利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法

2023-05-13 14:27:11

專利名稱：利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法
技術領域：
本發明屬於微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用廉價芭蕉芋原料發酵生產丁 二酸的方法，同時涉及琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)在以芭蕉芋為原 料製備丁二酸的方法中的應用。
背景技術：
丁二酸是一種重要的有機化合物，被美國FDA認定為GRAS( —般認為安全)，已廣 泛應用於醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品、塑料和照相材料工業等。丁二酸目前存在五 個主要的市場第一，作為表面活性劑、清潔劑、防凍劑、添加劑和起泡劑；第二，作為離子 螯合劑，用於在電鍍行業防止金屬的溶蝕和點蝕；第三，在食品行業中作為酸化劑、PH改良 劑、風味物質和抗菌劑；第四是和健康有關的產品，包括醫藥、抗生素、胺基酸和維生素等； 第五個市場也是最具發展前景的市場，即用於合成生物聚酯，主要用來生產生物可降解塑 料聚丁二酸丁二醇酯(PBS)或替代己二酸生產六碳二羧酸合成多羥基聚酯和聚氨酯橡膠 等。這些化工產品目前都是以石油或煤化工產品(如苯、丁烷等)為原料合成的，資源緊缺， 不可再生。目前，國內外石油化工廠一般先採用丁烷生成順丁烯二酸酐(馬來酸酐)，然後再 進行電解還原反應，生成丁二酸。以化學方法獲得丁二酸，不僅底物馬來酸酐和催化劑的價 格較高，並且不可避免地要消耗不可再生的石化資源，對環境造成汙染。與其他發酵相比，丁二酸發酵作為一種發酵產品和工藝具有明顯的優點。例如，在 葡萄糖發酵產乙醇的過程中形成了 2mol CO2廢氣；丁二酸發酵中則是消耗了 C02。由於發 酵法生產丁二酸是以可再生糖源和CO2作為主要原料，因此微生物發酵法生產丁二酸，具有 成本低和擺脫對石化原料依賴的優點，而且開闢了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，對環 境保護具有積極的意義。此外，與普通的好氧發酵相比較，作為微生物法生產丁二酸屬於厭 氧發酵，其能耗也相對較低。因而，總體來說，低能耗、低排放是丁二酸發酵的主要特點，符 合目前低碳經濟的標準，對環境友好。目前文獻報導的發酵法生產丁二酸研究用培養基碳源多為糧食原料。比如美 國Argorme報導了從玉米(澱粉水解液)生產化學品丁二酸的消息(驟w. ipd. anl. gov/ biotech/index. html，2002)，日本三菱化學和味之素公司也聯合開發了採用以玉米澱粉為 原料發酵生產丁二酸(http://www. biol68. com, 2005)。由於近幾年使用糧食原料的生物工業的蓬勃發展，今年來糧食原料出現短缺，價 格上漲明顯，糧食安全成為焦點，所以使用價格低廉的非糧原料為發酵主要碳源是降低發 酵法生產丁二酸成本的一個關鍵因素。已有一些利用不同非糧原料發酵生成丁二酸的報導，如韓國Lee PC等與Kim DY 等曾先後報導了Mannheimia succiniciproducens MBEL55E發酵乳清原料和發酵木漿水解 液生產丁二酸。2002年日本地球環境產業技術研究機構的Inui等人報導使用轉基因微生 物從廢紙發酵製取丁二酸，但上述研究結果產率很低。江南大學的孫志浩等人從肉牛瘤胃
3中篩選的琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593能發酵的糖質原料包 括葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等糖類，也能利用多種農副產品如乳糖、 木薯、玉米、甜菜、甘蔗糖蜜、菊芋和甜高粱等，也適於發酵秸稈、木材工業下腳料，製糖造紙 業下腳料和城市纖維垃圾等木質纖維物的水解糖漿原料生產丁二酸。通過研究，我們發現芭蕉芋原料也能夠用來發酵生產丁二酸。芭蕉芋(Carmaedulis Ker)，又稱蕉藕、姜芋等名，為蕉科、美人蕉屬中的一種單子 葉塊根植物。芭蕉芋原產於南美洲和東南亞，以後逐漸傳入世界各地，上世紀30年代傳入 中國南方的雲南、貴州、四川、廣西、海南等一些省區。芭蕉芋的主要成分為澱粉，其含量高達17% 18%，一畝地可產芭蕉芋2500 5500kg。芭蕉芋乾片化學組成為澱粉66.0%，灰分2. 80%，粗纖維2. 65%，脂肪0.28%， 蛋白質3. 63%，單寧0. 19%，水分17. 10%，並具有成本低、雜質少、澱粉顆粒粗、糊化溫度 低、應用價值大等特點(劉桂香等，食品與發酵工業，2003 (9) :104 106)。由於芭蕉芋適 口性較差，傳統習慣僅用作飼料，因而在中國南方等省區尚未得到很好的開發利用。芭蕉芋原料發酵生產丁二酸與用小麥、玉米等糧食原料發酵生產丁二酸相比，能 節約大量糧食，有利於國家糧食安全。目前，還沒有見到利用芭蕉芋原料發酵生產丁二酸的 研究報導。

