑑定的自發性突變(力/7-7)、SanMarzano變種(1975)修飾得到的力/7-2和&(Manapal變種，1973)已經與提高的番茄紅素水平相關，並因而用於育種程序中(對於綜述，參見Bramley2002)。植物代謝工程對更有營養的具有增強的類胡蘿蔔素以及尤其是番茄紅素的植物或植物產品的尋求已經使植物生物學經歷了十分新且有奠基性的科學。對類胡蘿蔔素生物合成途徑的理解和作圖(對於綜述，參見Fraser等，1994、Hirschberg2001、Fraser等，2002和Bramley2002)已經得到了豐富的信息，這些信息使得能進行提高類胡蘿蔔素產量的植物的代謝工程。最新進展的關鍵是發現，與其它生物體不同，植物經由l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(D0XP)途徑而不是甲羥戊酸途徑合成類胡蘿蔔素。儘管兩個途徑都產生異戊烯基焦磷酸，但曱羥戊酸途徑將碳引導進固醇、倍半萜和三萜途徑中，而DOXP途徑導致形成類胡蘿蔔素、植醇、質體醌-9和雙闢(Bramley2002、Romer和Fraser2005)。首先，IPP異構化為二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)，其為活化的單體，該單體最終寡聚體化成櫳牛兒基維牛兒基焦磷酸，雄牛兒基維牛兒基焦磷酸是C40類胡蘿蔔素和該途徑的第一種化合物八氫番茄紅素的前體。八氫番茄紅素通過八氫番茄紅素脫氫酶去飽和為六氫番茄紅素，並進一步去飽和為胡羅卜素。接著番茄紅素通過胡羅卜素脫氫酶經由鏈孢紅素產生。有趣地是，細菌的crH(來自噬夏孢歐文菌(frw'/7iflz;re^^ra))將乂\氫番痴紅素轉化成全反式番痴紅素(Ye等，2000、Bramley2002)。儘管超出了該工作的範疇，但是也應該注意，全反式番茄紅素進一步轉化成cc-胡羅卜素和p-胡羅卜素，其中胡羅卜素是維生素A前體。鑑於其在健康上的有益效果而對植物進行工程改造和/或鑑定具有提高的番茄紅素的植物已經進行了很多年，最早的一些要追溯至1917年，當時Campbellsoup公司鑑定力/-J為番茄的高著色突變體(Reynard1956)。現象的擴展由Liu等，(2004)等進行了說明，他表明//7-7的同系物DDBl、LeHY5和LeCOPlLIKE的調節影響了類胡羅卜素的生物合成(Bramley1997)。力/;-2和^也從天然群體得以鑑定，並與提高的類胡蘿蔔素水平相聯繫(對於綜述，參見Levin)。根據這些結果，hp2和dg被確定為擬南芥屬(^ra6/i/o/^/s)DET1(DE-ETI0LATED1)的番茄同系物。該基因的組成型沉默導致番茄中的P-胡蘿蔔素和番茄紅素水平升高(Davuluri等，2004)。對於這些突變體具有嚴重的發育缺陷，因為它們發育受到阻礙、叢生且矮小。此外，Davuluri及其同事(2005)用RNA幹擾策略降低了DET1的水平，這顯著增加了類胡蘿蔔素的水平，導致番茄紅素加倍且P-胡蘿蔔素增加了10倍。在類似的策略中，藍光光感受器Ciy2的過表達通過降低番茄紅素P環化酶而增加了番茄紅素的含量(Giliberto等，2004)。涉及類胡蘿蔔素的生物合成途徑的酶的調節已經產生了混雜結果。Fray等，(1995)在番茄中過表達八氫番茄紅素合酶基因，導致番茄紅素增加以及由於赤黴酸生物合成的減少而同時導致矮化。Fraser等，(2002)進一步證明，利用多聚半乳糖醛酸酶啟動子果實特異性地過表達八氫番茄紅素合酶(cWB來自噬夏孢歐文菌(Erwiniauredovora))導致番茄紅素增加1.8倍，八氫番茄紅素、P-胡蘿蔔素和葉黃素也伴隨增加(2.4、和2.4倍的增加)。然而，番茄中細菌八氫番茄紅素脫氫酶(or"來自噬夏孢歐文菌)的過表達(Romer等，2000)導致0-胡羅卜素增加3倍，而番茄紅素含量減半。Mehta等，(2002)利用成熟誘導的E8啟動子驅動的酵母S-腺苷蛋氨酸脫羧酶基因，對番茄中多胺積累進行了工程改造。果實提取物表明了120|ig/mg的番茄紅素的產率(大約增加了300%)。Rosati等，(2000)利用了一種不同的方法，藉此番茄紅素環化酶通過反義技術失活，導致番茄紅素增加。育種者長期以來針對高番茄紅素辛苦地育種，通過觀察潘那利番痴(Lycopersionpennellii)和M82(番痴(Lycopersionesculentum))之間的75個漸滲品系，Liu等，(2003)報導，大約16個QTL決定番茄的顏色並因而決定番茄紅素。同樣因為其有益的性質，番茄紅素已經吸引了健康專家和植物科學家的注意。90年左右專注於發展新的策略以增加番茄中的類胡蘿蔔素水平說明了其重要性，並且說明儘管發展這種技術存在困難，仍然不斷需要將注意力集中在番茄紅素上。
發明內容本發明的目標是提供增強植物和/或植物部分中的類胡蘿蔔素水平的手段。本發明的另一個目標是提供用於在植物和/或植物部分中產生增強水平的類胡蘿蔔素(尤其是番茄紅素)的方法。本發明的還有一個目標是提供具有增強水平的類胡蘿蔔素，特別是番茄紅素的植物或植物部分。l本發明的目標通過增強植物、植物細胞、愈傷組織、組織、果實、根或植物其它部分中的類胡蘿蔔素和其它類異戊二烯(優選番茄紅素和P-胡蘿蔔素)的含量，和/或增加植物的高度來解決，所述方法包括-損傷所述植物、植物細胞、愈傷組織、組織、果實、根或植物其它部分中的線粒體功能，優選損傷線粒體複合物I、II、III和/或IV，更優選損傷線粒體複合物I。2在根據本發明方法的一個實施方案中，所述損傷利用所述植物細胞線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分，優選為未編輯的編碼序列的翻譯產物的線粒體複合物I的蛋白質組分來進行。3優選地，所述損傷通過用核酸構建體(優選DNA構建體)轉化所述植物細胞，或通過用核酸構建體經由農桿菌(Agrobacferium)種介導的轉化，優選才艮瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的轉化來轉化所述植物細胞，或通過利用合適植物病毒(例如菸草花葉病毒)的病毒轉染，或通過原生質體轉化來進行。