基於核酸宏陣列和雙功能分子的汞離子檢測方法及試劑盒
2023-05-14 02:02:32
1.本發明涉及重金屬檢測技術領域，尤其涉及一種基於核酸宏陣列和雙功能分子的汞離子檢測方法及試劑盒。
背景技術：
2.汞離子（hg
2+
）廣泛存在於自然界，是環境中毒性最強的重金屬元素之一，即使在低濃度的情況下，對人體的健康也會造成嚴重的危害。水溶性的汞是一種最常見的且較穩定的存在形式，由於其具有高毒性和生物蓄積性而造成嚴重的汞汙染。所以，具有高靈敏度和高選擇性的hg
2+
微量檢測方法實時地檢測水生生態系統中hg
2+
含量對控制環境的汙染及保護人類健康具有重大的意義。
3.有研究人員提出了一種基於巰基dna修飾的金納米棒檢測hg
2+
的方法，其原理在於，巰基dna修飾的金納米棒能夠與hg
2+
形成t-hg
2+-t夾心式結構，從而構建出cy5核苷酸-金納米棒螢光共振能量轉移體系，最終達成對hg
2+
的檢測。但是本發明人發現，這種方法需要對金納米粒子表面進行核酸修飾，製備較為困難，且這種方法對於hg
2+
檢測的靈敏度還有待改善。
技術實現要素：
4.針對現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種核酸宏陣列和雙功能分子的汞離子檢測方法及試劑盒。
5.本發明的目的是提供一種快速檢測新方法，利用既能絡合汞離子，又能作為拉曼信號分子的雙功能分子，結合核酸固定探針與汞離子的特異性結合作用，通過形成特定的檢測體系達到對汞離子可視化定性檢測和表面增強拉曼增敏的定量檢測的目的。
6.為實現前述發明目的，本發明採用的技術方案包括：本發明提供一種基於核酸宏陣列和雙功能分子的汞離子檢測方法，包括：提供核酸宏陣列和信號探針，所述核酸宏陣列包括以陣列形式排列的多個固定探針，所述固定探針為能夠特異性地捕獲汞離子的寡核苷酸鏈，所述信號探針包括金納米粒子以及修飾於金納米粒子表面的雙功能分子，所述雙功能分子為拉曼信號分子並能夠與汞離子特異性地結合；將所述核酸宏陣列與待檢測樣本接觸，以使固定探針捕捉待檢測樣本中的汞離子；將捕獲汞離子的所述核酸宏陣列與所述信號探針接觸，以使所述核酸宏陣列捕獲的汞離子與所述信號探針特異性結合，形成汞離子檢測體系；通過測試所述汞離子檢測體系的顏色和/或拉曼光譜，實現對所述待檢測樣本中汞離子的檢測。
7.在一些優選實施方式中，本發明進一步提供改進方案：在對所述汞離子檢測體系進行顏色和/或拉曼光譜測試之前，對所述汞離子檢測體系進行銀染增敏處理；其中，所述
銀染增敏處理具體包括：提供銀染溶液，所述銀染溶液含有1.2
ꢀ‑ꢀ
1.8 mol/l銀離子和0.1
ꢀ‑ꢀ
0.3 g/ml還原劑；將所述銀染溶液與所述汞離子檢測體系接觸並進行銀沉積反應，從而在所述汞離子檢測體系表面沉積銀納米材料。
8.另一方面，本發明還提供了能夠便於應用上述檢測方法的試劑盒，包括：核酸宏陣列，包括以陣列形式排列在固相載體表面的多個固定探針，所述固定探針為能夠特異性地捕獲汞離子的寡核苷酸鏈；信號探針，包括金納米粒子以及修飾於金納米粒子表面的雙功能分子，所述雙功能分子為拉曼信號分子並能夠與汞離子特異性地結合。
9.基於上述技術方案，與現有技術相比，本發明的有益效果至少包括：本發明提供的汞離子檢測方法利用修飾於金納米粒子表面的雙功能分子既能結合汞離子，又產生拉曼信號的特性，通過核酸固定探針與雙功能分子對汞離子的識別與捕獲進行顯色和/或拉曼檢測，避免了現有的基於「t-hg
2+-t」結構檢測汞離子的方法中需要在金納米粒子表面修飾核酸的缺點，對於汞離子的檢測更加便捷和靈敏、準確度更高。
