新的噬菌體粘附蛋白的製作方法

2023-05-13 18:20:36

專利名稱：新的噬菌體粘附蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種結合革蘭氏陰性細菌O-抗原的噬菌體粘附蛋白，其缺少結合噬 菌體和水解脂多糖的能力。本發明還涉及一種核酸分子其包括編碼本發明蛋白質的序列。 此外，本發明涉及產生本發明的噬菌體粘附蛋白的方法。本發明還涉及所述蛋白質的用途 以及檢測、純化和富集細菌的方法。
背景技術：
噬菌體是高度特異的病毒，其僅侵染細菌。侵染時，噬菌體利用粘著結構來與它們 的細菌宿主結合。噬菌體的特異性由其自身的一系列蛋白質來定義，所述一系列的蛋白質 對於與目標細胞的結合是重要的。噬菌體-細菌體系在自然界中已經進化了相當長的時 間，因此噬菌體以高特異性的方式識別它們的宿主細菌，並且具有高水平的結合親和性。噬菌體特異地結合到細菌上是由於噬菌體粘附蛋白所引起的。噬菌體粘附蛋白特 異地結合到位於細菌表面的不同的一群受體上。這些細菌表面受體可以為脂多糖成分，特 別是革蘭氏陰性細菌中的0-抗原或LPS核以及革蘭氏陰性細菌表面的是莢膜多糖的K-抗 原，革蘭氏陽性細菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸質成分，細菌的膜結合型蛋白，特殊細 菌的突起物例如鞭毛、菌毛或傘部，或胞外成分例如被膜或粘液層，糖類，多糖基質，表面蛋 白質層或細胞壁結合型蛋白。一些噬菌體粘附蛋白有酶活性，例如0-抗原或K-抗原結合 蛋白，而另外一些沒有酶活性，例如噬菌體粘附蛋白結合膜結合型細菌蛋白質。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌外膜的一部分，其由脂質Α、核心區和0-抗原形 成。0-抗原是細菌脂多糖最外表面暴露的部分，其由寡糖的重複單元形成，脂質A為錨定在 外膜或革蘭氏陰性細菌內的區域。與脂質A和核心區相比，0-抗原是細菌脂多糖中變化最 多的部分。0-抗原結構中的巨大變化(幾百種變體)提供了將對細菌的檢測深入到血清群 (serogroup)水平的一種根據。傳統的細菌檢測利用抗體來區分接近地相關菌株。例如， 目前在本領域中，利用不同的抗血清已經將沙門氏菌屬分為具有67種不同的0-抗原的46 種血清群(一些血清群被定義為多於一種的0-抗原的組合)。大腸桿菌資料庫(EC0DAB; Stenutz et al. ,2006, FEMS Microbiol. Rev. 30,382-403)列出了 178 種不同的 0-抗原。 通常通過利用大腸桿菌的抗血清的經典凝集方法來鑑定大腸桿菌的血清型。天然存在的噬 菌體利用細菌表面上的不同的受體來吸附到細菌細胞上。噬菌體粘附蛋白包括至少兩個功能域，其中N-端區域與噬菌體結合，C-端區域與 細菌表面的受體結合。當噬菌體粘附蛋白有酶活性，例如水解細菌的0-抗原或K-抗原時， 該C-端區域也包含活性位點。然而，噬菌體粘附蛋白常包括多個域的模塊式排列，經常可 以觀察到不同功能部分的同源性有不同。在結合之後，結合0-抗原的噬菌體粘附蛋白顯示出水解脂多糖0-抗原的水解活 性。所述脂多糖的水解是噬菌體侵染時多糖層侵入過程中的一部分。涉及噬菌體侵染的另 一個過程是所謂的「表面行走(surface walk)」過程。正在侵染的細菌進行所述的「表面 行走」以找到適合於DNA注入的位於細菌表面的位點。上述兩個生物學過程(多糖侵入和 「表面行走」)均包括噬菌體的反覆結合和釋放。因此，所述噬菌體粘附蛋白和細菌表面的0-抗原的結合是由所述噬菌體粘附蛋白的水解活性所引起的可逆的結合。高水平的結合親和性使得噬菌體粘附蛋白可以用作「生物吸附劑」，實現無論是在 自然界中存在的複雜環境中，還是在生物學樣品例如食品中均可以特異性地結合細菌。到目前為止，已經有不同的針對噬菌體粘附蛋白用作生物吸附劑的實際應用，例 如檢測和鑑定單一菌株或細菌群，或者純化細菌細胞和細胞成分。快速和準確的檢測細菌是用來診斷和治療人類和動物中的細菌傳染，以及啟動預 防措施的第一主要步驟。另外，所述檢測對於控制原料和已加工食品的衛生和質量是有用 的，並且對於監控飲用水、工業用水和公共浴室用水的衛生和質量方面是有用的。此外，所 述檢測對於過程監控和最優化，以及環境分析中的質量控制也是有用的。EP1198713A2和EP1356080A1描述了用於檢測和鑑定單一菌株和細菌群的方法， 其中將整個噬菌體或噬菌體蛋白質偶聯在支撐物上。在對偶聯的噬菌體或噬菌體蛋白質與 測試樣品進行溫育後，可以檢測出結合到噬菌體或噬菌體蛋白質上的樣品中的細菌。