水溶性雙核銅配合物與製備方法及其應用的製作方法

2023-05-13 20:50:36 1

水溶性雙核銅配合物與製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種水溶性雙核銅配合物與製備方法及其應用。化學式為[CuL(NO3)2]2·CH3CH2OH。其中L為二(2-喹啉甲基)苄胺。X單晶衍射數據顯示配合物(1)屬於三斜晶系，空間點群為P-1，晶胞參數為α＝77.437(10)°，β＝78.198(10)°，γ＝85.112(9)°。將等摩爾的配體二(2-喹啉甲基)苄胺和等摩爾的硝酸銅攪拌反應3-5小時後，過濾，濾液放置得到藍綠色晶體產物。本發明配合物與CT-DNA(小牛胸腺DNA)存在較強的鍵合作用，而且作用方式為部分插入作用。並且能夠在不加氧化還原劑的條件下，通過自氧化切割模式斷裂pBR322質粒DNA。此外，配合物能夠通過靜態淬滅的方式引起BSA的內源性螢光淬滅。本發明製備方法簡單，可靠。
【專利說明】水溶性雙核銅配合物與製備方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種雙核水溶性銅配合物的合成、表徵及其應用，具體為水溶性雙核銅配合物與製備方法及其應用。
[0002]研究背景
[0003]DNA的有效斷裂在疾病治療、新藥研發及診斷方式的發展等方面起關鍵作用，因此研究者對於設計合成生理條件下催化斷裂DNA的小分子化合物產生了的極大興趣。金屬離子是天然核酸酶的活性中心，此外過渡金屬化合物被廣泛用作研究一些生物大分子的探針，因此化學工作者致力於設計合成具有生物活性的過渡金屬配合物。其中，順鉬，卡鉬等鉬類抗腫瘤藥物已經被廣泛用於臨床醫學，近年來一些釕的化合物也陸續進入臨床實驗。但是，由於鉬類藥物毒副作用高，而且容易產生抗藥性和對其他周圍正常組織損傷等限制了其應用。所以開發低毒，水溶性好的新型藥物顯得尤為迫切。
[0004]以人體本身存在的微量元素作為金屬中心的配合物，可能對身體正常細胞具有較低的毒性，而且其水溶性也較好。銅是人體必須的微量元素，作為生物體內一些結構和催化中心的輔助因子參與體內多個生物反應過程。近年來，許多銅的化合物被設計合成，而且表現出了較好的DNA切割能力和抗腫瘤活性。最近，Carlo Santini等詳細介紹了銅化合物作為抗癌藥物的新進展。
[0005]銅配合物切割DNA的主要方式可分為氧化性斷裂和水解性斷裂，水解性斷裂是生物體內降解核酸所採取的模式，而氧化性斷裂常需要在體系中加入額外的輔助試劑或用一定頻率的光照射，生成羥基自由基或單線態氧等活性物種，以氧化還原反應機理斷裂核酸。無論機理如何，這些化學合成的選擇性切割DNA的化學核酸酶可以通過改變配體或金屬的種類、結構、大小等來調節它們對DNA的相互識別，因而可能具有高度的底物專一性。因此，探討化學結構與化學核酸酶活性的關係，尋求和合成高效的、具有專一性的小分子化學核酸酶仍是生物無機化學研究中十分活躍的研究領域。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種水溶性雙核銅配合物與製備方法及其應用。本發明採用常規的溶液合成法即可得到目標產物，目標產物表現出較好的DNA鍵合能力。本發明表現出了自氧化切割DNA的能力，從而避免了外加氧化還原劑對身體的傷害；目標產物還表現出了較好的BSA鍵合能力，從而為產物作為藥物較好的在體內運輸提供了一定依據。本發明製備方法簡單，可靠。