發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種利用芭蕉芋原料發酵 生產丁二酸的方法的技術方案，同時提供芭蕉芋在製備丁二酸中的應用及琥珀酸放線桿菌 (Actinobacillus succinogenes)在以芭蕉芋為原料製備丁二酸的方法中的應用。所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於包括以下工藝步驟1)將芭蕉芋塊莖切片、烘乾、粉碎得到芭蕉芋乾粉，或直接將新鮮芭蕉芋塊莖粉 碎，得到新鮮芭蕉芋粉漿；2)將上述得到的芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿進行液化後得到芭蕉芋液化醪，芭 蕉芋液化醪進行糖化後得到芭蕉芋水解糖漿；3)將上述得到的芭蕉芋水解糖漿，或芭蕉芋液化醪，或芭蕉芋水解糖漿與其他 一種或一種以上的糖質原料混合配製成發酵碳源，以琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)來發酵生產丁二酸。所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟1)中將芭蕉 芋塊莖切成0. 5 5mm厚的薄片，40 70°C烘至含水量14%以下或採用日曬晾乾，然後粉 碎至20 200目，得到芭蕉芋乾粉；或直接將新鮮芭蕉芋塊莖粉碎打漿，得到新鮮芭蕉芋粉 漿。所述的利用芭蕉芋原料發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟2)中液 化和糖化操作具體步驟為將芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿加水浸泡1 3小時，並調pH 至6 7，再加入澱粉酶，然後在溫度60 110°C下液化20 40分鐘，得到芭蕉芋液化醪； 液化後降溫至40 70°C，並調pH至4 6，然後加入糖化酶，糖化8 16小時，經過濾得 芭蕉芋水解糖漿。所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3)中其他糖質原料為甘蔗糖蜜、澱粉原料物質水解糖漿、菊芋水解糖漿和秸稈水解糖漿中的一種或一 種以上的混合物，上述的澱粉原料物質包括玉米、小麥或木薯。所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3)中發酵培 養基包括含有總還原糖濃度為20 120g/L的芭蕉芋水解糖漿、或芭蕉芋液化醪或芭 蕉芋水解糖漿與其他糖質原料的混合物；玉米漿5 50g/L，Na2HPO4 · 12H20 1 5g和 NaH2PO4 · 2H20 1 5g，且發酵培養基起始pH為5. 0 8. 0。所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3)中琥珀酸 放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)發酵生產丁二酸的發酵條件為按 10% 的接種量接種，培養溫度30 40°C，維持發酵培養基pH5. 0 8. 0，並在充滿CO2或N2的厭 氧條件下發酵20 80小時。所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3)中琥珀酸 放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)發酵採用分批發酵、補料發酵或雙邊發酵生產