當用在微生物檢測體系時，在細菌檢測和鑑定方面，噬菌體粘附蛋白提供了大量 優於其它生物吸附劑(例如抗體)的優點，例如優異的特異性和出眾的結合性。特異性越 高越可以降低假陽性和假陰性的數量，並且目標結合性越好可以提供的信號比噪音的比值 越好。另外，噬菌體粘附蛋白可以被固定於任何表面並且可以容易地與其它分子(例如熒 光標記)偶聯。已經證實了噬菌體粘附蛋白在多種不同的應用中可以提供良好的表現，即 使是面對要求最為嚴格和複雜的食品領域。此外，細菌細胞和細胞成分的純化對於幾乎任何後續加工、分析或細胞成分的分 離均是非常重要的。EP1399551A2描述了用於純化細菌細胞和細胞成分的方法，其中含有細 菌細胞或細胞成分的樣品與整個噬菌體或噬菌體蛋白質接觸。然後，所述細菌細胞或細胞 成分以及噬菌體或噬菌體蛋白質的樣品與固體支撐物一起溫育。溫育之後，固體支撐物可 以從樣品中分離，從而也將細菌細胞或細胞成分分離，該細菌細胞或細胞成分結合在噬菌 體或噬菌體蛋白質上，而噬菌體或噬菌體蛋白質結合在固體支撐物上。如EP1399551A2所述藉助噬菌體或噬菌體蛋白質對細菌細胞和細胞成分進行純 化，除了其它優點之外，該方法還可以自動地進行，並且因此可以整合到自動分析或分離方 法(例如質粒的純化)中。然而，在天然存在的噬菌體或噬菌體蛋白質以及細菌之間存在結合平衡，這歸因 於由噬菌體粘附蛋白的水解活性而產生的噬菌體粘附蛋白的可逆的結合。這個效果降低了 這類基於噬菌體的細菌分析方法的靈敏度。在本領域中已知的基於噬菌體的細菌分析方法中，噬菌體粘附蛋白通常是非常大 的蛋白，由多於1000個胺基酸的多肽鏈構成，其中所述噬菌體粘附蛋白由提供不同功能的 數個結構部分組成。噬菌體粘附蛋白的這種大小和數個結構部分的特點導致難以表達、純 化，分離並且保存所述的噬菌體粘附蛋白。噬菌體粘附蛋白的模塊區域排列還具有對蛋白 酶解敏感的風險，蛋白酶可以在噬菌體粘附蛋白的不同功能模塊之間降解。這樣的蛋白酶 降解引起噬菌體粘附蛋白性質的變化，並伴有蛋白質活性的喪失。因此，本發明的目的在於提供噬菌體粘附蛋白，其用於更有效地結合、富集、移除、 捕獲和檢測革蘭氏陰性細菌。在權利要求書中限定的發明主題解決了上述目的。


下面的附圖用來說明本發明。圖1為示出大腸桿菌0111 :B4的LPS的化學結構的示意圖。標記出代表LPS的三 個部分，即脂質A、核心區和0-抗原，η =重複單元的數量；H印=L-甘油-D-甘露糖-庚 糖；Gal =半乳糖；Glc =葡萄糖；KDO = 2-酮基-3-脫氧辛酸；NGa = N-乙醯基-半乳糖 胺；NGc = N-乙醯基葡糖胺。圖2示出了 P22尾部刺突(tail spike)和Det7尾部刺突(SBPl)的胺基酸序列的 比對。相同的胺基酸殘基用「*」表示，具有密切相關側鏈的胺基酸殘基用「」表示，不太密 切相關的胺基酸殘基用「.」表示。兩個序列之間顯示高度同源性的胺基酸序列用下劃線標 出。用黑體字體指出Det7尾部刺突的S152，其為N-端截短變體(N-terminally truncated variant)的第一個胺基酸殘基，參與活性位點的三個胺基酸殘基用斜黑體來表示。圖3示出了 ε 15尾絲和Det7 0RF790公認尾部蛋白(SBP2)的胺基酸序列的比對。 相同的胺基酸殘基用「*」表示，具有密切相關側鏈的胺基酸殘基用「」表示，不太密切相關 的胺基酸殘基用「.」表示。兩個序列之間顯示高度同源性的胺基酸序列用下劃線標出。用 黑體字體指出Det7 0RF790公認尾部蛋白的S252，其為N-端截短變體的第一個胺基酸殘 基。參與活性位點的D485用斜黑體來表示。圖4示出了 P22尾部刺突和噬菌體14尾部刺突的胺基酸序列的比對。相同的氨 基酸殘基用「*」表示，具有密切相關側鏈的胺基酸殘基用「」表示，不太密切相關的胺基酸 殘基用「.」表示。兩個序列之間顯示高度同源性的胺基酸序列用下劃線標出。用黑體字體 指出噬菌體14尾部刺突的K108，其為N-端截短變體的第一個胺基酸殘基。參與失活作用 的酸性胺基酸殘基E171、D433和D435用斜黑體來表示。圖5示出了 ε 15尾絲和0157_ΒΡ1的胺基酸序列的比對。相同的胺基酸殘基用 「*」表示，具有密切相關側鏈的胺基酸殘基用「」表示，不太密切相關的胺基酸殘基用「.，， 表示。兩個序列之間顯示高度同源性的胺基酸序列用下劃線標出。用黑體字體指出0157_ BPl的V 163，其為N-端截短變體的第一個胺基酸殘基。參與活性位點的D463用斜黑體來表不。圖6示出了 ΗΚ620尾部刺突和0111_ΒΡ1的胺基酸序列的比對。相同的胺基酸殘 基用「*」表示，具有密切相關側鏈的胺基酸殘基用「」表示，不太密切相關的胺基酸殘基 用「.」