酶法測定血清鎂離子試劑的製作方法

2023-05-14 05:52:51

專利名稱：酶法測定血清鎂離子試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶學檢測技術，特別是提供一種將丙酮酸激酶(EC2.7.1.40,PK)偶聯乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,LDH)用於測定血清鎂離子的酶法試劑。
鎂離子是細胞內的主要陽離子，含量僅次於鉀離子，其在細胞外液中的濃度為0.7-1.10mmol/L。鎂離子參與機體許多生理功能，能與細胞內許多重要成分，如ATP等形成複合物，激活多種酶體系，從而對葡萄糖酵解、脂肪、蛋白質、核酸、輔酶等形成，肌肉收縮，抗體代謝過程中的轉甲基作用等起調節作用；其又是氧化磷酸化的重要輔助因子，對線粒體功能有重要影響，特別與能量代謝有關；在蛋白質合成過程中，鎂離子也參與mRNA和蛋白質轉錄等機制；另外，鎂離子對維持神經肌肉的興奮性也起重要作用。鎂離子缺乏或過多，神經肌肉系統常是早期症狀之一。因此血清鎂離子濃度改變的臨床意義越來越為醫學家們所重視。
血清鎂離子的檢測方法很多。如火焰光度法、螢光法、原子吸收分光光度法(AAS)、層析法、離子色譜法、染料比色法、和酶法等。其中以AAS法最準確、敏感、特異性也最好，但由於儀器價格非常昂貴，不易自動化操作及必須使用可燃性氣體所帶來的潛在危險，而很難在臨床實驗室推廣普及。火焰光度法、螢光法、層析法、離子色譜法測定鎂離子雖有報導，但臨床實際應用並不多見。染料比色法是根據在鹼性環境下，染料與鎂離子鰲合而改變顏色這一基礎建立的，包括二甲苯胺藍法(XLB)、達蛋黃法、Calmagite法、和甲基麝香草酚藍法(MTB)。達蛋黃法的空白值較高、幹擾較大、特異性較差、測定誤差率超過30％，其餘的幾種比色法因使用簡便、經濟、延用至今，尤其是Calmagite法和甲基麝香草酚藍法(MTB)現被衛生部推薦為血清鎂離子測定的常規方法。但此類方法會不同程度受到陽離子或膽紅素的幹擾，也會使pH發生變化而不穩定，工作試劑須新鮮配製或反覆校正，為增加試劑穩定性，需加入劇毒劑氰化物，因而對操作人員有潛在的危險。
1959年，Baum和Czok就提出了用異檸檬酸脫氫酶(EC1.1.1.42,ICD)來測定血清鎂離子的方法，但由於種種原因，此方法一直未被臨床所接受。直到近十餘年，酶法在測定血清鎂離子方面才得到進一步的發展。據統計，約有三百多種酶可被鎂離子激活，依據這一原理，各國學者相繼報導了採用酶偶聯技術，測定血清鎂離子的不同酶學方法。如Tabata等於1985年，報告己糖激酶(EC2.7.1.1,HK)偶聯葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC1.1.1.49,G6PDH)的方法；1986年，他們又報導了用葡萄糖激酶(EC2.7.1.2,Gluk)取代HK，並偶聯G6PDH的方法；同年，Wimmer等報告了甘油激酶(EC2.7.1.30,GK)偶聯甘油-3-磷酸氧化酶(EC1.1.3.2l,GPO)和過氧化物酶(EC1.11.1.7,POD)的方法；1989年，Fossati等又報導了根據Tabata方法改進的Gluk偶聯G6PDH的方法；1991年，Suzuki等報告了用磷酸葡萄糖變位酶(EC5.4.2.2,PGM)偶聯G6PDH的方法。
上述四種方法除甘油激酶法外，都是催化葡萄糖1-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，再偶聯G6PDH催化6-磷酸葡萄糖和NADP生成6-磷酸葡萄糖酸內酯和NADPH，通過340nm波長時NADPH引起的吸光度的增加，來間接計算血清鎂離子的濃度。從費用上，偶聯G6PDH的方法，配製一升試劑的費用，大約為4000至7000元人民幣；按甘油激酶發，配製一升試劑的費用就更高，僅進口工具酶的費用在一萬八千元人民幣以上，而且，此方法還未解決鈣離子的幹擾問題。這些均成為阻礙酶法進一步推廣的原因。
1995年，日本的Fujita等人報告了用異檸檬脫氫酶測定鎂離子的方法，並使用生化技術對ICD進行修飾，以提高此酶在水溶液中的穩定性，1996年，英國人Stone等人根據日本人發表的文章也成功的建立了此種方法，並使修飾後的酶穩定性從未修飾前的兩周延長到四周以上。單配製一升試劑所需ICD和NADP的費用至少也要一萬七千元以上。
本發明的目的在於提供將丙酮酸激酶偶聯乳酸脫氫酶用於測定血清鎂離子的酶法試劑，且準確度高，精密度好，測定範圍寬，抗幹擾能力強，相關性、穩定性好。