[0007]本發明提供的雙核銅配合物的化學式為[CuL (NO3) 2] 2.CH3CH2OH,其中L為二(2-喹啉甲基)苄胺。
[0008]本發明提供的雙核銅配合物屬於三斜晶系，空間點群為P-1，晶胞參數為a=9.3144(9)Α，b= 17.026(2) A, c= 17.599(2)Α； α = 77.437(10)。，β = 78.198(10)°，y
=85.112(9)。，單胞體積為 2664.1(5) A3。
[0009]本發明提供的所述銅配合物的結構可描述如下:在配合物的一個最小非對稱基本單元中包含兩個獨立的單核銅單元和一個乙醇分子。每一個單核單元由一個與中心銅離子配位的三齒氮配體，及兩個硝酸根離子構成。其中每一個硝酸根離子都是其中一個氧原子與中心銅離子配位，配位模式為η_Ν03_。根據addison-reedi jk幾何學標準,兩個獨立單元中銅離子τ值分別為Cul (0.30)，Cu2 (0.18)，這說明兩個銅離子均處於五配位的畸變四方錐構型。其中配體L的三個N原子和硝酸根的一個O原子佔據赤道平面位置，另外一個硝酸根的O原子佔據軸向位置。
[0010]本發明提供的雙核銅配合物的製備方法包括如下步驟:
[0011]將等摩爾配體L溶於無水乙醇中，加入等摩爾的硝酸銅的水溶液，攪拌3-5小時後，過濾，將濾液放置緩慢揮發20天後，得到藍綠色晶體即為產物。所述的硝酸銅與配體二(2-喹啉甲基)苄胺的摩爾比為1:1。
[0012]本發明提供的雙核銅配合物的應用是用於製備抗癌藥物。
[0013]電子吸收光譜實驗和螢光淬滅實驗證實所述配合物與CT-DNA之間有中等鍵合的插入作用。
[0014]瓊脂糖凝膠電泳實驗證明，配合物在不加氧化還原劑的生理條件下，對質粒DNA表現出明顯的切割作用，通過引入自由基清除劑的切割機理實驗表明配合物能夠通過自氧化途徑斷裂質粒DNA，而且主要的活性物種為羥基自由基。
[0015]螢光淬滅滴定實驗證實配合物能夠有效地與BSA白蛋白結合，並且能夠通過靜態淬滅方式引起BSA內源性螢光淬滅。
[0016]總之，本發明製備步驟簡短，常溫攪拌、自然揮發條件下即可得到目標產物，不需過多外界輔助如加熱回流、水熱合成等。目標產物具有良好的水溶性，從而為進一步性質測試及臨床試驗提供一個良好的開端。產物與CT-DNA存在較強的鍵合作用。產物能夠通過自氧化途徑誘導雙螺旋DNA的有效斷裂，避免了外加條件(氧化還原劑，光照)對身體產生的傷害。此外，化合物還能夠有效地與BSA鍵合，為化合物作為潛在藥物在體內有效運輸提供了有價值的信息。具體地將講，運用多種光譜方法證實配合物與CT-DNA(小牛胸腺DNA)存在較強的鍵合作用，而且作用方式為部分插入作用。瓊脂糖凝膠電泳實驗表明:配合物能夠在不加氧化還原劑的條件下，通過自氧化切割模式斷裂PBR322質粒DNA。此外，運用螢光光譜法探討了配合物與BSA(牛血清白蛋白)的相互作用，結果顯示配合物能夠通過靜態淬滅的方式引起BSA的內源性螢光淬滅。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1:本發明雙核銅配合物的單元結構圖。
[0018]圖2:加入不同量的CT-DNA後，雙核銅化合物的電子吸收光譜變化示意圖。
[0019]圖3:本發明雙核銅配合物與EB競爭的螢光淬滅實驗結果。
[0020]圖4:生理條件下，本發明雙核銅配合物對PBR322DNA的濃度依賴切割實驗結果。
[0021]圖5:生理條件下，本發明雙核銅配合物對PBR322DNA的機理切割實驗結果。