表示。兩個序列之間顯示高度同源性的胺基酸序列用下劃線標出。用黑體字體指出 0111_ΒΡ1的Κ108，其為N-端截短變體的第一個胺基酸殘基。與酶失活相關的D204、D277、 D302、D332、E337、D345、E354、E357、E415、D471、E476、D477、E482 和 D492 用斜黑體來表示。圖7為銀染色的"Tris-Tricin梯度凝膠，其示出了 wt_Det7 0RF790與N-端截短且 失活的變體 Det7 0RF790(A2-251,D485N)對列剋星敦沙門氏菌(Salmonella Lexington) LPS的水解結果的比較。M為多肽分子量標記，LPS表示分離的、且未加入噬菌體尾部蛋白的 脂多糖，wt表示分離的、且加入了有酶活性的野生型Det7 0RF790尾部刺突的脂多糖，Det7 0RF790(A2-251,D485N)表示分離的、且加入了具有失活突變D485N的N-端截短變體的脂 多糖。各自的溫育時間用其下方標註的小時數來表示。「1」表示噬菌體粘附蛋白的條帶， 「2」表示在製備LPS過程的蛋白質雜質的條帶。
圖8為考馬斯染色的SDS凝膠，其示出了 Det7尾部刺突SBPl的三個N-端截短失 活變體在表達、可溶性和SDS穩定性組合測試中的結果。「M」表示的泳道為分子量標記，分 子量的大小在左邊的空白處給出。「P」表示不可溶的沉澱組分，「_」表示在上樣之前未被煮 沸的可溶的蛋白質組分。「 + 」表示在上樣之前被煮沸的可溶的蛋白質組分。凝膠上方給出 了表達溫度30°C或37°C，以及樣品經IPTG誘導(+IPTG)或未經IPTG誘導(-IPTG)。在右 邊的空白處表示出蛋白條帶屬於單體(-M)或抗SDS三聚體(-T)。泳道1 8表示突變體 SBP1(A2-151)E406Q，道 9 16 表示突變體 SBPl ( Δ 2-151) D437N，泳道 17 24 表示突變 # SBP1( Δ 2-151)D440No圖9為考馬斯染色的SDS凝膠，其示出了融合了不同N-端標籤的0157_BP1的截 短和失活形式在表達、可溶性和SDS穩定性組合測試中的結果。「M」表示的泳道為分子量 標記，分子量的大小在左邊的空白處給出。「P」表示不可溶的沉澱組分，「_」表示在上樣之 前未被煮沸的可溶的蛋白質組分。「 + 」表示在上樣之前被煮沸的可溶的蛋白質組分。所有 的蛋白質均為截短八2-162，且具有胺基酸突變0463仏泳道2 4表示未經誘導的大腸杆 菌蛋白質背景，泳道5 7表示具有N-端Mi^p-標籤的0157BP1，泳道8 10表示具有 N-端JS-標籤的0157_BP1，泳道11 13表示具有N-端Cys-標籤的0157_BP1，所有均經 IPTG誘導。兩個箭頭標記出噬菌體粘附蛋白的SDS抗性寡聚形式(上箭頭)和噬菌體粘附 蛋白的單體形式(下箭頭)的位置。圖10為示出利用Det7尾部刺突SBPl ( Δ 2-151 ；D437N)特異性捕獲血清群Dl和 B的沙門氏菌屬菌株的細菌細胞的結果的圖。數據棒示出使用環氧偶聯SBPl的磁珠(白色 數據棒)或甲苯磺醯基偶聯SBPl的磁珠(深色數據棒)從樣品中捕獲的細胞的百分數。圖11為示出利用0157_ΒΡ1按與ELISA形式類似的分析方法對大腸桿菌0157細 胞進行檢測的結果的圖。用細菌細胞的比色檢測數據G05nm處的吸光度)對樣品中細菌 細胞的濃度(微量滴定板每孔的cfu)作圖。顯示了在添加了 Iyg的0157_BP1作為特異 的噬菌體粘附蛋白的樣品溫育90分鐘後的顏色變化(黑色數據棒)，並用未添加0157_BP1 的微量滴定板的背景吸光度作為對照(灰色數據棒)。圖12為銀染色的Tris-Tricin梯度凝膠，其示出了 wt-0111_BP1與N-端截短和 失活變體0111_ΒΡ1(Δ2-107)對大腸桿菌0111 LPS的LPS水解結果的比較，變體0111_ BPl ( Δ 2-107)包括如下突變:D204N 或 D277N 或 E337Q 或 E415Q 或 D471N 或 E482Q 或 D492N 或雙突變E476Q/D477N。M為多肽分子量標記，LPS表示分離的、且未加入脂多糖噬菌體尾 部蛋白的脂多糖，wt表示分離的、且加入了有酶活性的野生型0111_BP1的脂多糖。「+LPS」 表示在樣品中存在分離的脂多糖和噬菌體粘附蛋白，「-LPS」表示僅存在噬菌體粘附蛋白的 對照。還標註了它們各自的溫育時間(用小時表示)。圖13為SDS-聚丙烯醯胺凝膠，其示出了於37 °C用蛋白酶K水解1小時Det7 0RF790(D485N)的有限蛋白酶解的結果。「Μ」為分子量標記。