一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法及其應用的製作方法
2023-05-14 05:04:21
專利名稱：一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，尤其涉及一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法及其應用。
背景技術：
隨著不可再生的化石能源的日漸枯竭，越來越多的研究都集中到了新能源的開發和利用。生物質能由於其來源豐富，成本低廉和可再生性而備受青睞。纖維素作為地球上最為豐富的可再生資源，為生物質能提供豐富的來源。據報導，全球每年的光合作用產生的 纖維素總量可達IO11噸。但是，纖維素是由葡萄糖分子以1，4-糖苷鍵結合而成的線狀高分子聚合物。纖維素分子難以直接被利用，需經過降解成小分子糖類物質後才可被利用。纖維素可直接通過酸、鹼處理或通過酶法處理降解。酶法降解纖維素由於無汙染、低能耗的優點而逐漸取代酸、鹼處理方法。木質纖維素降解酶廣泛存在於自然界的生物體中，在食品、釀造行業、農副產品深加工、飼料、醫藥、環境保護和化工等領域有著非常廣闊的應用前景和應用潛力。因此，該方法製備的複合酶系具有廣泛的應用前景。國內外生產纖維素酶的方法普遍採用液體深層發酵和固態發酵。固態發酵通風效果不是很好，可操作性較差，不適合工業放大。液態發酵條件下用於產酶的碳源有微晶纖維素或紙漿，雖然酶活力較高，但是成本較高，環境汙染嚴重，不適合大規模生產；也有用廉價原料麩皮、稻草以及小麥秸杆，但是酶活力較低；還有用酸處理的玉米芯殘渣作為原料進行發酵，由於酸處理後的殘渣存在毒性副產物糠醛等，對菌體生長有抑制作用，因此，酶活力較低。現有的生產纖維素酶的生產方法都不能滿足在保證酶活力較高的同時又能夠製備出酶系比較全的需要。
發明內容
針對上述技術問題，本發明設計開發了一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法及其應用，目的在於製備同時含有纖維素酶和半纖維素酶的木質纖維素降解複合酶系，降低酶的生產成本，提高催化效率，減少對環境的汙染。本發明提供的技術方案為一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，包括以下步驟步驟一、活化裡氏木黴菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化後的裡氏木黴菌株或其衍生菌株製備成孢子懸液，接種於種子培養基中進行培養，溫度為28 30°C，轉速為17(Γ200轉/分的搖床上震蕩培養24 36h ；步驟三、將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發酵培養基中進行發酵罐培養。優選的是，所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，所述步驟三中將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基按照5 10%接種量接種至所述的發酵培養基中進行發酵罐培養。
優選的是，所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，按質量百分比計，所述發酵培養基包括碳源29Γ8%，有機氮源O.廣5%，無機氮源濃度為(Γ2%，無機鹽
O.OOOf 10%。優選的是，所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，按所述步驟三進行發酵罐培養時，pH調節為3. (Γ5. 0，溫度控制為2(T40°C，搖床轉速控制在10(Γ250轉/分，進行深層液態發酵，發酵時間為6(Γ200小時。優選的是，所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，所述碳源含量最佳為3% 5%。優選的是，所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，所述的發酵罐
體積為5L，且裝有3L發酵培養基。利用上述方法製備的一種複合酶系的應用，將所述複合酶系處理玉米芯和氣爆秸杆以及經NaOH常溫預處理的玉米秸杆。本發明所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，以少量微晶纖維素與玉米芯混合作為發酵培養基的碳源，因玉米芯來源廣泛、價格低廉，降低了生產成本。應用本方法得到的複合酶系中木聚糖酶活力顯著高於純微晶纖維素作為碳源的木聚糖酶的活力，纖維素酶活力有所降低。將利用本方法製備的複合酶系處理玉米芯和氣爆秸杆以及經NaOH常溫預處理的玉米秸杆，結果發現對玉米芯的水解效果高於微晶纖維素作為碳源的處理效果，對預處理的玉米秸杆還原糖含量也得到了一定的提高。本發明所述的製備方法中的原料不需要進行酸或者鹼等方法預處理，因此，製備過程中不會產生毒性副產物，製備的複合酶系在食品、釀造行業、農副產品深加工、飼料、醫藥、環境保護和化工等領域有著非常廣闊的應用前景和應用潛力。
