一種利用數字pcr檢測食品中大腸菌群數量的方法
2023-05-14 03:14:26 1
一種利用數字pcr檢測食品中大腸菌群數量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用數字PCR檢測待測食品中大腸菌群數量的方法。該方法包括如下步驟：1）富集待測食品中的細菌，將富集物與DNA結合物共同孵育，獲得PCR擴增模板；所述DNA結合物為不能穿過完整的細胞膜，但能與細胞膜受損後暴露出來的DNA結合的物質；2）配製PCR反應體系，進行數字PCR反應；所述PCR反應體系中含有所述PCR擴增模板、大腸菌群通用引物對、螢光染料、dNTP和DNA聚合酶；3）根據反應產生的螢光信號，計算所述待測食品中的大腸菌群數量。本方法無需對食品中細菌進行分離培養，檢測時間短至3-4小時；同時減少了背景DNA和基質的幹擾，靈敏度低至1個拷貝；且該方法無需設置標準曲線，根據結果可直接判讀樣品中的大腸菌群數量，大大簡化了操作步驟。
【專利說明】—種利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於食品安全領域，涉及一種檢測食品中大腸菌群數量的方法，特別涉及一種利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的方法。
【背景技術】
[0002]民以食為天，食以安為先，食品安全關係到消費者的身心健康與財產安全。食品中的致病微生物是引發食品安全問題的重要原因之一，而大腸菌群是作為食品安全一個很重要的微生物指標，檢測食品中大腸菌群數是判斷樣品是否被人、畜糞便汙染及汙染程度的標誌，可以推測該食品中存在著腸道致病菌汙染的可能性，以及潛伏著食物中毒和流行病的威脅，是否對人體健康具有潛在的危險。所以各個國家都針對諸如肉、蛋、奶、飲料等各種食品中的大腸菌群數量制定了限定標準，並依法對各種食品的微生物含量進行抽查檢測。例如我國規定每100g鮮禽產品不能超過10000MPN，100ml巴氏殺菌乳中不能超過90個。由於食品基質複雜，食品中微生物數量較少，目前對食品中大腸菌群數量的檢測方法都要依賴於細菌培養，在培養的基礎上檢測，因此檢測時間需要1-2天完成。如目前的國標培養法需要48個小時才能完成，美國進口 3M大腸菌群測試片也需要24小時才能確認結果。對於講究鮮活的食品來講，檢測時間過長，大大影響了食品的供應，同時也降低了鮮活食品的質量。因此急需一種快速的食品中大腸菌群數量的檢測方法。
[0003]數字PCR是近年來迅速發展起來的一種定量分析技術。主要採用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋後的核酸溶液分散至晶片的微反應器或微滴中，每個反應器的 核酸模板數少於或者等於I個。這樣經過PCR循環之後，有一個核酸分子模板的反應器就會給出螢光信號，沒有模板的反應器就沒有螢光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統定量PCR技術不同的是數字PCR不依賴於擴增曲線的循環閾值(CT)進行定量，不受擴增效率的影響，也不必採用看家基因和標準曲線，具有很好的準確度和重現性，可以實現絕對定量分析。在現階段的低豐度因子含量檢測中，定量PCR、雜交等方法都因受到背景DNA或雜質的幹擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精細定量的要求(如定量PCR檢測中Ct值大於33的情況下，其重複性和準確性就不是很高)，而微滴式數字PCR檢測系統通過微滴化處理，使得稀有的待檢測片段從大量的背景DNA中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及精確性。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的方法。
[0005]數字PCR方法在檢測食品中大腸菌群數量中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0006]本發明所提供的利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的方法，具體可包括如下步驟:
[0007](I)富集待測食品中的細菌，將富集物與DNA結合物共同孵育，獲得PCR擴增模板；[0008]所述DNA結合物為不能穿過完整的細胞膜(活細菌)，但能與細胞膜受損(死細菌)後暴露出來的DNA結合的物質；
[0009](2)配製PCR反應體系，進行數字PCR反應；所述PCR反應體系中含有步驟(1)獲得的PCR擴增模板、大腸菌群通用引物對、螢光染料、dNTP和DNA聚合酶；
[0010](3)根據步驟(2)數字PCR反應產生的螢光信號，計算得到所述待測食品中的大腸
菌群數量。