道1 6表示經蛋白酶降解的 結果，其中蛋白酶K以如下比例加入蛋白酶K比噬菌體粘附蛋白的摩爾比為3Χ10_5 1 ； 3 Χ10-4 1;3Χ10_2 1 ；0.3 1或3 1。「_1」標註出全長噬菌體粘附蛋白條帶的位 置，「_2」標註出經有限蛋白酶解產生的N-端截短變體的條帶，其通過N-端測序被確定為 Det7 0RF790(Δ 2-320 ；D485N)。圖14示出了使用經噬菌體粘附蛋白塗覆的磁珠或經抗體塗覆的磁珠捕獲沙門氏菌屬細胞的效率的比較。圖中給出了利用Det7尾部刺突SBP1(A2-151，D437N)(黑 色數據棒)或利用抗體塗覆的Dynabead抗沙門氏菌型(灰色數據棒)的相對捕獲效率。 「1」表示鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)(血清群B)，「2」表示布蘭登堡沙門 氏菌(Salmonella Brandenburg)(血清群B)，「3」表示海德爾堡沙門氏菌(Salmonella Heidelberg)(血清群B)，以及「4」表示腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)(血清群 Dl)。圖15為示出利用0111_BP1 wt和0111_ΒΡ1 ( Δ 2-107)的比色法大腸桿菌的6檢 測分析方法的結果的圖。該oNPG(鄰-硝基苯基-β D-吡喃半乳糖苷)測試利用大腸桿菌 自身的半乳糖苷酶活性來進行檢測。圖中給出了利用0111_ΒΡ1塗覆的磁珠捕獲細胞 的信號除以利用未塗覆的磁珠捕獲細胞的信號得到的信號比率(測定425nm處的吸光度)。 黑色的數據棒代表用0111_ΒΡ1(Δ2-107)塗覆的磁珠，灰色數據棒代表用0111_BP1 wt塗 覆的磁珠。數據棒下方的數字表示來自不同的大腸桿菌0 菌株的PROFOS培養物的菌株 編號。圖16示出了屬於組P22、印silon 15和Det7的不同尾部刺突蛋白的比對結果。白 色棒表示已經被除去的同源殼體結合域。灰色棒表示LPS-結合域(實驗顯示或預測的)。 黑色棒表示三聚化的域。LPS-結合域中的黑線表示用於除去水解活性的突變的位點。基於 同源性和在 P22tsp、14tsp、0111 Bp9、E15、0157 BPl、Det7tsp SBPl 和 Det7 0RF790 SBP2 中的有效突變的位置，預測了新家族成員0103，026和0145的突變區域(背景中的暗灰色 區域)。

發明內容
用於本文的術語「噬菌體(bacteriophage或phage) 」表示僅可以在細菌中感染並
繁殖的病毒。用於本文的術語「噬菌體粘附蛋白(bacteriophage adhesion protein)」表示特 異地結合細菌表面受體的噬菌體蛋白質。噬菌體粘附蛋白至少包括兩個功能域，其中一個功能域為與噬菌體結合的噬菌體 結合域，第二個域與細菌表面受體結合。噬菌體粘附蛋白中的一些有酶活性，例如0-抗原 或K-抗原結合蛋白，其它的一些沒有酶活性，例如與膜結合型細菌蛋白結合的噬菌體粘附 蛋白。具有酶活性的噬菌體粘附蛋白的酶活性位於與細菌表面受體結合的功能域中。該 酶活性優先為水解活性。噬菌體粘附蛋白包括噬菌體尾部刺突(tail spike)、尾絲(tail fiber)、尾釘(tail pin)和參與結合細菌表面的其它尾部蛋白。然而，術語噬菌體粘附蛋白 不包括不參與細菌結合的結構性尾部蛋白，例如尾鞘蛋白、鉸鏈區的尾部蛋白、基片蛋白、 頸蛋白。用於本文的術語「細菌表面受體」是指脂多糖成分，特別是指革蘭氏陰性細菌中的 0-抗原或LPS核；革蘭氏陽性細菌中的肽聚糖或磷壁酸或脂磷壁酸的成分；細菌的膜結合 型蛋白；特殊的細菌突起物(protrusion)例如鞭毛、菌毛或傘毛；或胞外成分例如包膜或 粘液層、糖類、多糖基質(polysaccharide matrices)、表面蛋白質層或細胞壁結合型蛋白。 一些革蘭氏陰性細菌在其表面也展示K抗原(為莢膜多糖)，其也屬於術語「細菌表面受 體」。