10.上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠使本領域技術人員能夠更清楚地了解本技術的技術手段，並可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例並配合詳細附圖說明如後。
附圖說明
11.圖1是本發明一些典型實施方案提供的汞離子檢測方法的原理示意圖；圖2是本發明典型實施方案提供的兩種汞離子檢測方法的檢測結果對比示意圖；圖3是本發明典型實施方案提供的利用拉曼檢測不同濃度汞離子的對應拉曼光譜圖；圖4是本發明典型實施方案提供的系列樣品根據拉曼信號強度與汞離子濃度建立的標準曲線。
具體實施方式
12.鑑於現有技術中的不足，本案發明人經長期研究和大量實踐，得以提出本發明的技術方案。如下將對該技術方案、其實施過程及原理等作進一步的解釋說明。
13.在下面的描述中闡述了很多具體細節以便於充分理解本發明，但是，本發明還可以採用其他不同於在此描述的方式來實施，因此，本發明的保護範圍並不受下面公開的具體實施例的限制。
14.而且，諸如「第一」和「第二」等之類的關係術語僅僅用來將一個與另一個具有相同名稱的部件或方法步驟區分開來，而不一定要求或者暗示這些部件或方法步驟之間存在任何這種實際的關係或者順序。
15.參見圖1，本發明實施例提供一種基於核酸宏陣列和雙功能分子的汞離子檢測方法，包括：提供核酸宏陣列和信號探針，所述核酸宏陣列包括以陣列形式排列的多個固定探
3-吡啶醇中的任意一種或兩種以上的組合，當然並不局限於此，滿足具有拉曼特徵光譜，同時具有配位功能基團，例如吡啶基團以及具有連接金納米顆粒的功能基團例如巰基的功能分子均可以實現本發明的技術效果。
26.在一些實施方案中，所述固定探針的核酸序列可以為：5』（bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgctttgtt-3』，也可以為下述實施例所示例的：5』（bio-ttctcctctctttgtgttattgctttgtt-3』，本發明對固定探針的核酸序列不作限制，現有技術中提供了多種可選擇的固定探針的核酸序列，均可以實現對汞離子的選擇性吸附，也基於同樣的原理，可以實現汞離子的檢測，而非限定於本發明所具體列舉的幾種具體序列。
27.在一些實施方案中，所述固定探針包含多個t鹼基和/或，所述信號探針是通過使含有金納米粒子和雙功能分子的偶聯反應體系在2-8 ℃下進行偶聯反應5.5
ꢀ‑ꢀ
6.5 h後獲得，所述金納米粒子的平均粒徑可以為25
ꢀ‑
30nm，所述金納米粒子與雙功能分子的質量比可以為0.4:1~0.5:1。
28.而如圖1的右側部分所示，本發明人發現，通過銀染增敏處理，在金納米粒子催化和氫醌的還原作用下的，催化ag
+
還原為ag原子在金納米粒子表面成核，可以增強顯色強度和拉曼信號，從而提高檢測靈敏度。因而在一些實施方案中，所述汞離子檢測方法還可以包括：在進行顏色和/或拉曼光譜的測試前，對所述汞離子檢測體系進行銀染增敏處理的步驟；所述銀染增敏處理使銀納米材料沉積於所述汞離子檢測體系的表面。
29.在一些實施方案中，所述銀染增敏處理具體可以包括：使包含銀離子以及還原劑的銀染溶液與所述汞離子檢測體系接觸，進行銀沉積反應，並可以選擇通過洗滌去除所述銀染溶液中止所述銀沉積反應，以精準的控制反應時間。
30.在一些實施方案中，其較佳的銀染增敏處理的條件優選為：所述銀染溶液中的銀離子濃度可以為1.2
ꢀ‑
1.8 mol/l，還原劑濃度可以為0.1-0.3 g/ml；所述銀沉積反應的時間可以為2
ꢀ‑
3 min，溫度一般在常溫下進行，例如15-40℃，優選可以是15-37℃。