4在本發明的一個實施方案中，所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌包含，優選二元栽體中，編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白組分的核酸。5在本發明的一個優選的實施方案中，線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分是來自不同於所述植物細胞的另一植物種的功能障礙性蛋白質或是與所述植物細胞相同的植物種的功能障礙性蛋白質。6在根據本發明的方法的另一個實施方案中，線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分是選自NAD1、2、3、4、4L、5、6、7、9、核線粒體蛋白76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda和醯基載體蛋白的功能障礙性蛋白質。7優選編碼所述經修飾蛋白質組分的所述核酸選自SEQIDNO:1_3。8在根據本發明的方法的一個實施方案中，所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌(優選所述農桿菌二元載體)另外包含編碼線粒體轉運肽的核酸，該核酸有效連接至編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的所述核酸。9在本發明的一個優選實施方案中，其中所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌(優選所述農桿菌二元載體)另外包含啟動子和終止子，並且所述啟動子和終止子有效連接至編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的所述核酸。10在本發明的一個實施方案中，其中所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌(優選所述農桿菌二元載體)包含所述啟動子和所述終止子、編碼線粒體轉運肽的所述核酸和編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的所述核酸，全部如前面所定義，它們全部得以有效連接。11優選所述損傷通過突變所述植物細胞來進行，所述突變是關於所述植物細胞中所述線粒體複合物I的至少一個組分。12在本發明的一個優選實施方案中，所述突變是通過利用施加至至少一個植物細胞，優選相同植物的多個植物細胞的化學和/或物理誘變劑隨機突變所述植物細胞來進行，所述的化學誘變劑優選選自甲基磺酸乙酯，而所述物理誘變劑選自快中子轟擊、X射線、Y射線和其它誘變輻照。13在根據本發明的方法的一個實施方案中，該方法在突變後，另外包括額外的篩選步驟，篩選是針對所述植物細胞或多個植物細胞中的線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分或其它線粒體功能。14在根據本發明的方法的一個實施方案中，所述損傷是通過施加所述植物細胞的線粒體功能的化學抑制劑，優選線粒體複合物I的化學抑制劑至所述植物細胞、植物、愈傷組織、組織、所述植物的部分、所述植物全部、果實、根和/或其它植物器官。15在本發明的一個優選的實施方案中，所述化學抑制劑選自魚藤酮、抗黴素A、乙氧氟草醚、堇菜黃質、殺粉蝶菌素、殺粉蝶黴素A、p比峻、峻竭酉同、會峻淋、聚乙酸、thiangazole和fenaza(抗蟎唑)。16在本發明的一個優選實施方案中，所述損傷是所述線粒體複合物I的抑制。17在根據本發明的方法的一個實施方案中，所述方法另外包括栽培已經經受了任意前述權利要求的方法的所述植物細胞、植物部分、組織、種子或器官，以產生植物愈傷組織、組織、植物、根和/或果實的步驟。18本發明的目標通過根據本發明方法產生的植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實來解決。19優選地，所述植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實源自植物起源，所述的植物起源選自痴科種(solanaceousspecies),包括番茄、胡椒、辣椒、馬鈴薯、碧冬茄和/或菸草。20優選地，在植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實中，類胡蘿蔔素(優選番茄紅素)的量增強至每100g鮮重的植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根和/或果實>10mg，優選>15mg,甚至更優選>16mg並且最優選>20mg。21優選的是，在植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實中，類胡蘿蔔素(優選番茄紅素)的量相對於沒有經歷根據本發明方法的植物細胞/愈傷組織/組織/植物、根或果實，增強了至少2倍，優選3倍。22本發明的目標通過獲得類胡蘿蔔素，優選番茄紅素和/或P-胡蘿蔔素的方法來解決，所述方法包括以下步驟根據本發明產生植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實，-從所述植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實純化類胡蘿蔔素，優選番茄紅素和/或p-胡蘿蔔素，優選通過溶劑萃取和純化或通過超臨界二氧化碳萃取或本領域技術人員通常所採用的任意其它方法進行。23本發明的目標也通過核酸構建體解決，所述核酸構建體包含編碼線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分的核酸序列。24優選地，線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分選自NAD1、2、3、4、4L、5、6、7和9或所述複合物的其它蛋白質性質的組25在根據本發明的核酸構建體的一個實施方案中，線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分來自選自番茄、馬鈴薯、菸草、稻、玉米、碧冬茄、擬南芥屬和/或蓮屬(丄o&s)、苜蓿屬(Medicago)、小麥和/或高粱屬(Sorghum)的物種。