丁二酸。芭蕉芋原料在發酵製備丁二酸中的應用。琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)在以芭蕉芋為原料製備丁二酸 中的應用。以下，詳細描述本發明。芭蕉芋原料處理芭蕉芋塊莖經切片、烘乾、粉碎(或直接將新鮮芭蕉芋塊莖粉 碎，得到新鮮芭蕉芋粉漿)、液化和糖化後得到的芭蕉芋糖漿，是葡萄糖和麥芽糖的混合還 原糖。由於琥珀酸放線桿菌不能直接利用澱粉產生丁二酸，芭蕉芋原料必須經過以上步驟 將其中的澱粉水解成菌種能夠利用的可發酵性糖才能進行正常發酵。以芭蕉芋水解糖漿， 或芭蕉芋液化醪，或芭蕉芋水解糖漿與其他一種或一種以上的糖質原料混合物為發酵碳 源，配製成含總還原糖濃度20 120g/L的發酵培養基，再用琥珀酸放線桿菌發酵生產丁二 酸。菌株琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes) CGMCC1593，為從肉牛的 瘤胃中分離獲得，保藏在中國北京中關村中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，且已在CN1814747A中公開，
公開日為2006年8月9日。甘蔗糖蜜、澱粉原料物質水解糖漿、菊芋水解糖漿、秸稈水解糖漿的配製按本發明 人申請的專利(中國專利申請200710019686. 9，200810007470和200810007470. 5)以及江 南大學孫志浩申請的專利(中國專利申請200710192025. 6)實施。種子培養基種子培養在100ml厭氧瓶中進行，裝液20 60ml。種子培養基配方 為葡萄糖 5 10g，酵母膏 5 15g, ΚΗ2Ρ04 · 3H20 5 15g, Na2HPO4 · 12H20 8 25g, pH 5. 0 8. 0。將實驗菌株接種到種子培養基中，於30 40°C在充滿CO2的環境中靜止或振 蕩培養8 16小時。種子培養基的滅菌溫度為115 121°C，15 60分鐘。發酵培養基培養基起始pH 5. 0 8. 0 ；培養溫度30 40°C，在充滿CO2或N2的 厭氧條件下發酵20 80小時。發酵培養基中還包括其他常規組分，例如Na2HPO4 · 12H20 1 5g和NaH2PO4 · 2H20 1 5g。發酵培養基組成中可以單獨使用玉米漿(5 50g/L)或 酵母膏(5 30g/L)作為氮源，也可以組合使用。發酵在100ml厭氧瓶或5L攪拌發酵罐 (B10FL0 110, New BrunswickScientific, Edison, NJ, USA)中進行。按 10%的接種量將培養好的種子接入發酵培養基，在充滿CO2或N2氣體的環境下，30 40°C靜止或振蕩 (或攪拌)發酵20 80小時，並用碳酸鹽或鹼溶液調節維持發酵液pH 5. 0 8. 0。發酵 培養基的滅菌溫度為115 121°C，15 60分鐘。 在5L發酵罐用芭蕉芋糖漿進行分批厭氧發酵48小時，投入總還原糖濃度62. 44g/ L，產丁二酸濃度46. 67g/L，丁二酸對消耗糖產率82. 0% (糖利用率91. 2 % )，生產強度 1. Og/(升 小時)；在5L發酵罐用芭蕉芋糖漿進行補料分批發酵48小時，投入總還原糖濃 度67. 68g/L，產丁二酸濃度52. 61g/L，丁二酸對消耗糖產率83. 1 % (糖利用率93. 5% )，生 產強度1. Ig/(升·小時)；在5L發酵罐用芭蕉芋雙邊發酵(邊糖化邊發酵)48小時，投入 總還原糖濃度85. 75g/L，產丁二酸濃度58. 46g/L，生產強度1. 2g/(升 小時)，丁二酸對消 耗糖產率82. 4% ；雙邊發酵60小時，產丁二酸65. 88g/L，對消耗糖產率82. 9% (糖酸轉化 率76.8%，糖利用率92.7% )，生產強度1. Ig/(升·小時)。本發明採用的分析方法如下將培養液離心，採用高效液相色譜法分析上清液中的丁二酸等代謝產物及糖類物 質。採用美國Waters高效液相色譜儀，Waters RI檢測器，Breeze色譜工作站。其中，丁 二酸，乙酸，乳酸和甲酸等有機酸的測定使用AminexHPX-87H離子色譜柱(300mmX7. 8mm, 9 μ m ；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流動相 8mM 硫酸；柱溫 55°C ；流速 0. 5ml/分鐘；進樣量10 μ L。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖等糖類含量的測定採 用 ZobaxNH2 氨基柱(250mmX4. 6mm，5 μ m ;Agilent，USA)，流動相75% 乙腈；流速 lml/分 鍾進樣量IOyL0芭蕉芋糖漿(或混合糖液)總還原糖測定採用3，5- 二硝基水楊酸法(DNS法)，測 定時選用葡萄糖為還原糖標準物。丁二酸的對糖產率定義為每消耗1克還原糖所能產生的丁二酸克數，並以百分數表不。丁二酸糖酸轉化率定義為每投入1克還原糖所能產生的丁二酸克數，並以百分數表不。糖利用率定義為消耗還原糖所佔投入糖的百分比。