本發明屬於對無機離子的酶法測定研究，基於研究中鎂離子對兔肌丙酮酸激酶有著明顯的激活作用這一發現，丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK,EC2.7.1.40)又叫三磷酸腺苷丙酮酸磷酸轉移酶，是調節糖酵解的三個限速酶之一。PK在有錳離子和鎂離子存在情況下催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，鉀和氨離子在有鎂離子存在情況下，可使PK活性大大增強，這一原理被本研究用來測定鎂離子濃度。由於反應產物丙酮酸並不能直接指示PK催化反應的程度，需偶聯LDH系統來間接指示PK活性或產物生成量。乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH,EC1.1.1.27)是動物體內含量最多的酶之一，廣泛存在於動物組織臟器內。作為工具酶，主要催化丙酮酸與乳酸之間的氧化與還原反應，同時伴有NADH和NAD之間的轉換，NADH的最大吸收峰在340nm，故其濃度變化可使340nm波長下的吸光度發生變化，把LDH偶聯到PK系統進行血清鎂離子的測定。PK與LDH偶聯反應原理如下PKPEP+ADP--→PYRUVATE+ATPMg++LDHPYRUVATE+NADH+H+--→LACTATE+NAD+反應原理磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)在丙酮酸激酶(PK)催化下生成丙酮酸(Pyruvate)和三磷酸腺苷(ATP)，丙酮酸又與乳酸脫氫酶系統偶聯，經乳酸脫氫酶(LDH)催化生成乳酸(Lactate)，同時NADH氧化成NAD，鎂離子的存在可使丙酮酸激酶活性顯著增強，故NADH在340nm波長吸光度的變化可以間接反映血清鎂離子的濃度。
基於上述反應原理，本發明的試劑配方由下述濃度的R1、R2組成，其中，R1三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化鉀(KCL)25.00-50.00mmol/L，乳酸脫氫酶(LDH)1500-4000U/L，丙酮酸激酶(PK)500--1300U/L，二磷酸腺苷(ADP)1.50-6.00mmol/L，還原性輔酶I(NADH)0.25-0.50mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)2.00-6.00mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)2.00-50.00mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。
上述試劑來源三羥甲基氨基甲烷(Tris,AR,上海試劑三廠)；丙酮酸激酶(PK,Sigma，比活性40U/mg凍乾粉，上海試劑三廠)；乳酸脫氫酶(LDH，比活性30U/mg凍乾粉，上海試劑三廠)；磷酸烯醇式丙酮酸(PEP,AR，上海試劑三廠)；還原性輔酶I(NADH,上海試劑三廠)；二磷酸腺苷(ADP，上海東風生化廠)；氯化鉀(KCL,AR，上海東風生化廠)；乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA，華北特種化學試劑開發中心)。
本發明採用常規方法配製，其中Tris-HCL緩衝液的配製準確稱取Tris1.21g加水溶解，用1mol/L HCL調pH至7.4(25℃)，再用去離子水稀釋至100ml，置於4℃保存。
本發明自動分析參數的確定。Cobas Mira自動生化分析儀的測定參數如下Measurement Mode:Absorb,ReactionMode:R_S_SR1,CalibrationMode:StdNonlin,ReagentBlank:Reag/Sol,Wavelength:340nm,DecimalPosition:2,Unit:mmol/L,SampleCycle:1,Vol:15μl,Dil:5μl,ReagentCycle:1,Vol:160μl,StartReagentlCycle:2,Vol:40μl,Dil:0μl,Reac.Direction:Decrease,CalcStepA:Endpoint,ReadingFirst:3,Last:8,Calib.Interva1:EachRun,Std_1:0.00mmol/L,Std_2:0.40mmol/L,Std_3:0.80mmol/L,Std_4:1.40mmol/L,Std_5:2.00mmol/L,Replicate:Single,Deviation:10.0％.