26優選的是，線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分具有選自SEQIDNO:4、5和6的序列。27本發明的目標通過將根據本發明的核酸構建體用於增強植物細胞、植物、愈傷組織、組織、果實、根或所述植物的其它部分中的類胡蘿蔔素和其它類異戊二烯的含量，優選番茄紅素和/或P-胡蘿蔔素的含量和/或用於增加植物的高度來解決。定義"轉基因植物或轉化的植物"指含有通過轉化引入的重組多核普酸的植物。轉化意指以這樣一種方式將多核苷酸序列引入植物中，該方式使得引起該核普酸序列穩定整合或引起該序列的瞬時表達。這可以通過粒子轟擊(基因槍)、農桿菌介導(利用經適當開發的質粒載體)、用病毒DNA或載體轉染、通過電穿孔或脂轉染引入DNA來實現。植物轉化可以在植物細胞、花粉上、在植物種子上、在植物原生質體上，或任意其它類型的植物組織、完整的植物或植物部分上於無菌或有菌條件下進行。轉化的植物可以指整個植物、任意植物部分、植物細胞、植物器官、植物組織、種子、根、花、果實、根或芽。其也指其子代。"栽體，，是通過重組、人造或化學產生多核酸構建體，包含可以編碼基因、蛋白質、啟動子、終止子和轉運肽的核酸元件。這些片段將被有效連接，以至於能夠表達編碼的基因或完全執行編碼的程序。啟動子區可以包括組成型的或組織特異性的、組織活性的、發育階段活性的/發育階段特異性的或可誘導的啟動子，例如(但不限於)花椰菜花葉病毒35S啟動子、木薯葉脈花葉病毒啟動子或玉米泛素啟動子。核苷酸序列是"有效連接的"，在DNA序列的鄰接片段以這樣的方式連接時，以便使得具有如基因序列編碼的細胞/生物學功能。類胡羅卜素類胡蘿蔔素是一類碳氫化合物(胡蘿蔔素類)以及它們的氧合衍生物(葉黃素)，由8個類異戊二烯單元組成，所述的類異戊二烯單元是以這樣的方式連接類異戊二烯單元的排列在分子的中心反轉以便兩個中心甲基基團處於1，6-位置關係，並且剩下的非末端甲基基團處於1，5-位置關係。所有的類胡蘿蔔素可以通過(i)氫化、Ui)脫氫、(iii)環化或(iv)氧化或這些方法的任意組合，從形式上源於開鏈C40H56結構，具有長的共軛雙鍵的中心鏈。損傷損傷指細胞器、功能性複合物、酶或其它功能實體的功能的部分喪失或完全喪失。如在此所用的，功能的完全喪失有時也稱為抑制。線粒體複合物線粒體複合物指分別稱為I、II、III和IV的線粒體的四個電子傳遞鏈複合物，其中複合物I是NADH-脫氬酶，複合物II是琥珀酸脫氫酶，複合物III是細胞色素c還原酶，而複合物IV是細胞色素c氧化酶。它們為參與通過氧化NADH+H+和FADH2為NAD+和FAD而產生ATP的多一多肽複合物(multipolypeptidecomplex)。線粒體複合物I蛋白這種複合物包含大約43條多肽鏈，所述的多肽鏈包括線粒體編碼的nadl、nad2、nad3、nad4、nad札m、nad5、nad6、nad7、nad9以及核編碼的76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda醯基載體蛋白。"經修飾蛋白質組分"指在其核酸序列、結構或功能上不同於天然的功能性蛋白質的蛋白質組分，並且可以是無功能的。應該注意，在植物線粒體中，由於一個或多個翻譯後的RNA編輯事件，天然的(功能性)蛋白質的胺基酸序列不同於編碼該蛋白質的天然基因序列的假定翻譯產物。"未編輯的"指與線粒體基因組中天然存在的基因序列相同的基因序列。由於轉錄後的RNA編輯(由此某些C核糖核苷酸被修飾為U核糖核苷酸，而少有的，某些U核糖核苷酸被修飾為C核糖核苷酸)，其通常不同於編碼天然的(功能性)蛋白質的mRM產物。例如，"未編輯序列的翻譯產物"是如果在轉錄後水平上沒有發生編輯事件時將期望產生的蛋白質。功能障礙部分或完全無功能的轉運肽指N-端前序列，其引導由核編碼的線粒體結合蛋白至線粒體。需要轉運肽來將這種蛋白質從它們在細胞質中的合成位點轉運穿過相關的膜。線粒體的抑制劑包括(但不限於)魚藤酮、抗黴素A、氰化物、丙二酸(琥珀酸脫氫酶抑制劑)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、碳醯基氰基對[三氟甲氧基]-苯基-腙(FCCP)、寡黴素、乙氧氟草醚、堇菜黃質、殺粉蝶黴素A、吡唑、峻蟎酮、會唑啉、聚乙酸、thiangazole、抗蟎唑、蓬喻甲醜三氣丙酉同(thenoxyltrifluoroacetone)、carfboxin、氧化萎鏽靈、丁烯醯胺、DDT、chlorproham、敵稗、地樂酚、碘苯腈、環戊二烯、百草枯、地樂酚、丁醚脲、滅多蟲、米酵菌酸和氟蟻腙。農桿菌指農桿菌種的細菌，其用於利用合適的重組農桿菌二元載體用所關注的基因轉化植物。同樣，農桿菌二元載體指重組DM構建體，其將與所關注的其它基因一起轉化進農桿菌細胞中。這些細胞繼而將被用於轉化植物細胞、植物部分、種子或完整的整林植物。本發明人已經意外地發現，增強水平的類胡蘿蔔素可以用基因工程或其它手段通過損傷植物中的線粒體功能而實現。與沒有經歷根據本發明的方法的植物比較，利用本發明，本發明人能夠在植物中產生出乎意料高的水平的類胡蘿蔔素，更顯著的是番茄紅素(表1)。類似水平的類胡羅卜素僅可以在經加工的和人工濃縮食品(例如調味番茄醬或濃縮番茄醬)中具有(也參見表2)。例如，所述目標可以通過組裝編碼玉米泛素啟動子(SEQIDNo7)、擬南芥屬At-mRBPla線粒體靶向轉運肽(核苷酸序列為SEQIDNo8，多肽序列為SEDIDNo9)、來自稻線粒體肽的未編輯的nad9基因(核苷酸序列為SEQIDNo1，多肽序列為SEDIDNo2)和胭脂鹼合酶(NOS)終止子的多核苷酸構建體來實現。可以進行這種組裝以便賦予該構建體在植物中的轉錄和翻譯能力，並且此外還使得蛋白質產物得以轉運至線粒體。可以觀察到通過這種或類似構建體轉化的植物細胞/植物/植物部分顯示出上述高水平的類胡蘿蔔素，更顯著的是番茄紅素和/或fi-胡蘿蔔素。本發明因而涉及培養高類胡蘿蔔素植物、植物細胞、組織或植物部分(包括葉、莖、根、果實和花)的方法。本發明還涉及培養具有增強水平的番茄紅素和/或P-胡蘿蔔素的植物的方法。本發明此外還涉及增強源於類異戊二烯途徑的植物化合物的水平的方法，所述的植物化合物包括(但不限於)赤黴酸、脫落酸、色素、固醇。