用於本文的術語「0-抗原」是指革蘭氏陰性細菌的細胞表面上的菌體抗原。該 0-抗原是細菌脂多糖在最外表面暴露的部分。其由重複的具有不同長度的寡糖單元組成， 每個單元通常具有2 7個糖分子(sugar moiety)。用於本文的術語「野生型(wild-type) 」或「wt」是指蛋白質或核酸天然存在的形 式，其沒有經人為介入修飾。術語野生型主要是指多肽或核酸序列。用於本文的術語「噬菌體結合域(bacteriophage binding domain) 」是指野生型 噬菌體粘附蛋白的域，其負責噬菌體粘附蛋白與噬菌體的結合。用於本文的術語「大腸菌(coliform) 」是指腸細菌(enterobacteria)的亞組，其 顯著的特徵在於它們分別利用乳糖以及表達酶β-半乳糖苷酶。用於本文的術語「變體」是指核苷酸或胺基酸序列，其指野生型序列展示有以一個 或多個胺基酸或核苷酸的缺失、取代、增加、翻轉和/或化學修飾形式的修飾。例如，連接蛋 白質的術語「 Δ 2-107」表示胺基酸2 107的缺失。原始蛋白質的胺基酸108是蛋白質變 體在專性甲硫氨酸(起始密碼子)之後的第一個胺基酸。就取代和突變而言，分別地，例如 術語「D204N」表示將位於204位的原始胺基酸D替換為位於蛋白質變體中的204位的N，其 中，除非另外說明，位置204是指在野生型序列中的胺基酸位置。用於本文的術語「片段」是指胺基酸序列和核苷酸序列的一部分，其編碼只要顯示 出根據本發明的包含胺基酸序列的多肽的生物學功能的那些胺基酸序列。用於本文的術語「特異性(specificity) 」是指噬菌體粘附蛋白僅識別和結合單一 的屬、種、或亞種、或細菌細胞的血清型或菌株、或細胞成分。用於本文的術語「捕獲(capture)」、「富集(enrichment)」或「純化 (purification)」是指從含水溶液中特異分離細菌細胞或細胞成分，例如從培養基(其中 含有細菌細胞或細胞成分)，或存在於自然界中的環境樣品，或生物學樣品例如食品中特異 分離。捕獲、純化或富集可以藉助於固體支撐物來進行，例如磁性顆粒、玻璃顆粒、瓊脂糖顆 粒、膠乳顆粒、反應管、移液管吸頭、微量滴定板、膜、過濾介質、色譜介質，或通過離心來進 行。用於本文的術語「細菌細胞成分」是指細菌的所有成分包括細菌脂多糖或細菌 0-抗原或它們的片段，例如由重複的0-抗原單元形成的多糖或寡糖。本發明涉及特異性結合革蘭氏陰性細菌的0-抗原的噬菌體粘附蛋白，其中，與其 野生型相比所述噬菌體粘附蛋白缺少與噬菌體結合的能力和水解脂多糖的能力。所述噬菌 體粘附蛋白可以包括突變和/或缺失。所述缺失可以包括噬菌體結合域和/或酸性胺基酸 突變為非酸性胺基酸，特別是1 7、1 6、1 5、1 4、1 3或1 2個酸性胺基酸突 變為非酸性胺基酸，以及更具體的是一個酸性胺基酸突變為非酸性胺基酸。本發明還涉及噬菌體粘附蛋白，其包含標誌物分子(marker moiety)(優選生物素 或鏈黴抗生物素)或標籤(tag)(優選HA-標籤、His-標籤、Str印-標籤、Avi-標籤、Myc-標 籤、GST-標籤、JS-標籤或半胱氨酸-標籤)。優選地，所述噬菌體粘附蛋白具有SEQ ID N0 2、4、5、7、9、11 14,36 42,56或58的胺基酸序列。本發明的噬菌體粘附蛋白本發明的噬菌體粘附蛋白優選特異地結合革蘭氏陰性細菌的0-抗原，並且與其 野生型相比，其缺乏與噬菌體結合的能力以及顯示出降低的水解脂多糖的能力。
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尤其優選這樣的噬菌體粘附蛋白，其與革蘭氏陰性細菌特異性結合，所述革蘭氏 陰性細菌為下述包括人類或動物的治病菌株的細菌群(group)、科、屬或種的細菌，例如 腸桿菌科(埃希氏菌屬(尤其是大腸桿菌)、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、愛德 華氏菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、克雷伯氏菌屬、摩根氏菌屬、變形菌屬、普羅威登斯菌屬、 沙雷氏菌屬、耶爾森氏菌屬)；假單胞菌科(假單胞菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、寡養單胞菌 屬、希瓦氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、叢毛單胞菌屬)；奈瑟氏球菌屬；莫拉氏菌屬；弧菌屬；氣 單胞菌屬；布魯氏菌屬；弗朗西絲菌屬；博德特氏菌屬；軍團菌屬；巴爾通氏體屬；考克斯 氏體屬；嗜血菌屬；巴斯德氏菌屬；溶血性曼氏桿菌屬(Marmheimia)；放線桿菌屬；加德納 氏菌屬；螺旋體科(密螺旋體屬和疏螺旋體屬)；鉤端螺旋體科；彎曲桿菌屬；螺桿菌屬；螺 菌屬；鏈桿菌屬；擬桿菌科(擬桿菌屬、梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬；卟啉單胞菌屬)。最優選 特異結合大腸桿菌或沙門氏菌屬的噬菌體粘附蛋白。尤其優選特異結合沙門氏菌屬的噬菌 體粘附蛋白，例如SEQ ID N0:l、3、6和55的經修飾的蛋白質。