[0011]在上述方法中，所述待測食品可為液體食品，也可為固體食品。如各種鮮活農產品及其加工食品、水以及飲料等。在本發明的一個實施例中，所述待測食品為奶，具體為牛奶，更加具體為生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶。
[0012]當所述待測食品為液體食品(如牛奶)時，上述方法的步驟(1)中，所述「富集待測食品中的細菌」可為將所述待測食品(如牛奶)離心，所得沉澱即為所述富集物(富集了待測食品中的細菌)。進一步，將所述待測食品(如牛奶)離心的轉速可為14000g，時間可為5-10min (如 IOmin),溫度可為 4°C。
[0013]在上述方法的步驟(1)中，將所述富集物與所述DNA結合物共同孵育的目的是為了讓所述DNA結合物與死細菌的DNA結合，從而阻斷死細菌DNA分子的PCR擴增，從而有效實現對活細菌的選擇性擴增。
[0014]在上述方法中，所述大腸菌群通用引物對具體為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對1，或者由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對2。
[0015]在上述方法中，所述DNA結合物具體可為疊氮溴化丙錠(PMA)或疊氮溴化乙錠(EMA)0
[0016]在上述方法中，所述突光染料具體可為SybGreen或EvaGreen。
[0017]在上述方法的步驟(2)中，進行所述數字PCR反應時的退火溫度可為58°C。進一步，在本發明中，進行所述數字PCR反應時的反應程序為:94°C預變性3min ;94°C 45S，50°C45S，72°C 605，5個循環；941: 45S，58°C 45S，72°C 60S，30 個循環；最後 72°C保溫 lOmin。
[0018]進一步，在步驟(1)中，所述DNA結合物(PMA或EMA)在孵育體系中的終濃度為
10μ g/mlο
[0019]在本發明的一個實施例中，上述方法的步驟(1)具體為:將20_50ml牛奶(生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶)4°C下14000g離心IOmin後，收集沉澱，用Iml生理鹽水重懸後加入DNA結合物(PMA或EMA)至其終濃度為10μ g/ml，25°C孵育20分鐘，然後4°C 14000g離心5min，用生理鹽水重懸沉澱至10-20微升，得到所述PCR擴增模板。
[0020]在上述方法的步驟(2)中，進行所述數字PCR反應時的反應體系中，所述大腸菌群通用引物對中兩條單鏈DNA分子的終濃度均為10 μ M0
[0021]具體的，在本發明的一個實施例中，上述方法的步驟(2)中，進行所述數字PCR反應時的反應體系(以總體積20微升為例)為:5微升所述PCR擴增模板，所述大腸菌群通用引物對中兩條單鏈DNA分子的終濃度均為10μM，l微升螢光染料(SybGreen或EVaGreen)，以及10微升PCR mix,餘量為水。所述PCR mix由dNTP、DNA聚合酶和PCR緩衝液組成，具體為Bio-rad公司產品，其產品目錄號為186-4035。
·[0022]在上述方法中，進行所述數字PCR反應，並根據產生的螢光信號計算所述待測食品中的大腸菌群數量，是在現有的數字PCR系統上進行。首先，利用數字PCR系統自帶的分液器將配製好的所述反應體系進行分液處理，生成數萬個液滴，分散至晶片的微反應器或微滴中，使每個微滴或反應器的PCR擴增模板數少於或者等於I個；其次，進行PCR循環擴增，有一個PCR擴增模板的反應器就會給出螢光信號，沒有PCR擴增模板的反應器就沒有螢光信號。進一步，根據螢光信號的相對比例和PCR反應液的體積，計算出所述待測食品(如牛奶)中大腸菌群數量。
[0023]本發明的再一個目的是提供一種利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的試劑盒。所述食品可為液體食品，也可為固體食品。如各種鮮活農產品及其加工食品、水以及飲料等。在本發明的一個實施例中，所述食品為奶，具體為牛奶，更加具體為生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶。
[0024]具體的，本發明所提供的試劑盒，可包括如下物質:
[0025](a)引物對；所述引物對為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對1，或者由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對2 ；
[0026](b) DNA結合物；所述DNA結合物為不能穿過完整的細胞膜，但能與細胞膜受損後暴露出來的DNA結合的物質；
[0027]所述DNA結合物具體可為疊氮溴化丙錠(PMA)或疊氮溴化乙錠(EMA)。
[0028]進一步，所述試劑盒還可包括螢光染料；