下面提及了實例，所述的實例旨在舉例說明本發明而不是限制本發明。也提及了圖1-5，其中圖1示出了用作用於轉化的基本構建體的質粒pBS(SK-)構建體。定向序列表示At-mRBPla的編碼區，其在SacI和XbaI限制位點之間克隆進來以得到pNGl。圖2示出了用作用於轉化的基本構建體的質粒pBS(SK-)構建體。TS和未編輯的/7aW表示At-mRBPla和在XbaI和BamHI限制位點間克隆進來的經編輯的/JaW基因的編碼區，得到pNG3。圖3示出了用作用於轉化的基本構建體的質粒pBS(SK-)構建體。稱為TP的盒和未編輯的/adi表示At-mRBPla和在pBS(SK-)載體的多克隆位點插入的未編輯的"a"的編碼區。該嵌合基因處於泛素啟動子和Nos終止子的控制下。圖4示出了編碼潮黴素抗性基因(hph)的質粒pLAU6.hph，該基因由木薯葉脈花葉病毒(CVMV)啟動子驅動，並具有NOS終止子。圖5示出了番茄紅素的標準曲線，其用於確定本發明的一個實施方案中的番茄紅素含量。圖6示出了通過解析如本文所述的番茄紅素提取物而獲得的典型的色譜圖。此外，還提及了序列，其中SEQIDNO1:NADH脫氬酶亞基9的稻(^yzaw">a)線粒體nad9基因(GenBank登記號D50099[RICMTNAD9])。SEQIDNO2:NADH脫氫酶亞基9的馬鈴薯(5Wa/7咖"6eros咖)線粒體nad9基因(GenBank登記號X79774[STMINAD9])。SEQIDNO3:NADH脫氫酶亞基9的菸草(治'co〃a加"6ac咖)線粒體nad9基因(GenBank登記號YP173479[YP173479])。SEQIDNO4:NADH脫氬酶亞基9的稻(0r/za線粒體nad9蛋白(SEQIDNO1的翻譯產物)。0.1%BSA4.0mM2-巰基乙醇2mMDTT洗塗緩衝液(無BSA&DTT的提取緩衝液)2X梯度緩沖液0.5M蔗糖100mMTrisHCLpH7.56.0mMEDTA在2X梯度緩沖液中製備Percoll梯度將稻線粒體(大約75ug)重新懸浮於重懸浮緩衝液中並用1/4體積的裂解緩沖液裂解。通過倒轉溫和地混合後，加入苯酚，隨後加入氯仿。進行3次苯酚氯仿萃取，然後用氯仿萃取。在-20。C下孵育30分鐘後，用2.5體積的乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，通過在13，000轉/分鐘下離心20分鐘，從液相中沉澱出DNA。用70%的乙醇洗滌DNA沉澱顆粒，乾燥並溶解於水中。利用如下引物對，通過聚合酶鏈式反應(PCR)從擬南芥cDNA克隆線粒體定向序列(At-fflRBPla，參見DNA序列SEQIDNo8和肽序列SEQIDNO9)。正向引物5、AAGAGCTCCCATGGTVTTCTGTAACAAACTCG3』反向引物5、AATCTAGACTTGGTAGACATCAACCGG3』正向引物和反向引物分別具有整合於它們中間的Sacl位點和Xbal位點，而這使得易於將PCR產物克隆進pBS(SK-)中，將所得的栽體稱為pNGl(圖1)。線粒體的裂解將稻線粒體(大約75pg)重新懸浮於重懸浮緩衝液中並用1/4體積的裂解緩衝液裂解。通過倒轉溫和地混合後，加入苯酚，隨後加入氯仿。進行3次苯酚氯仿萃取，然後用氯仿萃取。在-2(TC下孵育30分鐘後，用2.5體積的乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，通過在13，000轉/分鐘下離心20分鐘，從液相中沉澱出DNA。用70°/。的乙醇洗滌DM沉澱顆粒，乾燥並溶解於水中。pNG3:線粒體定向的未編輯NAD9通過PCR從稻線粒體DNA獲得未編輯的nad9(DNA序列為SEQIDNO1，肽序列為SEQIDNO4)。將以下的引物組合用於擴增正向引物5、AATCTAGAATGGATAACCAATCCATTTTCCAA3、反向引物5、AAGGATCCGGGATTATCCGTCGCTACG3、正向引物具有XbaI位點而反向引物具有BamHI位點，通過所述位點未編輯的nad9基因得以克隆至鄰接所述線粒體定向序列，該載體稱為pNG3(圖2)。pNGll:利用SacI位點和BamHI位點將未編輯的nad9基因從pNG3切出，並使之與上遊的泛素啟動子(SEQIDN07)和下遊的Nos終止子連接。得到的構建體稱為pNGll(圖3)。已經為番痴(Z/co;em'co/7esctz/e/^z/izz)將完成了的基本的轉4匕工作和實驗室水平的組織培養程序進行了標準化，並且轉化方法如下轉化番茄的方法種子番痴(Z/co/ers2.co/7escu/e/U咖Mi11)變種S-22(ArkaVikas)種子得自印度園藝研究所(IndianInstituteofHorticulturalResearch)(IIHR，Hesarghatta，Bangalore)。■用雙蒸餾高壓滅菌水洗滌兩次。醒將種子在70%乙醇中漂洗2分鐘。國在搖動器中將種子浸入市售漂洗劑的70%溶液中30分鐘。■將它們進行洗滌直至所有的漂白劑痕跡都被移除。畫在高壓滅菌的薄紙上乾燥。■步驟'd，和'e，在層流罩下進行以避免汙染。用於轟擊的外植體的製備使種子在半強度MS培養基上體外發芽。將IO天大的籽苗連根拔起並將子葉切掉，將該子葉的中心部分用於轟擊。將大約40個這種外植體置於裝有滲壓劑培養基的陪替氏培養皿的中心。在該培養基中孵育4小時後，立即用粒子加速器(PDS-1000/He)讓愈傷組織接受微粒轟擊。金懸浮液的製備使用的金微粒的大小在1.5-3.0n之間，稱出6mg的金微粒置於0.5ml的埃彭道夫管(eppendorftube)內。將100ijl的高壓滅菌的雙蒸餾水加至金微粒，並在離心機中渦旋30秒。將其離心30秒。加入100jil100%的乙醇並渦旋一分鐘。以10000轉/分鐘在離心機中離心30秒。吸移掉上清液。再次重複乙醇洗滌。將100Ml無菌蒸餾水加至沉澱顆粒。將其渦旋並將50pl上清轉移進另一個0.5ml管中。每個這種管含有50μl的金懸浮液，並在室溫下或41C下保存直至完成DNA包被。顆粒包被方法以3:1的比率將兩種質粒加至5(^1的金懸浮液以便得到10ngDNA的總濃度，所述的質粒是包含所關注基因的質粒(含有未編輯的nad9基因或經編輯的nad9或反義形式的未編輯的nad9的質粒)和pLAU6hph(含可選標記潮黴素的質粒，見圖4)。