Kedy Ⅲ Snijders半自動生化分析儀的測定參數如下TypeofTest:FixedTime,Wavelength:340nm,Temperature37℃,Unit:mmol/L,PathologicLow:0.700,pathologic High:1.100,Aspiration Volume:500μl,Sample Volume:60μl,Reagent 1 Volume:480μl,Reagent 2 Volume:120μl,DelayTime:40seconds,MeasureTime:60seconds,Standard 1:0.40,Standard 2:0.80,Standard 3:1.40,Standard 4:2.00mmol/L.
本發明的實驗研究1陽離子對丙酮酸激酶活性的影響儀器島津UV-240、Ciba-Corning2800分光光度計和HHW21-CR420型電熱恆溫水浴箱。試劑0.1mol,pH7.4,Tris-HCL緩衝液、ADP、PEP、NADH、LDH和PK；樣本(S)為50mmol/L的鉀、鈉、鈣、鋰、錳、氨和鎂離子溶液；實驗用水均為去離子水。試劑(R1)由ADP、LDH、PK和NADH組成，試劑(R2)主要為PEP。測定參數溫度37℃,340nm,R1:1.0ml,R2:0.1ml,S:0.025ml，稀釋液0.125ml。測定步驟將R1和樣本加入試管中，37℃水浴5分鐘以上，加入R2(持續在37℃水浴中)後，立即記錄單位時間內的吸光度變化(ΔA/min)。
結論錳和鎂離子是PK的直接激動劑，而鉀和氨離子實際上僅是其間接激活劑，氨離子對PK的間接激活作用顯著大於鉀離子。鈣離子PK的抑制劑，由此證明使用丙酮酸激酶法測定鎂離子，一定要先解決鈣離子的幹擾問題。
2準確性研究(1)與定值血清的比較採用雙份(高、正常值)進口的Boehreiger Mannheim(BM)公司定值血清，高值血清批號為Lot/187891-187894No.651265，正常值血清批號為Lot/189636-189639No.651257。見表一，結果表明，準確性相當滿意。
(2)線性研究配製0.1mol/L的醋酸鈣和硫酸鎂溶液，分別稀釋配製成為含鎂離子0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0mmol/L的系列標準液，標準液中的鈣離子濃度均為2.5mmol/L。將上述標準液在Cobas Mira自動分析儀上測定兩次，每次每份標本測三遍，回歸方程Y=0.181x+0.011,r=0.9998,P＜0.001，見圖一，結果表明，鎂離子濃度在0-2.0mmol/L範圍內時，吸光度與濃度有良好的線性關係。正常血清鎂離子濃度一般在0.7-1.1mmol/L，故該線性範圍能滿足臨床需要。
(3)回收實驗以鎂離子濃度為0.2mmol/L的基礎值，分別再加入鎂離子0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L，使鉀離子的理論值分別成為0.8、1.0、1.2和1.4mmol/L，進行回收實驗。見表二，由表中計算鎂離子的回收率平均為100.76％，表明本方法的回收率相當滿意。
3精密度研究批內精密度分別以正常值和高值血清在同一時間，同時重複測定15次，並計算其均值、標準差及變異係數，結果見表三；日間精密度將上述血清每天測定一次，連續兩遍共測定八天，計算其均值、標準值和變異係數，結果見表四；結果表明批內及日間精密度平均僅在2.01和3.12％，此結果與其他酶法作者報告的結果非常相似，因此用此酶學方法測定血清鎂離子，完全符合重複性要求。
4幹擾試驗選擇內源性幹擾物質鉀、氨、鈣、錳、銅、鋅、鐵離子，膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白進行幹擾實驗。在進行陽離子幹擾實驗時，設立對照組與加入不同濃度陽離子的實驗組進行比較，鎂離子濃度均相同，計算同時測定10次的對照組鎂離子濃度的均值和標準差，各實驗組則同時測定三次，並計算均值。評價幹擾程度則根據實驗組均值是否在對照組的均值±2標準差(means±2S)範圍內，超出此範圍即為有幹擾。
對照組與實驗組的鎂離子濃度均為0.80mmol/L。測定結果對照組x±S為0.811±0.020mmol/L，對照組範圍x±2S為0.771-0.851mmol/L。
實驗組A.鉀離子加入不同濃度的氯化鉀，使鉀離子反應濃度分別為6.0、8.0和10.0mmol/L，經測定三組的鎂離子均值分別為0.789、0.773和0.782mmol/L，因此10mmol/L的鉀離子對本方法無幹擾。
B．氨離子血清氨離子濃度上限為0.056mmol/L。幹擾試驗樣本中加入的硫酸氨濃度反應分別為0.5、0.75和1.0mmol/L，為正常上限的8.9、13.4和17.9倍，鎂離子測定值為0.839、0.802和0.821mmol/L，無幹擾。