[0022]圖6:加入不同量配合物後，本發明雙核銅配合物與BSA的螢光淬滅實驗結果。

【具體實施方式】
[0023]實施例
[0024]銅配合物的合成:
[0025]將0.1mmol的配體L溶於1ml乙醇溶液中，然後加入0.2mmol三乙胺溶液和
0.1mmol的硝酸銅5ml水溶液。常溫攪拌3h，過濾，溶液為淺藍綠色澄清溶液，緩慢揮發溶劑，數周后，析出適合X射線分析的綠色針狀晶體。產率大約:45%，元素分析結果(％)，實驗值:C，56.23% ；H,4.25% ；N, 11.73% ;理論值(C56H52Cu2N10O13):C,56.04% ；H,4.37% ；N,
11.67%。實驗值與理論值基本一致。實施加入不同量的CT-DNA，觀察配合物(I)的電子吸收光譜變化試驗:
[0026]實驗過程:
[0027]在室溫下，向樣品池和參比池中各加2.0mL緩衝溶液(緩衝溶液用三蒸水配製，含50mM NaCl和5mM Tri s，用鹽酸調至pH = 7.2)，然後向樣品池加入一定量體積的配合物溶液並向參比池中補加相應等體積的緩衝溶液。用微量進樣器向樣品池和參比池中加入一定量相同體積的CT-DNA儲備液，使CT-DNA與配合物的濃度比值不斷增加，觀察配合物吸收峰的變化並將數據保存以便擬合處理。
[0028]實驗結果:
[0029]配合物⑴在306nm處有強的紫外吸收，如圖2所示，隨著CT-DNA的逐漸等量加入，配合物的最大紫外吸收強度出現明顯的下降，即出現了明顯的「減色效應」，表明配合物與DNA發生了插入作用。為了定量比較化合物與DNA結合的強弱，根據加入DNA前後配合物吸收光譜變化(圖2中的嵌入圖)，按方程式(ε b- ε f)/( ε b- ε f) = (b_(b2_2Kb2C[DNA]/S1/2)/2KbC⑴和b = l+KbC+Kb[DNA]]/2s⑵計算了配合物與DNA的結合常數Kb和插入配合物之間鹼基對數量s值，式中[DNA]表示DNA的濃度，C為配合物濃度，而ε a，ε b和ε f分別表示表示當前配合物濃度下的摩爾吸光係數，完全結合後的配合物的摩爾吸光係數和自由配合物的摩爾吸光係數。以(ε a- ε f)/( ε b- ε f)對[DNA]作圖，擬合得到結合常數Kb值為2.11 X 15M-1,鍵合數大小s為0.26，表明配合物(I)與DNA為中等強度鍵合。
[0030]實施加入不同量的配合物(I)，觀察EB-DNA的螢光淬滅試驗:
[0031]銅配合物本身不產生螢光，所以不能採用直接螢光光譜法研究配合物與DNA的相互作用。故我們採用配合物淬滅EB-DNA結合物的螢光，通過研究EB-DNA結合物螢光強度的變化來間接測定配合物與DNA的結合程度。
[0032]實驗過程:
[0033]配製CT-DNA和EB的混合溶液，其含量分別為2.4 X 1^6M EB和4.8 X 10-5ΜCT-DNA，儲備於4°C冰箱中。配合物配製成10_3M儲備液。淬滅滴定實驗時，向樣品池中加入2.0mL儲備的EB-DNA混合液，觀察其螢光強度，然後用微量進樣器每次向樣品池中加入等體積的配合物儲備液，觀察發射光譜的變化並將數據保存以便擬合處理。
[0034]實驗結果:
[0035]配合物(I)淬滅EB-DNA的螢光光譜如圖3所示，在加入配合物(I)後，EB-DNA的螢光強度出現明顯的降低，並且隨著配合物濃度的增加，其螢光強度逐漸降低，表明配合物