將20}il0.1M的亞精胺(Sigma,Aldrich)加入其中並渦旋機上低速混合。然後加入50p12.5MCaCl2,並充分混合。讓該混合物在室溫下保持IO分鐘。稍後將其在離心機中離心30秒鐘。在層流罩中移除上清液。製備用於基因槍轉化的微載體(microcarrier)、可裂膜以及阻擋網載體膜片(macrocarrier)在進行樣品細胞/組織轟擊前將放置在載體膜片支持物中的栽體膜片進行預裝配和預消毒。首先將載體膜片浸入100%的乙醇中，然後將其在高壓滅菌的薄紙上乾燥。然後在層流罩中讓載體膜片保持UV光下進行表面消毒IO分鐘。可裂膜將選擇的可裂膜轉移至各個陪替氏培養皿用於早期的處理。在插入保持蓋前才通過簡單地將它們浸入70%的異丙醇中來將可裂膜滅菌。不要浸泡多於幾秒。過多浸泡可能使該可裂膜分層，導致過早破裂。所有的可裂膜都是層狀的，除了額定為450、650和1,100psi的那些。因為潛在的分層而不推薦高壓滅菌。阻擋網將選擇的可裂膜轉移至各個陪替氏培養皿用於早期的處理。推薦通過高壓滅菌。備選地，這些部分可以通過在70%乙醇中浸泡，然後在無菌環境中乾燥來滅菌。可以將阻擋網進行兩次高壓滅菌和再使用。將在微載體塗覆於栽體膜片上將上清液從DNA包被的金微粒除去。基於待轟擊的盤的數目，將無水乙醇加至DNA包被的金微粒——對於待塗覆的每個載體膜片(即待轟擊的薄板)加入10.0pl。將該混合物進行渦旋直至獲得均勻的懸浮液，並吸移出10.0|Lll並塗覆於載體膜片的中心上。讓乙醇乾燥揮發，留下金顆粒在栽體膜片上。進行轟擊轟擊前1.選擇並調整保持可裂膜保持蓋和微栽體組之間的間隙距這個轟擊參數。轟擊在900psi的破裂壓力和9cm的距離下進行。將阻擋網支承於微載體送出組(microcarrierlaunchassembly)的固定式巢內的正確位置。2.將氦氣供應調整至200psi，超過所需的破裂壓力。3.用70%乙醇將可裂膜保持蓋、微載體送出組和整個裝置擦乾淨。4.在試驗當天，用DNA塗覆栽體膜片並裝栽於無菌載體膜片支持物上。發射該裝置1.插上從主機至電源的電源線。2.打開電源開關。3.用70%的乙醇對轟擊室壁進行滅菌。4.將無菌可裂膜裝栽至無菌保持蓋中。5.將保持蓋固定於氣體加速管的末端(轟擊室的內部頂端)，並用轉矩扳手鎖緊。6.將載體膜片和阻擋網裝載進微載體送出組中。7.將微載體送出組和耙細胞放置於轟擊室內並將門關上。8.抽空轟擊室，將真空保持在所需水平(最小5英寸汞柱)。9.轟擊樣品持續壓下發射按鈕直至可裂膜破裂且氦氣壓力降至零。10.放開發射按鈕。轟擊後1.釋放轟擊室的真空。2.將靶細胞從轟擊室移出。3.從載體膜片送出組取出載體膜片和阻擋網。4.退出用過的可裂膜。5.將氦氣壓力從系統移除(在完成當天的所有試驗後)。經轟擊細胞的生長和選擇16小時後將愈傷組織轉移至含有BAP(4.5mg/L)和IBA(0.2mg/L-含有10mg/L潮黴素的選擇培養基)培養基的番茄再生培養基用於選擇和在25t:下光照孵育15天。將抗性愈傷組織每15天繼代培養至新鮮培養基上使之伸長。如果芽在再生培養基中沒有伸長的話，在再生後切取芽並置於含BAP(4.5mg/L)、IBA(0.2mg/L)和GA(1.0mg/L)的MS培養基上。將伸長的芽轉移至含有IAA(0.1m/L)的MS培養基中用於生根。將生根的小植林轉移至經高壓滅菌的蒸餾水中以硬化幾天，並然後轉移進蛭石中。然後將小植林轉移至紅土中。植林生長將土壤中的小植林轉移至溫室中。在標準條件下培養植林以採集變種和果實。可以為試驗目的或育種目的進行異花受精。也可以在溫室中的植物上進行遺傳試驗。通過HPLC方法進行的番茄樣品中番茄紅素含量的定量分析色i普系統1.配備有自動採樣器、除氣器、PDA檢測器和Millennium32軟體的Waters2695XESeparationsModule2.HPLC級溶劑-甲醇、二氯甲烷(通過O.22微米的薄膜過濾器過濾)3.HPLC樣品瓶用於樣品製備旋轉蒸發器、稱重天平、離心機、試管、試管架和過濾器。萃取劑己烷丙酮甲醇(2:1:1)，具有2.5%BHT樣品溶劑二氯甲烷曱醇(45:55)從番茄樣品提取番茄紅素稱出l克新鮮的番茄(從溫室採集)樣品，並用馬達和研枰在IOml萃取劑中研磨。轉移至離心管，用超聲處理6分鐘並在7500轉/分鐘下離心5分鐘。小心收集澄清的有機層並在旋轉蒸發器中千燥，在-20'C下保存直至使用。所有操作均在暗光下進行。避免直接光照和高溫。樣品製備將乾燥樣品再溶解於1ml的樣本溶劑中並從該母液配製1:10的稀釋液。將稀釋的樣品通過0.22微米的過濾器，然後讓其接受HPLC分析。樣品製備應該快速進行以避免溶劑損失。色鐠條件流動相甲醇二氯甲烷(95:5)甲醇(HPLC級溶劑用於HPLC分析)泵模式等度洗脫(MeOH:DCM::5)柱BondapakC18,4.6x150mm,5mum檢測器:Waters2996PDA檢測器流速1.5ml/分鐘注射體積20ja1注射次數2次工作時間15分鐘。檢測波長476nm甲醇二氯甲烷("5)的雙溶劑系統用於在15分鐘期間從樣品溶解番茄紅素。將工作時間減少至15分鐘，使用1.5ml/分鐘的流速，以容納更多的樣品。番茄紅素的檢測波長是476nm，其用標準曲線定量。標準曲線在具有0.1%BHT的HPLC級樣品溶劑中製備範圍為10-80jag/ml的標準番茄紅素(Sigma)，並讓其接受分析。畫出校準曲線-'番茄紅素17Jun05，校準ID1729，日期17/06/2005,R=0.9948，R2=0.9897。(參見圖5的標準曲線和圖6的代表性色譜曲線)。表1.從番茄的轉基因變種和市售變種獲得的番茄紅素的水平每100g果實的番茄紅素(以mg表示)。tableseeoriginaldocumentpage29表l:分析的番茄紅素(包括轉基因品系和市售變種)的水平。正如可以看到的，通過本發明獲得的類胡蘿蔔素的水平，更顯著的是番茄紅素的水平可以高達6.5(26.9:4.1)，並且範圍為2.1(14.3:6.7)至6.5，並且包括如下比率4.2(17.4:4.1)、3,0(16.7:5.5)和5.7(23.5:4.1)。說明書第24/27頁按絕對值計算，這麼高的水平在別處僅在經加工的食品(濃縮番茄醬)中達到，這可以從下面的表2看出。