C鈣離子鈣離子是PK的抑制劑，已為本發明所證實，幹擾試驗中分別加入醋酸鈣6.0、8.0和10.0mmol/L，鎂離子測定值分別為0.826、0.845和0.844mmol/L，未見鈣離子的幹擾，而Wimmer等用甘油激酶法測定鎂離子時，樣本中鈣離子在5.0mmol/L時，即對測定結果產生顯著的負幹擾作用。
D錳離子錳離子和鎂離子一樣，對許多酶具有激活作用，錳離子在血清中屬微量元素，其血清濃度上限為0.013mmol/L。本幹擾實驗中加入1.0mmol/L，未見幹擾。
E銅離子血清銅離子濃度的正常上限為0.025mmol/L，本試驗中分別加入硫酸銅0.05、0.075和0.10mmol/L，鎂離子測定值分別為0.801、0.837和0.792mmol/L，未見銅離子的幹擾。
F鋅離子血清鋅離子濃度的正常上限0.025mmol/L，本幹擾試驗中分別加入二氧化鋅0.05、0.07和0.10mmol/L，鎂離子測定值分別為0.804、0.823和0.823mmol/L，未見鋅離子幹擾。
G鐵離子血清鐵離子濃度的正常上限為0.03mmol/L，本幹擾試驗中加入三氯化鐵達0.10mmol/L時，鎂離子濃度測定值為0.848mmol/L，未見鐵離子的幹擾。
膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白幹擾試驗使用血清測定，並按下列公式計算幹擾百分數p=[(AM-CM)/CM]×100，此公式中p為幹擾百分數，AM為實際測定值，CM在這裡為理論值，當p≤︱3.0︱時(︱3.0︱表示絕對值，相當於±3％)，被視為無幹擾。
A膽紅素幹擾試驗在高值血清中加入膽紅素100mmol/L(5.85mg/dl)，使其鎂離子理論值為1.62mmol/L，然後，用本方法測定為1.637mmol/L,p為1.049％，無幹擾。
B甘油三酯幹擾試驗在血清中加入不同量的高甘油三酯血清，使甘油三酯濃度分別為4.86和7.3mmol/L，鎂離子理論濃度分別為0.949和1.243mmol/L，本方法測定值為0.947和1.230mmol/L，幹擾百分數p分別為-0.211％和-1.046％，未見幹擾。
C血紅蛋白幹擾試驗使用血紅蛋白標準液(141g/L)進行幹擾試驗。分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0G/L血紅蛋白，使血清鎂離子理論濃度依次為0.986、0.972、0.944、0.916、0.888和0.860mmol/L，而實際測定濃度為1.002、0.970、0.963、0.934、0.865和0.854mmol/L，幹擾百分數p分別為1.623、-0.206、2.013、1.965、-2.59和-0.698％，均小於±3.0％，因此，判定血紅蛋白對此方法無幹擾。
5與其它方法的方法學比較目前臨床實驗室常用的比色法是二甲苯胺藍法(XLB)、Calmagite法(CAL)和甲基麝香草酚藍法(MTB),CAL法和MTB法現仍被我國衛生部推薦為血清鎂離子測定的常規方法。特作相關性研究。
(1)與原子吸收法(AAS)的方法學比較AAS法由天津市第一中心醫院，微量元素室使用原子吸收分光光度計(Smith-Hieftje-22,Termo Jarrall Ash,USA)和核工業部北京化工冶金研究院生產，批號為080132，濃度為100mg/ml的國家二級鎂標液GBW(E)，稀釋後測定，標本由天和醫院生化室提供，隨機取8份病人血清及兩份BM公司的定值血清(高及正常值)，用兩種方法測定，數據經統計學處理AAS均值±標準差為0.936±0.249mmol/L；本法為0.905±0.254mmol/L,t=0.277,p＞0.5,兩種方法的均值無顯著性差異；回歸方程本法Y=0.999x-0.03,r=0.980,n=10,p＜0.01，見圖二，兩種方法高度相關，bias(偏差)=0.031mmol/L,Sy/x=0.054mmol/L,Sd=0.051mmol/L,t=1.824,p＞0.1，故兩種方法的偏差無統計學意義。
(2)與MTB發的方法學比較儀器為721分光光度計(上海第三分析儀器廠)，試劑為北京化工廠生產鎂試劑盒(MTB)，批號970411，依照試劑盒說明書測定，標本由天和醫院生化室提供，隨機取30份新鮮病人血清及一份BM公司的定值血清(高值)，同時測定，見圖三。本法與MTB法的回歸方程Y=0.011+1.172x,r=0.922,n=31,p＜0.01。根據測定結果進行統計學處理，計算方法均值、標準差及t檢驗MTB法為0.648±0.142mmol/L；本法為0.77±0.18mmol/L,t=2.979,p＜0.005,可見此兩種方法的相關性雖好，但有一顯著的方法學差異，此誤差是由於所使用的北京化工廠生產的批號為970411的鎂試劑盒(MTB法)，使測定結果偏低所致，此由BM定值血清結果也得到證實，高值為1.62(1.43-1.81)mmol/L的定值血清，MTB法只測得為1.289mmol/L(失控)，絕對誤差達0.351mmol/L(21.40％)，而本法為1.60mmol/L絕對誤差僅為0.02mmol/L(1.23％)。後經多次重複結論相同。