31.在一些實施方案中，所述銀染溶液的配製方法可以包括：將還原劑溶液和還原緩衝溶液在銀染增敏處理前25
ꢀ‑ꢀ
35 min以（2.5
ꢀ‑ꢀ
3.5）：1的體積比混合後保持35-40℃溫育，獲得混合溶液，所述原劑溶液中含有濃度為0.05
ꢀ‑ꢀ
0.06 g/ml的氫醌，所述還原緩衝溶液中含有濃度為0.25
ꢀ‑ꢀ
0.30 g/ml的檸檬酸和濃度為2.3
ꢀ‑ꢀ
2.4 g/ml的檸檬酸鈉；進行所述銀染增敏處理時，將混合溶液與硝酸銀溶液充分混合後立即使用。
32.其中，所述的立即使用，表示當混合後觀察無不均勻現象，或經過充分震蕩判斷其混合均勻後，在數秒鐘內，例如十秒鐘以下，即將配製好的銀染溶液與所述汞離子檢測體系接觸，接觸的方式包括但不限於浸泡、噴灑、塗覆等，使其發生銀沉積反應。
33.上述技術方案在前期製備的汞離子檢測體系的基礎上，通過繼續進行沉積一層銀層，可實現進一步增敏。通過繼續沉積一層銀層，一方面使汞離子檢測體系上的顏色加深，肉眼觀察的檢測靈敏度提高；另一方面，由於銀納米材料表面增強拉曼效應比金納米粒子更強，所以對雙功能分子例如4-mpy的拉曼信號進一步地增強，使本檢測方法的汞離子定量檢測靈敏度也相應提高。
34.在一些實施方案中，所述信號探針的製備方法具體可以包括：使膠體金分散液與雙功能分子的溶液混合構成偶聯反應體系。
35.在2-8℃下使所述偶聯反應體系發生偶聯反應5.5
ꢀ‑
6.5 h，獲得所述信號探針。
36.在一些實施方案中，所述汞離子檢測方法還可以包括：在將捕獲汞離子的所述核酸宏陣列與所述信號探針接觸之前，使用洗脫液將未被所述固定探針捕獲的游離汞離子洗脫的步驟。
37.在一些實施方案中，基於顏色的所述汞離子檢測方法的定性檢測限為0.4
ꢀ‑
0.6 nmol/l；基於拉曼光譜的所述汞離子檢測方法的定性檢測限為0.04
ꢀ‑
0.06 nmol/l，定量檢測限為0.02
ꢀ‑
0.03 nmol/l。
38.作為上述示例性概括的技術方案的一些典型的應用實例，上述汞離子檢測方法可以經過如下的具體步驟而得以實施：（1）核酸宏陣列的製備：將硝酸纖維素膜（nc膜）裁切成約1.5
×
1.5 cm大小的片狀備用。取3 μl100 μm5』端由生物素修飾固定探針向其中加入3 μl5 mg/ml鏈黴親和素和14 μl10mmpbs（ph7.4）混勻後，在室溫下，搖床孵育2 h後，用移液槍以0.3 μl每個點的量，點在上述製備好的nc膜片上，每片點五個點均勻對稱，之後將點好的陣列放入37℃的烘箱孵育3 h，使固定探針穩固的固定在陣列上，所用固定探針序列為:5』（bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgcttgt-3』。
39.（2）膠體金與4-巰基吡啶偶聯：每個1.5 ml離心管中分別加入1 ml製備好的膠體金溶液和30 μl濃度為0.1 mol/l的碳酸鉀溶液和10 μl濃度為0.1mol/l的4-巰基吡啶溶液，在孵育器上旋轉孵育15 min後，取下放置到4℃冰箱內老化6 h，使其充分偶聯；偶聯完成後將混合物於9000 rpm離心10min，棄上清用滅菌水恢復至原體積的1/10，構成金納米粒子-4-巰基吡啶複合物，4℃保藏備用。
40.（3）檢測重金屬汞離子：在核酸宏陣列核酸陣列表面分別滴加100 μl各個濃度的hg
2+
溶液，使得固定探針捕獲汞離子，充分反應半小時後，使用洗脫液洗脫去溶液中游離的汞離子，再加入100μl金納米粒子-4-巰基吡啶複合物反應10 min後用雙蒸水衝洗核酸陣列三次即可肉眼觀察到顯色效果。
41.（4）對反應後核酸陣列進行銀染增敏處理：在避光的環境下。取上述反應後得到的汞離子檢測體系進行銀染，所用溶液有agno3、氫醌、檸檬酸，分別為：a.0.5 gagno3/2 mlh2o。
42.b.1.7 g氫醌/30 mlh2o。
43.c.2.55 g檸檬酸/2.35 g檸檬酸三鈉/10mlh2o。
44.b液和c液以3：1的體積比混合，銀染時，加入120 μlagno3迅速混勻，立即加入各培養皿中，每個培養皿2 ml，反應一段時間後，直入超純水，終止反應，並用超純水反覆衝洗，最終得到銀染後的核酸宏陣列。
45.其中，所用固定探針序列可以為：5』（bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgctttgtt-3』；固定探針可以捕獲hg
2+
；膠體金可以偶聯4-巰基吡啶；洗脫液的組成可以為10 mmtris-hcl+1%peg + 1%tween-20，並可保證洗脫溶液中游離的汞離子；銀染增敏處理時，其中的b液和c液兩種溶液需新鮮配製，確保無結晶析出且無色，b液和c液以（3000 μl：1000 μl）的體積混
合，混合後應在銀染前30 min保持37℃溫育。
46.在上述應用實例中，固定於硝酸纖維膜上的探針，最終通過「t-hg
2+-4-mpy」的結構，將修飾了4-mpy的金納米粒子捕獲並固定到硝酸纖維膜表面，在汞離子濃度較高、捕獲金屬納米粒子量較多情況下實現顯色，從而通過肉眼觀察可實現定性檢測。待目標物濃度較低時，捕獲金納米粒子數目較少，肉眼無法識別，但依賴表面增強拉曼的高靈敏特性，通過在陣列上對4-mpy的拉曼信號進行採集，實現靈敏度的提升與定量檢測。
47.且需說明的是，本發明的重點技術手段在於核酸宏陣列與信號探針（包括其中的雙功能分子以及金納米粒子）的配合，以及進一步地通過銀染增敏處理來提高信號強度，而上述核酸宏陣列的製備方法，以及信號探針的具體製備方法，僅作為便於本領域技術人員理解本發明並參照實施所示例性闡述的內容，而並非本發明的關鍵技術手段，不應理解為對本發明保護範圍的限制。
48.相應的，為便於實現上述檢測方法，本發明實施例還可以提供對應於上述方法中所需試劑的試劑盒。
49.試劑盒相關的試劑種類以及濃度等於上述方法一一對應，在此不再贅述。
50.可以理解的，本領域技術人員完全可以參照現有技術所公開的多種製備方法，適應性地採取不同於此的製備方法甚至直接商購以獲得具有同樣功能的核酸宏陣列和/或雙功能分子，基於結構決定功能的認知，只要形成了與本發明所提供的技術方案中相同的核酸宏陣列和/或雙功能分子的結構，即可具有同樣的功能，而不限於具體的製備方法。
51.以下通過若干實施例並結合附圖進一步詳細說明本發明的技術方案。然而，所選的實施例僅用於說明本發明，而不限制本發明的範圍。
52.實施例1本實施例示例一基於核酸宏陣列和雙功能分子的汞離子檢測過程，其中包含了核酸宏陣列和信號探針的製備過程，具體如下所示：（1）nc膜上捕獲探針的固定：將購買的硝酸纖維素膜（nc膜）裁切成約1.5
×
1.5 cm大小的片狀備用。固定探針的5』端由生物素修飾，與鏈黴親和素（sav）偶聯過程如下：取3 μl100 μm固定探針向其中加入3 μl5 mg/ml鏈黴親和素和14 μl10 mmpbs（ph值7.4）混勻後，在室溫（室溫通常是指25-35℃，下同）下，搖床孵育2 h後，然後充分振蕩混勻，即可用於製備核酸宏陣列。將上述製備好的固定探針與鏈黴親和素的混合溶液用移液槍以0.3 μl每個點的量，點在上述製備好的nc膜片上，每片點五個點均勻對稱，形成陣列形式，之後將點好的陣列放入37℃的烘箱孵育3 h，使固定探針穩固的固定在陣列上。然後，取出放於室溫，待用。
53.所用固定探針的序列為:5』（bio）-ttcgcctctctttgtgtttttgctttgtt-3』。