tableseeoriginaldocumentpage30表2:食物和食品中番茄紅素的水平(參考文獻Nguyen,M.L.，Schwartz,S.J.1999.Lycopene:Chemicalandbiologicalproperties.FoodTechno1.53:38-45)參考文獻1.AgarwalS,RaoAV(2000)tomatolycopeneanditsroleinhumanhealthandchronicdiseases.CanMedAssocJourn163:739-7442.BertramJS，VineAL(2005)Cancerpreventionbyretinoidsandcarotenoids:independentactiononacommontarget,BiochimBiophysActa1740:170-1783.BhuvaneswariV，NaginiS(2005)Lycopene:areviewofitspotentialasananticanceragent.CurrMedChemAnti-CancAgents5:627-6354.BramleyPM(1997)Theregulationandgeneticmanipulationofcarotenoidbiosynthesisintomatofruit.Pure&ApplChem69:2159-21625.BramleyPM(2002)RegulationofcarotenoidformationduringtomatofruitripeninganddevelopmentJExpBot53:2107-21136.DavuluriGR,vanTuinenAetal(2004)ManipulationofDETlexpressionintomatoresultsinphotomorphogenicphetotypescausedbypost-transcriptionalgenesilencing.PlantJournal46:344-3547.DavuluriGR，vanTuinenA,etal(2005)Fruit-specificRNAi-mediatedsuppressionofZ)五TVenhancescarotenoidandflavonoidcontentintomatoes.NatBiotech23:890-8958.FaulksRM,SouthonS(2005)Challengestounderstandingandmeasuringcarotenoidbioavailability,BiochimBiophysActa1740:9^-1009.FraserPD,BramleyPetal(2001)EffectoftheCnrmutationoncarotenoidformationduringtomatofruitripening.Phytochem58:75-7910.FraserPD,TruesdaleMRetal(1994)Carotenoidbiosynthesisduringtomatofruitdevelopment.PlantPhysiol105:405-41311.FraserPD，RomerSetal(2002)Evaluationoftransgenictomatoplantsexpressinganadditionalphytoenesynthaseinafruit-specificmanner.ProcNatAcadSciUSA99:1092-109712.FrayRG，WallaceAetal(1995)Constitutiveexpressioniofafruitphytoenesynthasegeneintransgenictomatoescausesdwarfismbyredirectingmetabolitesfromthegibberellinpathway.PlantJournal8:693-70113.GiegeP,SweetloveLJeta(2003)IdentificationofmitochondrialproteinicomplexesinArabidopsisusingtwo-dimensionalblue-nativepolyacrylamidegelelectrophoresis.PlantMolBiolRep21:133-14414.GiIJbertoL，PerrottaGetal(2004)Manipulationofthebluelightphotoreceptorcryptochrome2intomatoaffectsvegetativedevelopment,floweringtime,andfruitantioxidantcontent.PlantPhysiol137:199-20815.GiovannoniJJ，DellaPennaDetal(1989)Expressionofachimericpolygalacaturonasegeneintransgenicrin(Ripeninginhibitor)tomatofruitresultsinpolyuronidedegradationbutnotfruitsoftening.PlantCell1:53-6316.GiulianoG，AquilaniRetal(2000)Metabolicengineeringofplantcarotenoids.TrendsinPlantSci5:405-40717.GruszeckiWI，StrzalkaK(2005)Carotenoidsasmodulatorsoflipidmembranephysicalproerties.BiochimBiophysActa1740:108-11518.HirschbergJ(2001)Carotenoidbiosynthesisinfloweringplants.CurrOpPlanBiol4:210-21819.KalioraAC，DedoussisGVZetal(2005)Dietaryantioxidantsmpreventingatherogenesis.Atherosclerosis11:1-1720.LevinI,FrankelPetal(2003)thetomatofiflrA;greewmutationisanovelallelofthetomatohomologofthe￡>￡五770^7^1>7gene.TheorApplGenet106:454-46021.LiuY誦S，GurAetal(2003)Thereismoretotomatofruitcolourthancandidatecarotenoidgenes.PlantBiotechnologyJournal(2003)1:195-20722.LiuY,RoofSetal(2004)Manipulationoflightsignaltransductionasameansofmodifyingfruitnutritionalqualityintomato.ProcNatAcadSciUSA101:9897-990223.LiimmenP(1998)ComplexIinhibitosasinsecticidesandacaricides.BiochimBiophysActa1364:287-29624.MackenzieS,McintoshL(1999)Higherplantmitochondria.PlantCell11:571-58525.MehtaRA,CassolTetal(2002)Engineeredpolyamineaccumulationintomatoenhancesphytonutrentcontent,juicequality,andvinelife.NatureBiotech20:613-ppppppppp26.MuirSR,CollinsGJ(2001)Overexpressionofpetuniachalconeisomeraseintomatoresultsinfruitcontainingincreasedlevelsofflavonols.NatureBiotech19:470-47427.NguyenML,SchwartzSJ(1999)Lycopene:Chemicalandbiologicalproperties.Foodtechnol53:38-45.28.ReynardGB(1956)OriginofWebbSpecial(BlackQueen)intomato.R印TomatoGenetCoop40:44-6429.RomerS，FraserPDetal(2000)ElevationoftheprovitaminAcontentoftransgenictomatoplants.NatureBiotech18:666-66930.RomerS，FraserPD(2005)recentadvancesincarotenoidbiosynthesis,regulationandmanipulation.Planta221:305-30831.RosatiC,AquilaniRetal.(2000)Metabolicengineeringofbeta-caroteneandlycopenecontentintomatofruit.PlantJournal24:413-41932.WashamC(2005)Anounceofpreventionftomatonoftomatoes.EnvironmentalHealthPerspectives113:A178-A18133.YeX,Al-BabiliSetal(2000)EngineeringtheprovitaminA(B-carotene)biosyntheticpathwayinto(carotenoid-free)riceendosperm.Science287:303-30534.Geifmanetal(2005)CleartomatoconcentrateasatasteenhancerUSPatent6,890,57435.Zelkhaetal(2004)CarotenoidExtractionProcessUSPatent6,797,權利要求1.一種增強植物、植物細胞、愈傷組織、組織、果實、根或植物其它部分中的類胡蘿蔔素和其它類異戊二烯，優選番茄紅素和/或β-胡蘿蔔素的含量，和/或增加植物的高度的方法，所述方法包括a.損傷植物、植物細胞、愈傷組織、組織、果實、根或植物其它部分中的線粒體功能，優選損傷線粒體複合物I、II、III和/或IV，更優選損傷線粒體複合物I。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述損傷是利用所述植物細胞線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分，優選利用作為未編輯的編碼序列的翻譯產物的線粒體複合物I的蛋白質組分來進行。3.根據權利要求l-2任意一項所述的方法，其中所述損傷是通過用核酸構建體(優選DNA構建體)轉化所述植物細胞，或通過用核酸構建體經由農桿菌種介導的轉化，優選根瘤農桿菌介導的轉化來轉化所述植物細胞，或通過利用合適植物病毒(例如菸草花葉病毒)的病毒轉染，或通過原生質體轉化來進行。4.根據權利要求2-3任意一項所述的方法，其中所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌包含，優選二元載體中的編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的核酸。5.根據權利要求2-4任意一項所述的方法，其中所述線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分是來自不同於所述植物細胞的另一植物種的功能障礙性蛋白質或是與所述植物細胞相同的植物種的功能障礙性蛋白質。6.根據權利要求5所述的方法，其中所述線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分是選自如下的功能障礙性蛋白質NAD1、2、3、4、札、5、6、7、9、核線粒體蛋白76Kda、55Kda、28.5Kda、22Kda和醯基載體蛋白。7.根據權利要求4的方法，其中編碼所述經修飾蛋白質組分的所述核酸選自SEQIDN0:1、2、3。8.