(3)與XLB法的方法學的比較儀器721分光光度計(上海第三分析儀器廠)；試劑中生生物工程高技術公司生產鎂試劑盒，批號970905，按照說明書測定；標本由天和醫院生化室提供，隨機取45份病人血清及兩份BM公司的定值血清(高值和正常值)，同時測定，見圖四。本法與XLB法的回歸方程Y=0.118+0.827x,r=0.933,n=47,p＜0.01。根據測定結果進行統2計學處理，計算方法均值、標準差及t檢驗XLB法為0.796±0.179mmol/L，本法為0.777±0.159mmol/L,t=0.543,p＞0.5,此兩種方法的相關性很好，之間的偏差無統計學意義。
(4)與CAL法的方法學比較CAL法由天津市中醫學院第一附屬醫院生化室使用Beckman CX5自動生化分析儀和Beckman標準液及試劑盒測定，標本亦來自中醫學院第一附屬醫院生化室，隨機取31份病人血清及兩份BM公司的定值血清(高值及正常值)。以上標本分別使用兩種方法在兩個儀器上測定。數據經統計學處理計算均值±標準差，CAL法為0.852±0.224mmol/L；本法為0.800±0.229mmol/L,t=0.929,p＞0.3，說明兩種方法的均值無顯著性差異；回歸方程Y=0.982x-0.037,r=0.960,n=33,p＜0.01，見圖五，兩種方法高度相關，兩種方法間的偏差無統計學意義。
6試劑穩定性觀察將配製好的應用試劑置於4℃冰箱冷藏，並用來連續7天測定兩種濃度的標準品。結果表明本試劑在配製為應用液後，置於4℃冷藏保存，至少可以穩定5天，此期間對測定結果無影響，說明試劑的穩定性很好。
實施例將本試劑在Kedy Ⅲ半自動生化分析儀上檢查準確性。檢查準確性使用BM公司兩個批號的定值血清。標準液的配製用乾燥的醋酸鈣和硫酸鎂分別配製成100mmol/L的儲存試劑，試驗前再用去離子水精確稀釋成含鎂離子0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0mmol/L的標準液，標準液中的鈣離子濃度均為2.5mmol/L。試劑配方為R1三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化鉀(KCL)41.25mmol/L，乳酸脫氫酶(LDH)2250U/L，丙酮酸激酶(PK)750U/L，二磷酸腺苷(ADP)2.28mmol/L，還原性輔酶I(NADH)0.41mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)3.85mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)16.50mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。操作步驟準確稱取R1 480μl注入2ml試管中，再依次分別加入60μl標準液與樣品，混勻，置於恆溫水箱37℃孵育5分鐘以上，再準確加入啟動試劑R2 120μl，立即混勻，按前述參數測定，結果見表五，因此本試劑可廣泛用於國內各種規模的實驗室，各種自動或半自動生化分析儀，更因其成本低廉而有利於推廣使用。
對本發明的臨床試用觀察(天津市第三中心醫院檢驗科)儀器與方法儀器為ToshibaTBA-40FR自動生化分析儀；所使用試劑，標準液均由本發明配製提供，定值血清來自BM公司，A.高值血清批號185259，鎂離子原子吸收法(AAS)靶值1.65(1.45-1.85)mmol/L；二甲基苯胺藍法(XLB)靶值1069(1.49-1.89)mmol/L；B.正常值血清批號18968802,AAS法靶值0.88(0.77-0.99)mmol/L,XLB法靶值0.85(0.75-0.95)mmol/L。通過測定定值血清進行準確性評價，並隨即選擇兩份病人血清進行精密度測定。結果見表六及表七，準確性與定值血清的兩種方法靶值比較，本方法的測定結果在高值介於兩種方法中間，在正常值，則與AAS法更接近。精密度隨機選擇兩份病人血清進行20次測定，並計算批內不精密度，結果低值(0.485mmol/L)與正常值(0.799mmol/L)的平均不精密度僅為0.829％。