54.（2）膠體金分散液的製備：所用的玻璃儀器都先用強酸浸泡，雙蒸水清洗乾淨後，烘箱烘乾備用；錐形瓶中裝入約三分之二的去離子水和攪拌子，在加熱磁力攪拌器上煮沸，然後，倒出裡面的沸水，待瓶子冷卻後，反覆幾次後即可製備金納米粒子。製備時，向潔淨的錐形瓶中加入150 ml雙蒸水和2.55 ml質量分數為0.5%的氯金酸溶液，中速攪拌，加熱至微微沸騰時加入質量濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液3 ml，邊加熱維持沸騰邊攪拌，溶液顏色最終變為酒紅色，當顏色不再
變化後關閉加熱攪拌5 min使反應充分完全；最後製得膠體金分散液，4℃保藏。
55.（3）信號探針的製備：每個1.5 ml離心管中分別加入1 ml製備好的膠體金分散液和30 μl濃度為0.1 mol/l的碳酸鉀溶液混合均勻，再加入10 μl濃度為0.1 mol/l的4-巰基吡啶溶液再次攪拌均勻，在孵育器上旋轉孵育15 min後，取下放置到4℃冰箱內老化6 h，使其充分偶聯；偶聯完成後將混合物於9000 rpm離心10min，棄上清用滅菌水恢復至原體積的1/10，構成金納米粒子-4-巰基吡啶複合物，4℃保藏備用。
56.（4）重金屬汞離子的檢測：hg
2+
標準樣品製備：從安瓿瓶中準確量取10 ml濃樣水質汞於250 ml容量瓶中，用3%硝酸稀釋定容至刻度得到11.7 ng/ml的hg
2+
標準溶液，再用水將標準溶液稀釋到各個待檢測濃度以備用於檢測；在核酸宏陣列核酸陣列表面分別滴加100 μl各個濃度的hg
2+
溶液，使得固定探針捕獲汞離子，充分反應半小時後，使用洗脫液（10 mm tris-hcl+1%peg+1%tween-20）洗脫去除溶液中游離的汞離子，再加入100 μl金納米粒子-4-巰基吡啶複合物反應10 min後用雙蒸水衝洗核酸陣列三次即可肉眼觀察到顯色效果，其變色效果如圖2中的第一行所示。
57.雷射器照射陣列上顯色陣列，採集4-mpy相應的拉曼信號圖譜，如圖3所示，分析其特徵峰處拉曼信號強度與對應汞離子濃度關係，並建立線性關係，完成定量檢測。重點檢測其中的4-巰基吡啶的特徵峰強度，繪製標準曲線，如圖4所示，然後測定將待測樣品採取步驟（4）中同樣的方法進行測試，然後即可基於上述標準曲線來計算樣品中的汞離子含量。
58.實施例2本實施例在實施例1的基礎上，進一步示例一種靈敏性更強的汞離子檢測方法，具體如下所示：在實施例1的步驟（4）之後，進一步增加下述步驟：（5）銀染增敏：在避光的環境下。取上述反應後得到的檢測體系進行銀染，所用溶液有三種：a.0.5 gagno3/2 ml h2o;b.1.7 g氫醌/30 ml h2o;c.2.55 g檸檬酸/2.35 g檸檬酸三鈉/10 ml h2o。
59.後兩種溶液需現配現用，確保無結晶析出且無色，b液和c液以（3000 μl：1000 μl）的體積混合，混合後應在銀染前30 min保持37℃溫育，銀染時，加入120 μlagno3迅速混勻，立即加入各培養皿中，每個培養皿2 ml，反應150秒後，置入超純水，終止反應，並用超純水反覆衝洗，最終得到銀染增敏處理後的檢測體系。
60.（6）拉曼檢測：雷射器照射檢測體系上的顯色區域，採集4-mpy相應的拉曼信號圖譜，分析其特徵峰處拉曼信號強度與對應汞離子濃度關係，並建立線性關係，完成定量檢測。
61.並且，本實施例中，肉眼可見的變色效果如圖2中的第二行所示，明顯可以知曉，經過銀染增敏處理後，不僅拉曼測試的靈敏度得以顯著提升，肉眼可見的顏色特徵也具有顯著提升。
62.實施例3