上述的利用芭蕉芋原料發酵生產丁二酸的方法，設計合理，與現有技術相比，本發 明存在以下優點本發明利用從肉牛瘤胃中篩選的琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes CGMCC1593，它不僅可用於玉米等糧食原料的發酵，也很適宜於發酵芭蕉芋原料，用其發酵 芭蕉芋糖漿，或芭蕉芋糖漿與其他糖質原料的混合物，產物丁二酸濃度達40 66g/L，對糖 產率70% 90% (糖利用率80% 95% )和生產強度達到0.9 1. 2g/(L ·小時)，很適 用於低成本丁二酸的工業化生產。芭蕉芋在中國南方省區分布很廣，不僅原料易於獲得、價 格較低，而且還富含丁二酸產生菌生產所必需的有機氮源等營養物質，與甘蔗糖蜜、澱粉原 料物質水解糖漿、菊芋水解糖漿、秸稈水解糖漿等已報導非糧生物質原料相比較，更適合於 丁二酸大規模生產。本發明突出的優點是利用廉價芭蕉芋原料發酵生產丁二酸，芭蕉芋作 為一種價格低廉的農作物原料可以替代純葡萄糖或者用糧食原料玉米等水解糖作為碳源 用來發酵生產丁二酸，是一種利用可再生原料的生產方法，對環境友好，可緩解化學合成丁 二酸的石化資源緊張問題，也能夠顯著體現發酵可以不與人爭糧、不與糧爭地的優點，這不僅減少了發酵的培養基成本，並且能緩解糧食作為發酵原料的不足，還能解決大量荒原沙 漠灘涂等邊際土地的開發利用問題，有利環境，增加農民收入，利於農業與農村建設。
具體實施例方式以下通過具體的實施例來進一步說明本發明。實施例1芭蕉芋糖漿的製備將芭蕉芋塊莖切成0. 5 5mm厚的薄片，40 70°C烘至含水 量14%以下(或日曬晾乾)，粉碎至20 200目；或者直接將新鮮芭蕉芋塊莖粉碎打漿，得 到新鮮芭蕉芋粉漿。將芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿加水浸泡2小時，調pH 6. 7，加澱粉酶 (每克芭蕉芋乾物質加入澱粉酶20U)，105°C液化30min，再降溫至60°C，調pH 4. 5，加入糖 化酶(每克芭蕉芋乾物質加入糖化酶300U)糖化10小時，經過過濾得芭蕉芋糖漿，經測定 糖漿含還原糖15 25%。或將芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿加水浸泡1小時，調pH 6. 5，加澱粉酶(每克芭 蕉芋乾物質加入澱粉酶 ου)，110°C液化20min，再降溫至50°C，調pH4，加入糖化酶(每克 芭蕉芋乾物質加入糖化酶200U)糖化8小時。或將芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿加水浸泡3小時，調pH 5，加澱粉酶(每克芭蕉 芋乾物質加入澱粉酶30U)，110°C液化40min，再降溫至70°C，調pH4，加入糖化酶(每克芭 蕉芋乾物質加入糖化酶400U)糖化16小時。種子培養基(/L)葡萄糖10g，酵母膏 15g，ΚΗ2Ρ04 · 3H20 8g，Na2HPO4 · 12H20 18g， pH 7. 0。38°C，置於100ml血清瓶中厭氧培養16小時。發酵培養基(/L)芭蕉芋糖漿(總還原糖)20 100g，玉米漿25g，Na2HPO4 · 12H20 2. 0g, NaH2PO4 · 2H20 2. 0g, pH 6. 5。38°C，置於 100ml 血清瓶中厭氧培養 48 小時。使用製備的芭蕉芋榨汁糖漿，用厭氧瓶分批發酵，發酵培養基初始還原糖濃度分 別為35，50，65，80，100g/L時，其發酵結果如表1所示表1不同初始還原糖濃度的芭蕉芋榨汁糖漿發酵丁二酸結果(厭氧瓶分批發酵)
初始還原糖濃度殘還原糖丁二酸乙酸甲酸丁二酸產糖利用率(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)率(％)(%)350.2627.625.461.5179.599.3501.5438.965.040.7580.497.0659.7145.125.790.8681.685.18035.7635.486.042.8780.255.310078.3417.766.362.1882.021.7由表1可以看出，厭氧瓶分批發酵時，以初始還原糖濃度為65g/L時丁二酸的產量 和產率為最高，達到45. 12g/L，丁二酸對消耗糖產率81.6%，糖利用率85. 1%。實施例2取糖化好的芭蕉芋糖漿，初始還原糖濃度65g/L，加入不同的無機和有機氮源(其 總含氮量基本相等)，其含量分別為空白(不加入任何氮源)、NH4C15. 3g/L、KN03 9. 6g/L、 酵母膏12g/L、蛋白腖8g/L、玉米漿25g/L、胰酪腖大豆腖蛋白15g/L和牛肉膏12g/L，其他