[0029]所述突光染料具體可為SybGreen或EvaGreen。
[0030]所述試劑盒還可以包括PCR反應緩衝液。
[0031]在本發明中，所有的所述大腸菌群數量均為活的大腸菌群的數量(細胞膜完整的活的大腸菌群的數量)。
[0032]在本發明中，所述引物對不限於由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對1，以及由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對2，只要是能夠特異性擴增所有大腸菌群的引物對均可。
[0033]所述大腸菌群為需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
[0034]本發明在數字PCR基礎上，設計了可以擴增大腸菌群的通用引物，建立了基於數字PCR方法的食品中大腸菌群數量的檢測方法。與常規方法相比，本發明的方法無需對食品中的細菌進行分離培養，使檢測時間從1-2天縮短至3-5小時；同時本發明的方法通過數字PCR技術對PCR反應液進行分液處理，大大減少了背景DNA和基質的幹擾，靈敏度可以低至I個拷貝；而且該方法無需設置標準曲線，根據結果可以直接判讀樣品中的大腸菌群數量，大大簡化了操作步驟。
【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0036]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0037]數字PCR系統:Bio-rad公司Droplet Digital PCR System (購自伯樂公司，目錄號為186-4001)。其工作原理為:將含有螢光染料的反應體系進行分液處理,生成數萬個液滴，分散至晶片的微滴中，使每個微滴的模板數少於或者等於I個；這樣，在PCR循環擴增時，有一個模板的微滴就會發出螢光信號，沒有PCR擴增模板的微滴就沒有螢光信號。進一步，根據螢光信號的相對比例和反應液的體積，就可以計算出反應體系中模板的濃度。
[0038]疊氮溴化丙錠(PMA):美國Biotium公司產品，其產品目錄號為40013。疊氮溴化乙錠(EMA):美國Biotium公司產品，其產品目錄號為40015。PMA和EMA均為DNA結合物，均不能穿過完整的細胞膜，但能與細胞膜受損後暴露出來的DNA結合。因此，PMA和EMA可以與死細菌的DNA結合，但是不能與細胞膜完整的活細菌的DNA結合。
[0039]螢光染料SybGreen:美國Invitrogen公司產品，其產品目錄號為S-7585。螢光染料EvaGreen:美國Biotium公司產品，其產品目錄號為31000。螢光染料SybGreen和EvaGreen均可與雙鏈DNA分子結合，發出綠色螢光。
[0040]PCR mix:Bio-rad公司產品，其產品目錄號為186-4035。所述PCR mix由dNTP、DNA聚合酶和PCR緩衝液組成。
[0041]美國3M大腸菌群數量測試片:美國3M公司產品，其產品目錄號為6412。
[0042]實施例1、利用數字PCR對市售生鮮牛乳進行大腸菌群數量的檢測
[0043]本實施例以12份市售生鮮牛乳作為待測牛奶，編號為1-12，利用數字PCR技術對其中的大腸菌群數量(活的大腸菌群的數量)進行檢測。
[0044]—、大腸菌群通用引物對的設計
[0045]為 了能夠利用PCR方法檢測食品中的所有的大腸菌群，根據大腸菌群基因組保守序列，設計可以擴增所有大腸菌群的通用引物對I和引物對2，具體如下:
[0046]引物對1:
[0047]正向引物:5』-CTGATCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3』 (序列 I);
[0048]反向引物:5'-CAACCAGACGATAGTTATCACGCA-3』(序列 2)。
[0049]引物對2:
[0050]正向引物:5』-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3』(序列 3)；
[0051 ]反向引物:5 』 -GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3 』(序列 4 )。
[0052]二、PCR擴增模板的製備
[0053]取20ml市售生鮮牛乳，4°C 14000g離心lOmin，得沉澱(細菌)，用Iml生理鹽水重懸後加入疊氮溴化乙錠(EMA)使其終濃度為IOy g/ml，室溫(25°C)孵育20分鐘，然後4°C14000g離心5min，用生理鹽水將沉澱重懸至20微升，得到PCR擴增模板。
[0054]三、配製PCR反應體系
[0055]取5微升步驟二獲得的PCR擴增模板，加入10微升PCR mix, 2微升正向引物和2微升反向引物(使正向引物和反向引物在反應體系中的終濃度均為10 μ M)(步驟一中的引物對1)，I微升螢光染料EvaGreen。混合後得到20微升的反應體系。