(I)與CT-DNA的競爭結合取代了 EB。根據經典的螢光淬滅理論Stern-Volmer方程式，10/I = 1+K[Q]，以加入配合物前後EB-DNA的螢光強度比值為縱坐標，配合物的濃度為橫坐標，做出了 Stern-Volmer圖(圖3中的嵌入圖)，對測試數據進行擬合，得到較好的線性關係。根據方程 Keb[EB] = Kapp [complex] ,Keb = 1.0 X 17IVTi ([EB] = 2.38 μ Μ),計算出配合物的表觀鍵合常數Kapp為3.09 X 15M-1,小於經典鍵合常數17M'說明配合物與DNA之間為中等鍵合作用。
[0036]實施近生理條件下，銅配合物對pBR322DNA的切割實驗:
[0037]為了檢測配合物(I)的核酸酶活性，我們採用瓊脂糖凝膠電泳法對配合物進行DNA切割實驗研究。
[0038]在不加氧化還原劑的條件下，探測配合物的濃度依賴切割實驗。
[0039]實驗過程:
[0040]配合物在近生理條件環境下(pH = 7.2，37°C )，加入pBR322DNA，再將梯度濃度銅化合物與200ng pBR322DNA混合,3h後加loading buffer並進行電泳實驗,銅化合物濃度梯度數據如下:5 μ M，20 μ M，35 μ M，50 μ Μ, 65 μ Μ。
[0041]實驗結果:
[0042]如圖4所示，配合物(I)在近生理條件下(pH = 7.2，37°C )，實驗表明在近生理條件下銅配合物表現出明顯DNA切割活性。當配合物濃度為20 μ M，有50%的質粒DNA斷裂為單鏈DNA。
[0043]由於實驗是在未採用外界誘導條件(光照、氧化還原劑)下進行，說明銅合物切割機理可能是水解或者自氧化切割作用，因此我們通過加入一些自由基清除劑來進一步確定配合物切割DNA的機理。
[0044]實驗過程:
[0045]配合物在近生理條件環境下(pH= 7.2，37°C )，加入pBR322DNA，保持銅化合物濃度為50 μ M與200ng pBR322DNA混合，泳道O為DNA對照，I為DNA加配合物；泳道2-8為DNA加入配合物，然後再加入碘化鉀，L-組氨酸，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(catalase),大溝槽抑制劑(甲基綠)，小溝槽抑制劑(SYBR Green),金屬離子螯合劑(EDTA),3h後加loading buffer並進行電泳實驗。
[0046]實驗結果:
[0047]如圖5所示，加入羥基自由基的抑制劑碘化鉀後，切割出現明顯的抑制，說明羥基自由基有可能是切割過程中主要的活性氧物種；此外加入大溝槽抑制劑甲基綠和金屬離子螯合劑乙二胺四乙酸二鈉鹽後，切割效果也出現明顯的抑制，說明配合物有可能於DNA在大溝槽處結合而且金屬離子在切割過程中也有不可替代的作用。
[0048]實施加入不同量的配合物(I)，觀察BSA的螢光淬滅試驗:
[0049]在血漿蛋白中一半左右的蛋白屬於血清白蛋白，血清白蛋白在藥物運輸和新陳代謝過程中起到非常重要的作用；另一方面，牛血清白蛋白與人血清白蛋白成分極為相似，而且價廉易得；因此，研究配合物與牛血清白蛋白的相互作用，為配合物作為潛在的抗癌藥物在體內運輸將會提供很重要的信息。由此，我們通過螢光淬滅實驗研究了銅配合物與BSA的相互作用。
[0050]實驗過程:
[0051]向樣品池中加入2ml緩衝溶液(緩衝溶液用三蒸水配製，1mM NaH2P04/Na2HP04,pH = 7.0)和40 μ L1.5 X 10_3Μ的BSA溶液混合均勻，設置激發波長為280nm，測定345nm處BSA的螢光強度。然後用微量進樣器每次向樣品池中加入等體積的配合物儲備液，使得配合物與BSA濃度比值不斷增加，觀察發射光譜的變化並記錄數據以便數據處理。