根據權利要求4-7任意一項所述的方法，其中所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌(優選所述農桿菌二元載體)另外包含編碼線粒體轉運肽的核酸，該核酸有效連接至編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的所述核酸上。9.根據權利要求4-8任意一項所述的方法，其中所述核酸構建體(優選所述DM構建體)或所述農桿菌，優選所述農桿菌二元載體，另外包含啟動子和終止子，並且所述啟動子和終止子有效連接至編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的所述核酸上。10.根據權利要求9所述的方法，其中所述核酸構建體(優選所述DNA構建體)或所述農桿菌(優選所述農桿菌二元載體)包含根據權利要求9的所述啟動子和所述終止子、根據權利要求8的編碼所述線粒體轉運肽的所述核酸和根據權利要求4的編碼所述線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分的所述核酸，它們全部得以有效連接。11.根據權利要求1-2任意一項所述的方法，其中所述損傷通過突變所述植物細胞來進行，所述突變是關於所述植物細胞中所述線粒體複合物I的至少一個組分。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述突變是通過利用施加至至少一個植物細胞，優選相同植物的多個植物細胞的化學和/或物理誘變劑隨機突變所述植物細胞來進行，所述的化學誘變劑優選選自甲基磺酸乙酯，而所述物理誘變劑選自快中子、X射線、Y射線和其它誘變射線。13.根據權利要求11-12任意一項的方法，所述方法在突變後，另外包括額外的篩選步驟，篩選是針對所述植物細胞或多個植物細胞中的線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分或其它經損傷的線粒體功能。14.根據權利要求l-2任意一項的方法，其中所述損傷是通過施用所述植物細胞的線粒體功能的化學抑制劑，優選線粒體複合物I的化學抑制劑至所述植物細胞、植物、愈傷組織、組織、所述植物的部分、所述植物全部、果實、根和/或其它植物器官。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述化學抑制劑選自魚藤酮、抗黴素A、乙氧氟草醚、堇菜黃質、殺粉蝶菌素、殺粉蝶黴素A、吡唑、峻蟎酮、喹唑啉、聚乙酸、thiangazole和抗蟎峻。16.根據前述任意一項權利要求所述的方法，其中所述損傷是所述線粒體複合物I的抑制。17.根據前述任意一項權利要求所述的方法，所述方法另外包括栽培已經經受了前述任意一項權利要求所述的方法的所述植物細胞、植物部分、組織、種子或器官，以產生植物愈傷組織、組織、植物、根和/或果實的步驟。18.通過根據前述任意一項權利要求所述的方法產生植物細胞、植物愈傷組織、組織、植物、根或果實。19.根據權利要求18所述的植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實，其源自植物起源，所述的植物起源選自茄科種，包括番茄、胡椒、辣椒、馬鈴薯、碧冬茄和/或菸草。20.根據權利要求18-19任意一項所迷的植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實，其中類胡蘿蔔素(優選番茄紅素)的量增強至每100g鮮重的植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根和/或果實>10mg，優選>15mg，甚至更優選>16mg並且最優選>20mg。21.根據權利要求18-20任意一項所述的植物細胞、愈傷組織、組織、植物或果實，其中類胡蘿蔔素(優選番茄紅素)的量相對於沒有經歷根據權利要求1-17任意一項所述的方法的植物細胞/愈傷組織/組織/植物/根或果實，增強了至少2倍，優選3倍。22.獲得類胡羅卜素，優選番茄紅素和/或p-胡羅卜素的方法，所述方法包括a.產生根據權利要求18-21任意一項所述的植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實，b.從所述植物細胞、愈傷組織、組織、植物、根或果實純化類胡蘿蔔素，優選番茄紅素和/或p-胡蘿蔔素，優選通過溶劑萃取和純化或通過超臨界二氧化碳萃取純化。23.核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼線粒體複合物I的經修飾蛋白質組分的核酸。24.根據權利要求23所述的核酸構建體，其中線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分選自NAD1、2、3、4、札、5、6、7和9或所述複合物的其它蛋白質性質的組分。25.根據權利要求23-24任意一項所述的核酸構建體，其中線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分來自選自番茄、馬鈴薯、菸草、稻、玉米、碧冬茄、擬南芥屬和/或蓮屬、苜蓿屬、小麥和/或高粱屬的物種。26.根據權利要求23-25任意一項所述的核酸構建體，其中線粒體複合物I的所述經修飾蛋白質組分具有選自SEQIDNO:4、5和6的序列。27.根據權利要求23-26任意一項所述的核酸構建體的用途，其用於增強植物細胞、植物、愈傷組織、組織、果實、根或所述植物的其它部分中的類胡蘿蔔素和其它類異戊二烯的含量，優選番茄紅素和/或P-胡蘿蔔素的含量，和/或用於增加植物的高度。全文摘要本發明涉及增強植物、植物細胞、愈傷組織、組織、果實、根或植物的其它部分中類胡蘿蔔素和其它類異戊二烯(優選番茄紅素和β-胡蘿蔔素)的含量，和/或涉及增加植物的高度的方法，涉及由這種方法產生的植物、植物細胞、愈傷組織、組織、根或果實，涉及獲得類胡蘿蔔素(優選番茄紅素和β-胡蘿蔔素)的方法，涉及核酸構建體以及涉及這種核酸構建體的使用。文檔編號C12N15/53GK101360828SQ200580052508公開日2009年2月4日申請日期2005年12月23日優先權日2005年12月23日發明者H·J·巴達馬拉納哈裡,M·P·巴比塔,S·文卡塔拉曼,V·M·V·南迪,V·M·帕特爾申請人:阿維沙基因有限公司