本實施例與實施例1大體相同，區別僅在於：將雙功能分子替換為2-巰基-3-吡啶醇。
63.將固定探針的序列替換為5』（bio）-ttctcctctctttgtgttattgctttgtt-3』。
64.將硝酸纖維素膜替換為whatman定性濾紙。
65.由此製備得到的核酸宏陣列和信號探針採用實施例1中的步驟（4）同樣的方法進行汞離子的檢測，依然具有同樣的變色能力和拉曼光譜的響應性，只不過由於雙功能分子的替換，其拉曼光譜的曲線形狀發生了改變以及特徵峰發生了位移而已。
66.實施例4本實施例在實施例3的基礎上，進一步示例一種靈敏性更強的汞離子檢測方法，具體如下所示：採用與實施例2同樣的步驟（5）和步驟（4），繼續在實施例3的基礎上進一步銀染增敏處理。
67.與實施例2相似，在實施例3的基礎上進一步銀染增敏處理後，其顏色變化更加明顯，且其拉曼光譜的特徵峰的強度也更高，這意味著即使採用了不同分子結構的固定探針和雙功能分子，只要其具有一致的結構特徵和功能性特徵，經過銀染增敏處理後的檢測靈敏度同樣能夠得以提升。
68.實施例5本實施例亦示例一種汞離子的檢測方法，與實施例3大體相同，區別僅在於：在製備信號探針過程中，增大了雙功能分子的濃度，使用濃度為0.2 mol/l。
69.由此製備得到的信號探針，由於膠體金表面活性位點有限，即使使用更高濃度的雙功能分子，膠體金表面標記的雙功能分子不會有明顯的增加，繼續採用實施例3中的步驟（4）同樣的方法進行汞離子的檢測，依然具有同樣的變色能力和拉曼光譜的響應性，並且相同條件下，拉曼信號不會有明顯的增強，說明採用濃度為0.1 mol/l的信號分子已經完全滿足需求，更高的濃度仍然可以實現本發明的技術效果，只是會造成一定的浪費而已。
70.實施例6本實施例在實施例5的基礎上，進一步示例一種靈敏性更強的汞離子檢測方法，具體如下所示：採用與實施例4同樣的步驟（5）和步驟（4），繼續在實施例5的基礎上進一步銀染增敏處理。
71.與實施例4相似，在實施例5的基礎上進一步銀染增敏處理後，其顏色變化更加明顯，且其拉曼光譜的特徵峰的強度也更高，這意味著即使提高了雙功能分子的濃度，也不會影響銀染增敏處理後的檢測靈敏度。
72.實施例7本實施例仍然示例一汞離子的檢測方法，與實施例6大體相同，區別僅在於：步驟（4） 中，汞離子標準品替換為含有相同濃度汞離子的自來水樣本。
73.在該檢測環境下，由於汞離子與t鹼基以及雙功能信號分子的特異性結合，不受自來水中其他成分的幹擾，仍舊能夠實現同樣的變色能力和拉曼光譜的響應性。
74.實施例8本實施例在實施例7的基礎上，進一步示例一種靈敏性更強的汞離子檢測方法，具
體如下所示：採用與實施例4同樣的步驟（5）和步驟（4），繼續在實施例7的基礎上進一步銀染增敏處理。
75.與實施例4相似，在實施例7的基礎上進一步銀染增敏處理後，其顏色變化更加明顯，且其拉曼光譜的特徵峰的強度也更高，這意味著即使被測樣品為成分較複雜的汞離子樣本，經過銀染增敏處理後的檢測靈敏度同樣能夠得以提升。
76.對比例1本對比例與實施例1大體相同，區別主要在於：步驟（2）和步驟（3）中，信號探針並未由膠體金分散液參與反應，而是直接以同樣濃度的4-巰基吡啶溶液作為信號探針的溶液。
77.即：本實施例缺失了金納米粒子對於拉曼信號強度的增強作用。
78.與此同時，沒有了金納米顆粒的顯色作用，顯然，無法通過肉眼觀察顏色改變來確定是否含有汞離子了。
79.並且，按照同樣的方法，在同樣的汞離子濃度下，本對比例所測得的拉曼信號的特徵峰強度僅僅為實施例1的1/105，該信號強度顯著弱於實施例1，這說明金納米粒子對於拉曼信號的增強具有非常重要的作用。
80.對比例2本對比例與實施例1大體相同，區別主要在於：金納米粒子表面未設置雙功能分子。