[0052]實驗結果:
[0053]由圖6可以清晰地看出，隨著配合物的不斷加入，BSA螢光強度逐漸降低，峰形和位置基本不變，表明配合物與BSA之間發生了相互作用，BSA的發色團的微環境變化引起BSA內源性螢光淬滅。根據經典的螢光淬滅理論，依據Stem-Volmer方程式，10/I = 1+KSV[Q]=1+Kq x0[Q],以加入配合物前後BSA的螢光強度比值(IcZI)為縱坐標，配合物的濃度為橫坐標，做出了 Stem-Volmer圖(圖6中的嵌入圖)，計算得到淬滅常數Ksv值為7.86 X 1iW1,%已知(約為10_8S)為無淬滅劑時螢光物質的平均壽命，計算得到淬滅速率常數K,值為
7.86X 112M4.s'引起BSA螢光淬滅的原因存在靜態淬滅和動態淬滅兩種，一般動態淬滅中各種淬滅劑對生物大分子的最大擴散速率常數K,值為2.0X 1kT1.s—1，而我們配合物的K,數量級為112均遠遠大於101(1，實驗表明配合物是通過靜態淬滅方式引起BSA螢光的淬滅。判斷出配合物與BSA的螢光靜態淬滅機理，進一步研究了配合物與BSA的結合能力大小，利用Scatchard方程:log(IQ-1)/I = logKbin+nlog[Q],如圖6中的嵌入圖所示，以log(10-1)/I對log[Q]擬合得到一條直線，由直線斜率和截距可計算得到配合物與BSA的結合常數Kbin為5.75 X 15M4及結合位點數η為0.97，表明配合物與BSA有著較強的結合作用。
[0054]表1化合物I的晶體結構的主要數據
[0055]

【權利要求】
1.一種雙核銅配合物，其特徵在於:它的化學式為[CuL(N03)2]2 -CH3CH2OH,其中L為二(2-喹啉甲基)苄胺。
2.根據權利要求1所述的雙核銅配合物，其特徵在於:該配合物屬於三斜晶系，空間點群為 P-1，晶胞參數為 a= 9.3144(9) A, b= 17.026(2) A, c= 17.599(2) A; α =77.437(10)。，β = 78.198(10)。，Y =85.112(9)。，單胞體積為 2664.1(5) A3。
3.根據權利要求1所述的雙核銅配合物，其特徵在於它的結構為: 在配合物的一個最小非對稱基本單元中包含兩個獨立的單核銅配合物單元和一個乙醇分子；每一個單核單元由一個與中心銅離子配位的三齒氮配體，及兩個硝酸根離子構成，其中每一個硝酸根離子都是其中一個氧原子與中心銅離子配位，配位模式為I1-NO3-;兩個銅離子均採用五配位的畸變四方錐構型，其中配體L的三個N原子和硝酸根的一個O原子佔據赤道平面位置，另外一個硝酸根的O原子佔據軸向位置。
4.權利要求1所述的雙核銅配合物的製備方法，其特徵在於包括如下步驟: 將等摩爾配體L溶於無水乙醇中，加入等摩爾的硝酸銅的水溶液，攪拌3-5小時後，過濾，將濾液放置緩慢揮發20天後，得到藍綠色晶體即為產物。
5.根據權利要求4所述的銅配合物的合成方法，其特徵在於所述的硝酸銅與配體二(2-喹啉甲基)苄胺的摩爾比為1:1。
6.權利要求1所述的 雙核銅配合物的應用，其特徵在於它用於製備抗癌藥物。
【文檔編號】A61P35/00GK104072524SQ201410290261
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月25日 優先權日:2014年6月25日
【發明者】李俊玲, 李思彤, 田金磊, 劉欣 申請人:南開大學