優選特異結合大腸桿菌的噬 菌體粘附蛋白有SEQ ID NO :8、10、60、62、64、66、68、70、72和74的經修飾的蛋白質。優選的噬菌體粘附蛋白來源於感染上述革蘭氏陰性細菌的噬菌體的野生型噬菌 體粘附蛋白，特別優選來自下組的噬菌體短尾噬菌體科(podoviridae)、肌尾噬菌體科 (myoviridae)和長尾噬菌體科(siphoviridae)，更具體來說優選的噬菌體為Ρ22、ε 15、 Sf6、HK620、Tl、T5、T7、噬菌體 14、gifsy、P2、phiV10、APSE_l、Al、A18a、ST104、ST64T、JK106 或 Gifsy0進一步優選的噬菌體粘附蛋白來源於具有N-端同源性的噬菌體的野生型噬菌體 粘附蛋白，即胺基酸序列的N-端部分，在多於至少50個連續的胺基酸殘基上，與下列噬菌 體的噬菌體粘附蛋白的序列同源性至少為30 %，優選為60 %，更優選為70 %、80 %、90 %、 95%和 98%，上述噬菌體為噬菌體 P22、ε 15、Sf6, ΗΚ620、Tl、Τ7、噬菌體 14、PhiVlO, APSE-l、Al、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、0157、0111 或 Gifsy，並且其與各噬菌體粘附 蛋白在不涉及噬菌體結合的蛋白質的C-端部分的胺基酸序列上，同源性小於30%。還優選 噬菌體粘附蛋白來源於具有C-端同源性的噬菌體的野生型噬菌體粘附蛋白，即胺基酸序 列的C-端部分，在多於至少150個連續的胺基酸殘基上，與下列噬菌體的噬菌體粘附蛋白 的序列同源性至少為30 %，優選為60 %，更優選為70 %、80 %、90 %、95 %和98 %，上述噬菌 體為噬菌體 P22、ε 15、Sf6, ΗΚ620、Tl、Τ7、噬菌體 14、PhiVlO, APSE-I、Al、A18a、ST104、 ST64T、JK106、Det7、0157、0111或Gifsy，並且其與各噬菌體粘附蛋白在不涉及噬菌體結合 的蛋白質的N-端部分的胺基酸序列上，同源性小於30%。還優選的噬菌體粘附蛋白與下 述噬菌體的噬菌體粘附蛋白在全部胺基酸序列上的序列同源性為至少30%，優選為60% 或更優選為70%、80%、90%、95%、98%，上述噬菌體為噬菌體P22、ε 15、Sf6、HK620、Tl、 T7、噬菌體 14、PhiVIO、SPSE-1、Al、A18a、ST104、ST64T、JK106、Det7、0157、0111 或 Gifsy0在本發明的一個實施方式中，噬菌體粘附蛋白與噬菌體P22或ε 15具有如上所述 的N-端同源性。優選的噬菌體粘附蛋白與SEQ ID Ν0:53的ρ22尾部刺突的野生型噬菌體 粘附蛋白具有如上所述的N-端同源性，或者與SEQ ID Ν0:55的ε 15側尾絲(side tail fiber)的野生型噬菌體粘附蛋白具有如上所述的N-端同源性。特別優選的噬菌體粘附蛋白來源於表1列出的野生型噬菌體粘附蛋白。表1
權利要求
1.特異性結合革蘭氏陰性細菌0-抗原的噬菌體粘附蛋白，其中所述噬菌體粘附蛋白 與其野生型相比缺少結合噬菌體和水解脂多糖的能力。
2.權利要求1所述的噬菌體粘附蛋白，其包括突變和/或缺失。
3.權利要求2所述的噬菌體粘附蛋白，其包括噬菌體結合域的缺失和/或包括酸性氨 基酸突變為非酸性胺基酸，特別是1 7個、1 6個、1 5、1 4個、1 3個或1 2個 酸性胺基酸突變為非酸性胺基酸，以及更具體的是一個酸性胺基酸突變為非酸性胺基酸。
4.上述權利要求中的任一項所述的噬菌體粘附蛋白，其包括標誌物分子或標籤，所述 標誌物分子優選生物素或鏈黴抗生物素，所述標籤優選HA-標籤、His-標籤、Strep-標籤、 Avi-標籤、Myc-標籤、GST-標籤、JS-標籤或半胱氨酸-標籤。
5.噬菌體粘附蛋白，其具有SEQID NO :2、4、5、7、9、11 14、36 42、56或58的氨基 酸序列；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :60被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 161的N-端、且具有D332突變為N、D341突變為N、D345突變為N、E365突變為Q、D381突 變為N、E392突變為Q、D402突變為N、D405突變為N、E411突變為Q、D417突變為N、D428 突變為N、D431突變為N、E444突變為Q、E456突變為Q、D459突變為N、E483突變為Q、E500 