表一、測定進口定值血清結果定值血清靶值(範圍) 測定值偏差(％)AAS(H)1.62(1.43-1.81)1.6370.017(1.05)XLB(H)1.64(1.44-1.84)1.637-0.003(0.18)AAS(N)0.8(0.77-0.99) 0.858-0.022(2.50)XLB(N)0.85(0.75-0.95)0.8580.008(0.94)表二、回收試驗結果基礎值 加入值 測定值 回收值回收率(％)0.200.600.817 0.617 102.830.200.801.003 0.803 100.380.201.001.180 0.980 98.000.201.201.422 1.222101.83表三、批內重複測定結果正常值高值 平均C.V(％)Mean 0.8581.637S 0.0210.026CV(％)2.4481.588 2.006表四、日間重複測定結果正常值 高值 平均C.V(％)Mean 0.8701.627S 0.0320.042CV(％) 3.6642.5683.116
表五、半自動測定的準確性結果定值血清 靶值(範圍) 測定值偏差(％)AAS(H)1.62(1.43-1.81)1.661 0.041(2.53％)XLB(H)1.64(1.44-1.84)1.661 0.021(1.28％)AAS(N)0.88(0.77-0.99)0.902 0.022(2.50％)XLB(N)0.85(0.75-0.95)0.902 0.052(6.12％)表六、使用本發明的準確性測定結果定值血清靶值(範圍)測定值偏差(％)(mmol/L) (PK)183259AAS 1.65(1.45-1.85) 1.68 0.03(1.82％)XLB 1.69(1.49-1.89) 1.68 -0.01(0.59％)18968802AAS 0.88(0.77-0.99) 0.90 0.02(2.27％)XLB 0.85(0.75-0.95) 0.90 0.05(5.88％)表七、批內不精密度測定結果低值正常值 平均(mmol/L)(mmol/L)CV(％)Mean0.485 0.799S 0.005 0.005CV(％) 1.031 0.626 0.829
權利要求
1一種將丙酮酸激酶偶聯乳酸脫氫酶用於測定血清鎂離子的酶法試劑，其特徵在於由下述濃度組份的R1、R2所組成，其中，R1三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4110.00mmol/L，氯化鉀(KCL)25.00-50.00mmol/L，乳酸脫氫酶(LDH)1500--4000U/L，丙酮酸激酶(PK)500-1300U/L，二磷酸腺苷(ADP)1.50-6.00mmol/L，還原性輔酶I(NADH)0.25-0.50mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)2.00-6.00mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)2.00--50.00mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。
2如權利要求1所述用於測定血清鎂離子的酶法試劑，其特徵在於由下述濃度組份的R1、R2所組成，其中，R1三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化鉀(KCL)41.25mmol/L，乳酸脫氫酶(LDH)2250U/L，丙酮酸激酶(PK)750U/L，二磷酸腺苷(ADP)2.28mmol/L，還原性輔酶I(NADH)0.41mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)3.85mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)16.50mmol/L，三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩衝液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。
全文摘要
本發明涉及酶學檢測技術，特別是將丙酮酸激酶(EC2.7.1.40，PK)偶聯乳酸脫氫酶(EC 1.1.1.27，LDH)用於測定血清鎂離子的酶法試劑。研究表明，該試劑準確度高，精密度好，批內平均不精密度 2.45%，日間平均不精密度 3.10%，測定範圍寬(0.1—2.0mmol/l)，抗幹擾能力強，與原子吸收法及比色法有極好的相關性，試劑復溶後(4℃)穩定至少5天，價廉(0.5元/ml)，適用於多種自動生化分析儀和半自動生化儀以及手工測定。且由於價廉，全部試劑國產化而優於目前使用的國外各種酶法試劑。
文檔編號G01N33/84GK1227920SQ98123138
公開日1999年9月8日 申請日期1998年12月9日 優先權日1998年12月9日
發明者張孝山, 帥真, 李明潤, 李明, 楊彬, 溫庭民, 王瑛, 徐海津 申請人:天津市醫藥科學研究所