[0056]四、上機進行數字PCR檢測
[0057]1、反應體系的分液處理
[0058]將步驟三配製好的PCR反應體系置於數字PCR系統的分液器內，按照儀器使用說明進行操作，實現對反應體系的分液處理，生成2萬個液滴。
[0059]2、PCR循環擴增
[0060]每個液體在獨立的空間內進行PCR循環擴增。設置反應程序如下:94°C預變性3min ；94°C 45S，50°C 45S，72°C 60S，5 個循環；94°C 45S，58°C 45S，72°C 60S，30 個循環；最後72°C保溫IOmin。
[0061]3、分析突光信號
[0062]PCR循環擴增反應結束後，利用數字PCR系統自帶的微滴螢光檢測儀採集每個液滴的螢光信號。進一步，根據發出螢光信號的液滴的數量，計算出所述待測食品(市售生鮮牛乳)中活的大腸菌群的數量。
[0063]實驗同時設置以美國3M大腸菌群數量測試片對作為待測食品的市售生鮮牛乳進行大腸菌群數量測定的對照。具體的實驗操作均按照產品說明書記載進行。
[0064]實驗重複三次，結果取平均值。
[0065]結果如表1所示，從結果可以看出，本發明採用數字PCR方法對生鮮牛乳中大腸菌群數量的測定結果，與現有的「美國3M大腸菌群數量測試片法」相比，12份樣本的誤差均小於20%，平均誤差為12%，這說明本發明方法具有很高的準確度。另外，本發明數字PCR方法的單樣本全程檢測時間為4小時，遠短於現有進口 3M快速檢測片的24小時。
[0066]表1數字PCR法與美國3M大腸菌群數量測試片法測定生鮮牛乳中大腸菌群數量的結果對比(單位:CFU/mL):\ \\ r) ^數字PCR法^美國3Μ測試片法I
【權利要求】
1.數字PCR方法在檢測食品中大腸菌群數量中的應用。
2.一種利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的方法，包括如下步驟: (O富集待測食品中的細菌，將富集物與DNA結合物共同孵育，獲得PCR擴增模板；所述DNA結合物為不能穿過完整的細胞膜，但能與細胞膜受損後暴露出來的DNA結合的物質； (2)配製PCR反應體系，進行數字PCR反應；所述PCR反應體系中含有步驟(1)獲得的PCR擴增模板、大腸菌群通用引物對、螢光染料、dNTP和DNA聚合酶； (3)根據步驟(2)數字PCR反應產生的螢光信號，計算得到所述待測食品中的大腸菌群數量。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述大腸菌群通用引物對為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對1，或者由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對2。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵在於:所述DNA結合物為疊氮溴化丙錠或疊氮溴化乙錠。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特徵在於:所述螢光染料為SybGreen或EvaGreen0
6.根據權利要求2-5中任一所述的`方法，其特徵在於:步驟(2)中，進行所述數字PCR反應時的退火溫度為58°C。
7.一種利用數字PCR檢測食品中大腸菌群數量的試劑盒，包括如下物質: Ca)引物對；所述引物對為由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對1，或者由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對2 ； (b)DNA結合物；所述DNA結合物為不能穿過完整的細胞膜，但能與細胞膜受損後暴露出來的DNA結合的物質。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於:所述DNA結合物為疊氮溴化丙錠或疊氮溴化乙錠。
9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特徵在於:所述試劑盒還包括螢光染料；
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於:所述螢光染料為SybGreen或EvaGreen0
【文檔編號】C12Q1/68GK103667463SQ201310613503
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】陳愛亮, 吳英, 蔣小玲, 呂珍珍, 劉金釧, 楊曙明 申請人:中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所