81.在此條件下，沒有了雙功能分子的橋梁作用，膠體金不能被捕獲到膜表面，膜表面無法顯色，顯然，不能通過肉眼觀察顏色改變來確定是否含有汞離子了。
82.並且，按照同樣的方法，在同樣的汞離子濃度下，本對比例中沒有信號分子，所以也測不到相應的拉曼圖譜，說明雙功能分子對於信號的產生具有關鍵的作用。
83.對比例3本對比例與實施例1大體相同，區別主要在於：未包括固定探針。
84.在沒有固定探針的條件下，膜表面失去了捕獲汞離子的能力，進而無法捕獲修飾了雙功能分子的膠體金，膜表面不能顯色，不能通過肉眼觀察判定被測樣本中是否含有汞離子，也測不到拉曼光譜，所以，固定探針對於本方案中汞離子的檢測至關重要。
85.對比例4本對比例與實施例1大體相同，區別主要在於：用銀納米粒子代替膠體金與雙功能分子結合。
86.步驟（2）中，玻璃儀器洗乾淨後，首先將30 ml 1mmol/l硝酸銀水溶液、0.04 g檸檬酸鈉、0.02 g聚乙烯吡咯烷酮和30 ml聚乙二醇加入裝有磁力攪拌子的玻璃器皿，在40℃水浴中加熱攪拌30 min，使藥品充分混合。隨後，邊攪拌，邊慢慢滴加30 ml 2 mmol/l的硼氫化鈉，最後溶液逐漸由乳白色逐漸變為土黃色，獲得所需銀納米粒子溶液，放置在4 ℃進行保存備用。隨後採用與實施例1中同樣的步驟（3）和步驟（4），並在步驟（3）中將膠體金替換為製備的銀納米粒子。
87.直接利用銀納米粒子的條件下，依舊可以進行顯色，並能夠實現同樣的變色能力和拉曼光譜的響應性。但是，銀納米粒子易氧化，製備過程中容易導致不規則的顆粒的形
成，影響信號探針製備的均一性；此外，已經製備完成的銀納米粒子由於其不穩定性，容易影響檢測的重複性，所以，優選穩定的金納米粒子製備信號探針。
88.對比例5本對比例與實施例1大體相同，區別主要在於步驟（5）銀染增敏所需的體系替換為傳統的銀鏡反應體系：a液：硝酸銀 3.5 g氫氧化銨適量在（滴加至由渾濁到透明即可）氫氧化鈉 2.5 g/100 ml蒸餾水60 mlb液：葡萄糖 45 g酒石酸4 g乙醇100 ml蒸餾水1000 ml使用時，按a:b=1:1混合，反應溫度為10~15℃，反應150秒後，置入超純水，終止反應，並用超純水反覆衝洗，最終得到銀染增敏處理後的檢測體系。
89.利用這種傳統化學鍍銀的方法，反應過程中沒有像實施例1中c液（2.55 g檸檬酸/2.35 g檸檬酸三鈉/10 ml h2o）提供穩定的緩衝體系，並且葡萄糖還原性較強使還原反應進行比較快速，不能保證還原反應特異性發生在具有較高活性的膠體金表面，加之膜基質具有較強的吸附性能，會使銀層非特異性地鍍在整個膜上，而非特異性沉積在陣列上，使得整個膜上都沉積一層銀，而非陣列形式，所以最終導致難以對汞離子進行精確檢測。
90.測試例1採用實施例1-實施例8及對比例1-對比例5的方法對於一種含汞廢水進行檢測，結果如下表1所示。
91.表1實施例1-實施例8及對比例1-對比例5方法對含汞廢水的檢測結果
92.基於上述實施例以及對比例，可以明確，本發明實施例提供的汞離子檢測方法利用修飾於金納米粒子表面的雙功能分子既能結合汞離子，又產生拉曼信號的特性，通過核酸固定探針與雙功能分子對汞離子的識別與捕獲進行顯色和/或拉曼檢測，避免了傳統的基於「t-hg
2+-t」結構檢測汞離子的方法中金納米粒子表面核酸的修飾，對於汞離子的檢測更加便捷和靈敏。
93.應當理解，上述實施例僅為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容並據以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。