圖1是本發明所述的複合酶系中纖維素酶活力和木聚糖酶活力隨發酵時間變化規律圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。本發明提供一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，包括以下步驟步驟一、活化裡氏木黴菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化後的裡氏木黴菌株或其衍生菌株製備成孢子懸液，接種於種子培養基中進行培養，溫度為28 30°C，轉速為17(Γ200轉/分的搖床上震蕩培養24 36h ；步驟三、將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發酵培養基中進行發酵罐培養。所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，所述步驟三中將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基按照5 10%接種量接種至所述的發酵培養基中進行發酵罐培養。所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，按質量百分比計，所述發酵培養基包括碳源2% 8%，有機氮源O.1 5%，無機氮源濃度為0 2%，無機鹽O. 0001 10%。所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，按所述步驟三進行發酵罐培養時，PH調節為3. (Γ5. 0，溫度控制為2(T40°C，搖床轉速控制在10(Γ250轉/分，進行深層液態發酵，發酵時間為6(Γ200小時。所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，所述碳源含量最佳為
3% 5%。所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法中，所述的發酵罐體積為5L，且裝有3L發酵培養基。利用上述方法製備的一種複合酶系的應用，將所述複合酶系處理玉米芯和氣爆秸 杆以及經NaOH常溫預處理的玉米秸杆。實驗材料本實驗中以裡氏木黴(Trichoderma reesei Rut C-30)購買於中國工業微生物菌種保存中心(CICC)，CICC13052。種子培養基包括微晶纖維素2%，玉米漿1. 5%，葡萄糖1%，調節pH為4. 5。本發明的發酵培養基以微晶纖維素和玉米芯作為碳源，其中玉米芯粉經粉碎機粉碎而成，玉米漿作為有機氮源，硫酸銨作為無機氮源，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣作為無機鹽成分，甘油作為菌種發酵初期的碳源。因此，所確定出的發酵培養基包括玉米漿1. 0 2· 5%, (NH4)2SCM O. 2 O. 8%, KH2PO4O^O. 6%, MgSO4 · 7Η20 0 0· 1%，CaCO3 0 0· 25%，甘油(TO. 25%，調節pH為4. (Γ5. O。其中，有機氮源還可以為酵母粉、蛋白腖；無機氮源還可以為氯化銨、硝酸銨。繪製葡萄糖和木糖的標準曲線，利用標準曲線測定本發明得到的複合酶系中的濾紙酶活和木聚糖酶活力。I)葡萄糖標準曲線的繪製配製10mg/ml葡萄糖母液,稀釋成2. O, 3. 3, 5. O和6. 7mg/ml的葡萄糖溶液樣品。取O. 5ml的葡萄糖溶液樣品加到Iml的O. 05M，pH4. 8的檸檬酸緩衝溶液中，再加3ml的DNS反應液，混勻，沸水浴加熱5min,冷卻至室溫。使用分光光度計測定于波長540nm下測定吸光度0D。以0D540為縱坐標，對應葡萄糖濃度為橫坐標，繪製標準曲線。2)木糖標準曲線的繪製配製O. OlM (=0. 15g/100ml 緩衝液)木糖母液，稀釋成 10、5、3· 33 和 2 μ mol/ml 的木糖溶液樣品。取O. 2ml木糖溶液樣品加到1. 8ml的木聚糖底物溶液中，添加3mlDNS反應液，混勻，沸水浴加熱5min，冷卻並離心，使用分光光度計于波長540nm下測定上清液吸光度0D。以0D540為縱坐標，對應木糖濃度為橫坐標，繪製標準曲線。3)濾紙酶活測定試管內添加1. Oml O. 05M, pH 4. 8檸檬酸鈉緩衝液，添加O. 5ml的稀釋酶液，加熱至50°C，添加一條濾紙條帶混合，50°C水浴反應60min，立即添加3. OmlDNS反應液混勻終止反應。沸水浴加熱5min，轉移至冷水浴，冷卻。取O. 45ml顏色反應後的混合液，加入2. Oml去離子水或蒸餾水，充分混勻。在540nm下讀取吸光度，由標準曲線讀取樣品的葡萄糖濃度。4)木聚糖酶活力測定