7條件同實施例1。在厭氧瓶發酵規模上，考察不同氮源對芭蕉芋糖漿發酵產丁二酸的影響， 結果如表2所示。表2不同氮源對芭蕉芋糖漿發酵影響
權利要求
利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於包括以下工藝步驟1)將芭蕉芋塊莖切片、烘乾、粉碎得到芭蕉芋乾粉，或直接將新鮮芭蕉芋塊莖粉碎，得到新鮮芭蕉芋粉漿；2)將上述得到的芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿進行液化後得到芭蕉芋液化醪，芭蕉芋液化醪進行糖化後得到芭蕉芋水解糖漿；3)將上述得到的芭蕉芋水解糖漿，或芭蕉芋液化醪，或芭蕉芋水解糖漿與其他一種或一種以上的糖質原料混合配製成發酵碳源，以琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)來發酵生產丁二酸。
2.如權利要求1所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟1) 中將芭蕉芋塊莖切成0. 5 5mm厚的薄片，40 70°C烘至含水量14%以下或採用日曬晾 幹，然後粉碎至20 200目，得到芭蕉芋乾粉；或直接將新鮮芭蕉芋塊莖粉碎打漿，得到新 鮮芭蕉芋粉漿。
3.如權利要求1所述的利用芭蕉芋原料發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步 驟2)中液化和糖化操作具體步驟為將芭蕉芋乾粉或新鮮芭蕉芋粉漿加水浸泡1 3小 時，並調pH至6 7，再加入澱粉酶，然後在溫度60 110°C下液化20 40分鐘，得到芭 蕉芋液化醪；液化後降溫至40 70°C，並調pH至4 6，然後加入糖化酶，糖化8 16小 時，經過濾得芭蕉芋水解糖漿。
4.如權利要求1所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3) 中其他糖質原料為甘蔗糖蜜、澱粉原料物質水解糖漿、菊芋水解糖漿和秸稈水解糖漿中的 一種或一種以上的混合物，上述的澱粉原料物質包括玉米、小麥或木薯。
5.如權利要求1所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3) 中發酵培養基包括含有總還原糖濃度為20 120g/L的芭蕉芋水解糖漿、或芭蕉芋液化醪 或芭蕉芋水解糖漿與其他糖質原料的混合物，玉米漿5 50g/L，Na2HPO4 · 12H20 1 5g和 NaH2PO4 · 2H20 1 5g，且發酵培養基起始pH為5. 0 8. 0。
6.如權利要求1所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟 3)中琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)發酵生產丁二酸的發酵條件為按 1 % 10%的接種量接種，培養溫度30 40°C，維持發酵培養基pH5. 0 8. 0，並在充滿CO2 或N2的厭氧條件下發酵20 80小時。
7.如權利要求1所述的利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，其特徵在於所述的步驟3) 中琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)發酵採用分批發酵、補料發酵或雙邊 發酵生產丁二酸。
8.芭蕉芋原料在發酵製備丁二酸中的應用。
9.琥珀酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes)在以芭蕉芋為原料製備丁二酸 中的應用。
全文摘要
利用芭蕉芋發酵生產丁二酸的方法，屬於微生物發酵技術領域。本發明利用從肉牛瘤胃中篩選的琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesCGMCC1593，用其發酵芭蕉芋水解糖漿，或芭蕉芋液化醪，或芭蕉芋水解糖漿與其他一種或一種以上的糖質原料混合物，產物丁二酸濃度達40～66g/L，對糖產率70％～90％(糖利用率80％～95％)和生產強度達到0.9～1.2g/(L·小時)，很適用於低成本丁二酸的工業化生產。
文檔編號C12R1/01GK101948879SQ20101026836
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月26日 優先權日2010年8月26日
發明者劉宇鵬, 孫志浩, 林關羽, 白彥兵, 過鑫富, 陳萬河, 陳良 申請人:浙江杭州鑫富藥業股份有限公司