突變為Q、E518突變為Q或D519突變為N中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :62被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 161的N-端、且具有D332突變為N、D341突變為N、D345突變為N、E365突變為Q、D381突 變為N、E392突變為Q、D402突變為N、D405突變為N、E411突變為Q、D417突變為N、D428 突變為N、D431突變為N、E444突變為Q、E456突變為Q、D459突變為N、E483突變為Q、E500 突變為Q、E518突變為Q或D519突變為N中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :64被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 161的N-端、且具有D340突變為N、D344突變為N、E364突變為Q、D380突變為N、E391突 變為Q、D401突變為N、D404突變為N、E410突變為Q、D416突變為N、D427突變為N、D430 突變為N、E443突變為Q、E455突變為Q、D458突變為N、E482突變為Q、E499突變為Q、E517 突變為Q或D518突變為N中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :66被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 156的N-端、且具有突變為Q、D351突變為N、D358突變為N、E375突變為Q、E377突 變為Q、D383突變為N、D385突變為N、E393突變為Q、E401突變為Q、D446突變為N、E468 突變為Q、D487突變為N、E494突變為Q、D495突變為N、D496突變為N、E503突變為Q、E518 突變為Q或D523突變為N中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID N0:68具有D180突變為N、D186突變為N、D190 突變為N、D211突變為N、D241突變為N、E246突變為Q、D2M突變為Q、D261突變為N、D263 突變為N、D265突變為N、E266突變為Q、D301突變為N、E3M突變為Q、D333突變為N、E334 突變為Q、E336突變為Q、D339突變為Q或D357突變為N中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :70被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 169的N-端、且具有D344突變為N、D345突變為N、E351突變為Q、E356突變為Q、D362突 變為N、D398突變為N、E405突變為Q、D408突變為N、D412突變為N、E425突變為Q、E432 突變為Q、D435突變為N、D452突變為N、E498突變為Q、D509突變為N、E511突變為Q、D5^突變為N、E534突變為Q、E538突變為Q、E547突變為Q、D5M突變為N、D567突變為N、D573 突變為N、D595突變為N、E609突變為Q、D615突變為N或D636突變為N中的至少一個突 變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :72被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 107的N-端、且具有D178突變為N、D179突變為N、E185突變為Q、E190突變為Q、D196突 變為N、D232突變為N、E239突變為Q、D242突變為N、D246突變為N、E259突變為Q、E266 突變為Q、D269突變為N、D286突變為N、E332突變為Q、E345突變為Q、D363突變為N、E368 突變為Q、E372突變為Q、E381突變為Q、D388突變為N、D401突變為N、D407突變為N、D429 突變為N、E443突變為Q、D449突變為N或D470突變為N中的至少一個突變；或噬菌體粘附蛋白，其相對於SEQ ID NO :74被截去了從胺基酸殘基2直到胺基酸殘基 107的N-端、且具有D178突變為N、D179突變為N、E185突變為Q、E190突變為Q、D196突 變為N、D232突變為N，E239突變為Q、D242突變為N、D246突變為N、E259突變為Q、E266 突變為Q、D269突變為N、D286突變為N、E332突變為Q、E345突變為Q、D363突變為N、E368 突變為Q、E372突變為Q、E381突變為Q、D388突變為N、D401突變為N、D407突變為N、D429 突變為N、E443突變為Q、D449突變為N或D470突變為N中的至少一個突變。