添加1. 8ml的底物溶液(用O. 05M, pH5. 3的檸檬酸緩衝液溶解，製備1%木聚糖懸浮液)和O. 2ml的稀釋酶液至試管內，50°C水浴反應5min，添加3. Oml的DNS反應液，混勻。沸水浴加熱5min,轉移樣品至冷水浴,然後離心沉澱未反應的底物。上清液於540nm處讀取樣品的吸光度，根據木糖標準曲線，將測定管的樣品的吸光度轉換為木糖的濃度。5)複合酶系的應用在50ml搖瓶中，加入5^15%的預處理或者未處理的底物，酶的裝載量為5 10FPU/g幹底物，在溫度為50°C，搖床轉速為150轉/分時，酶解48、6h，分別取樣1ml，離心取上清液，測定上清液中的總還原糖。實施例一將PDA斜面培養基上活化後的裡氏木黴菌株或其衍生菌株製備成孢子懸液，按照第一百分比的接種量接種於新鮮的種子培養基中進行培養。微晶纖維素和玉米芯以不同 的比例混合，取1. 5g不同混合比例原料加50ml發酵培養基溶液裝入250ml的三角瓶，於120°C滅菌15min，冷卻後接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基溶液，於28 30°C，150^220轉/分發酵5 7天，離心取上清液測定纖維素酶和木聚糖酶活力。結果如表I所示，當微晶纖維素和玉米芯以2:8的比例混合時，纖維素酶活力為純微晶纖維素作為碳源時的94.6%，木聚糖酶活力為純微晶纖維素作為碳源時的10倍。因此，選用微晶纖維素和玉米芯的最佳配比為1:4進行下面實施例的實驗。表I玉米芯替代部分微晶纖維素對複合酶系發酵的影響以及水解效果
微晶纖維素相對濾紙酶活相對木聚糖酶活力
_玉米芯__(%)__(%)
0871.296511:883·38737
2:8 94.94 1087 3:8 95.72 996 4:8 96.83 993 _3.3； O_100,00_100實施例二按照實施例一中的實施方式，將活化後的裡氏木黴菌株及其衍生菌株接種於種子培養基中培養，然後接入含有150g/L的混合原料的3L發酵培養基溶液並裝入51發酵罐中發酵，發酵結束測定纖維素酶活力和木聚糖酶活力，結果見圖1，纖維素酶活力在96h後達到9. 7IU/ml，木聚糖酶活力在132h達到3000IU/ml。實施例三將實施例二中製備的粗酶液處理玉米芯、氣爆秸杆，未添加β -葡萄糖苷酶粗酶液，底物濃度為5%，酶的裝載量是5 10IU/g底物，水解體系是20ml的pH4. 8,0. 05M的檸檬酸緩衝溶液，水解時間為48h。如表2所示，其中，酶液I為微晶纖維素和玉米芯作為碳源的發酵培養基，酶液2為微晶纖維素作為碳源的發酵培養基，酶液I對玉米芯的水解效果是33g/L，為酶液2水解效果的1. 59倍，氣爆秸杆作為底物時兩種酶液的水解效果差別較小。表2不同配比的酶活性比較和不同底物水解試驗結果
權利要求
1.一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟一、活化裡氏木黴菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化後的裡氏木黴菌株或其衍生菌株製備成孢子懸液，接種於種子培養基中進行培養，溫度為28 30°C，轉速為17(Γ200轉/分的搖床上震蕩培養24 36h ；步驟三、將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發酵培養基中進行發酵罐培養。
2.如權利要求1所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，其特徵在於，所述步驟三中將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基按照5 10%接種量接種至所述的發酵培養基中進行發酵罐培養。
3.如權利要求1所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，其特徵在於，按質量百分比計，所述發酵培養基包括碳源29Γ8%，有機氮源O. 1飛％，無機氮源濃度為(Γ2%， 無機鹽 O. 000 Γ10%ο
4.如權利要求3所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，其特徵在於，按所述步驟三進行發酵罐培養時，PH調節為3. (Γ5. 0，溫度控制為2(T40°C，搖床轉速控制在 100^250轉/分，進行深層液態發酵，發酵時間為6(Γ200小時。
5.如權利要求4所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，其特徵在於，所述碳源含量最佳為39Γ5%。
6.如權利要求1所述的高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法，其特徵在於，所述的發酵罐體積為5L，且裝有3L發酵培養基。
7.一種利用權利要求1所述的方法製備的複合酶系的應用，其特徵在於，將所述複合酶系處理玉米芯和氣爆秸杆以及經NaOH常溫預處理的玉米秸杆。
全文摘要
本發明公開了一種高效降解木質纖維素的複合酶系的製備方法及其應用，其特徵在於，包括步驟一、活化裡氏木黴菌株或其衍生菌株；步驟二、將活化後的裡氏木黴菌株或其衍生菌株製備成孢子懸液，接種於種子培養基中進行培養，溫度為28~30℃，轉速為170~200轉/分的搖床上震蕩培養24~36h；步驟三、將接種裡氏木黴菌株或其衍生菌株的種子培養基接種至以微晶纖維素和玉米芯為碳源且混合比為1:4的發酵培養基中進行發酵罐培養。並將所述複合酶系處理玉米芯和氣爆秸稈以及經NaOH常溫預處理的玉米秸稈。本發明所述的方法提高了複合酶系的糖化水解能力，降低了酶的製備成本，對環境的汙染較小。
文檔編號C12P19/14GK102994481SQ201210515988
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日
發明者武改紅, 陳樹林, 馬立娟, 張東遠, 李德茂, 馬延和 申請人:天津工業生物技術研究所