6.核酸分子，其編碼根據上述權利要求中任一項所述的噬菌體粘附蛋白，優選如SEQ ID NO 43 51所示的序列。
7.載體，其編碼權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白。
8.宿主細胞，其被權利要求6所述的核酸分子或權利要求7所述的載體轉化。
9.產生權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白的方法，其包括以下步驟(a)識別噬菌體粘附蛋白的噬菌體結合域；(b)從包含編碼步驟(a)的噬菌體粘附蛋白的序列的核酸分子中刪除步驟(a)識別的 噬菌體結合域；(c)利用突變使噬菌體粘附蛋白的水解活性失活。
10.權利要求9所述的方法，其中在步驟(a)中，所述噬菌體結合域通過先進行胺基酸 比對，再確定所述噬菌體粘附蛋白相比另一種噬菌體粘附蛋白而言的N-端來識別，或其中所述噬菌體結合域通過用適於同源性釣取噬菌體結合域的引物擴增編碼該噬 菌體結合域的核酸序列來識別。
11.權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白的用途，用於結合、富集、移除、捕 獲和檢測革蘭氏陰性細菌。
12.檢測細菌的方法，其包括以下步驟(a)使權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白與支撐物偶聯；(b)將偶聯有所述噬菌體粘附蛋白的支撐物與樣品一起溫育；(c)任選除去樣品以及該樣品中未結合所述噬菌體粘附蛋白的細菌；(d)任選加入透化或破壞細菌膜的物質；以及(e)檢測樣品中與所述噬菌體粘附蛋白結合的細菌。
13.檢測細菌的方法，其包括以下步驟(a)使含有細菌細胞或細胞成分的樣品與權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附 蛋白接觸，優選溫育約1秒 20分鐘；(b)然後將含有細菌細胞或細胞成分和所述噬菌體粘附蛋白的樣品與固體支撐物一起 溫育，優選約1 60分鐘；(c)任選除去樣品以及該樣品中未結合所述噬菌體粘附蛋白的細菌；(d)任選加入透化或破壞細菌膜的物質；以及(e)檢測樣品中與所述噬菌體粘附蛋白結合的細菌。
14.權利要求12或13所述的方法的用途，用於檢測在醫藥、食品工業和分析、牲畜飼 養、新鮮水或環境分析中的細菌。
15.選擇性純化細菌細胞或細胞成分的方法，其包括以下步驟a)使含有細菌細胞或細胞成分的樣品與權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋 白接觸，優選溫育約1 20分鐘；b)隨後將所述樣品與固體支撐物一起溫育，其中所述樣品含有細菌細胞或細胞成分和 所述噬菌體粘附蛋白，優選溫育約1 60分鐘；c)從樣品中分離出結合有細菌細胞或細胞成分的固體支撐物，其中細菌細胞或細胞成 分通過所述噬菌體粘附蛋白結合到所述固體支撐物上。
16.富集和純化細菌細胞和/或細胞成分的方法，其包括下述步驟c)使含有細菌細胞和/或細胞成分的樣品與磁性支撐物相接觸，在所述磁性支撐物的 表面有權利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白，優選溫育約1 60分鐘；d)從樣品中分離出結合有所述細菌細胞和/或細胞成分的磁性支撐物。
17.—種試劑盒，其用來進行權利要求12、13、15或16所述的方法，所述試劑盒包括權 利要求1 5中任一項所述的噬菌體粘附蛋白，支撐物和用於檢測、純化或富集革蘭氏陰性 細菌和/或細胞成分的檢測試劑。
全文摘要
本發明涉及結合革蘭氏陰性細菌的O-抗原的噬菌體粘附蛋白，其缺乏結合噬菌體和水解脂多糖的能力。本發明還涉及核酸分子，其包括編碼本發明蛋白質的序列。另外，本發明涉及用來產生本發明噬菌體粘附蛋白的方法。本發明還涉及所述蛋白質的用途以及檢測、純化和富集細菌的方法。
文檔編號G01N33/569GK102099371SQ200980125992
公開日2011年6月15日 申請日期2009年7月3日 優先權日2008年7月4日
發明者史蒂芬·米勒, 曼弗雷德·比布爾, 莫尼卡·沃爾特, 雷納特·格拉斯爾 申請人:拜奧默裡克斯公司