一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法

2023-05-13 19:30:01

專利名稱：一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法
技術領域：
本發明屬於顯示刺激隱核蟲微管細胞骨架的方法領域，特別涉及一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法。
背景技術：
刺激隱核蟲俗稱「海水小瓜蟲」，是一種寄生在海水硬骨魚體的寄生纖毛蟲。該纖毛蟲體被分散排布且長短均一的纖毛，這些纖毛均由微管結構構成。刺激隱核蟲生活史分為滋養體、包囊體和幼蟲3個階段。該寄生蟲最早於1937年，由Sikama在日本的水族館內發現。近年來，隨著我國海水魚人工養殖業的發展，養殖密度的增加，及養殖管理方面的失誤，刺激隱核蟲病在沿海省市常有發生，給養殖戶和相關單位帶來了極大的經濟損失。長久以來，為了找到有效防治刺激隱核蟲病的方法，研究者開展了大量探索。眾所周知，所有真核生物細胞均具有高度發達、複雜的微管骨架系統。微管是細胞骨架中與細胞生命活動緊密聯繫的基本組分之一，除與維持細胞形態、承受外力、保持細胞內部結構的有序性、細胞的分裂增殖和運動等有關外，還與其致病性密切相關。因此，全面掌握刺激隱核蟲生命過程中微管骨架的結構及其變化特徵，可以為探明刺激隱核蟲細胞結構的形成及致病機理提供基礎資料，為找尋抗蟲藥物的作用靶點提供新的思路。目前，顯示微管細胞骨架的方法包括銀浸法、蛋白銀法、抗α/β_微管蛋白免疫螢光法等。但上述方法步驟相對複雜，操作耗時較長，且對實驗條件要求較高。因此需要一種既能與微管蛋白特異性結合，又便於操作，且高效省時的方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法，該方法操作簡單，效率高，且環保無汙染。本發明的一種顯不刺激隱核蟲微管骨架結構的直接突光標記方法，包括(I)將50-100μ O. 5-1.5% (V/V)多聚賴氨酸水溶液塗在潔淨的載玻片上，風乾，得到塗有多聚賴氨酸的載玻片；(2)吸取10-15隻刺激隱核蟲細胞，將其移入盛有ImL含有O. 5% (W/V)皂苷的 PHEM溶液的容器中，滲透O. 5-2min ；(3)吸除70-90%步驟(2)後的溶液，然後加入O. 5_2mL PHEM溶液浸浴3_5秒；(4)吸除70-90%步驟(3)後的溶液，得滲透後的細胞，然後將滲透後的細胞移入盛有O. 5-2mL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的容器中，固定10-20秒；(5)吸除70-90%步驟(4)後的多聚甲醛溶液，然後加入O. 5_2mL PHEM溶液，浸浴 3-5 秒；(6)吸除70-90%步驟(5)後的溶液，得固定後的細胞，再將固定後的細胞轉移至步驟(I)得到的塗有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)吸除步驟(6)後的多餘液體，然後迅速向細胞上滴加O. 05-0. 2mL O. 5% (V/V)Triton X-100 水溶液，處理 2_3min ；(8)吸除步驟(7)後的Triton X-100水溶液，然後向細胞上滴加O. 05-0. 2mL PHEM 溶液，浸浴3-5秒；(9)吸除步驟(8)後的PHEM溶液，然後向細胞上滴加O. 05-0. 2mL O. Olmol/L磷酸緩衝液PBS漂洗蟲體2-3次，每次2-4min ；(10)吸除步驟(9)後的PBS溶液，隨後迅速向細胞上滴加O. 01-0. 03mL含有 I μ mol/L螢光紫杉醇(FLUTAX-2)的0. 01mol/L的PBS溶液，於室溫避光孵育5_15min ；(11)吸除步驟(10)後的溶液，隨後向細胞上滴加O. 05-0. 2mL O. Olmol/L PBS緩衝液漂洗蟲體2-3次，每次2-4min，然後吸除多餘的溶液，加蓋蓋玻片；最後用顯微鏡觀察並照相，其中螢光的激發波長為492nm，發射波長為520nm。步驟(I)中所述的塗有多聚賴氨酸的載玻片上的多聚賴氨酸呈直徑Icm的圓形。步驟(2)所述的操作於萊卡Wild M5體視顯微鏡下進行。步驟⑵和⑷所述的容器為凹面皿。步驟⑵、(3)、(5)和⑶中所述的PHEM溶液為pH值為6. 9，含有60mmol/L PIPES, 25mmol/L HEPES, IOmmoI/L EGTA 和 6mmol/L MgCl2 · 6H20 的水溶液。步驟(9)、(10)和(11)中所述的磷酸緩衝液PBS為pH值為7. 4，含有136. 8mmol/ LNaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4 的水溶液。步驟(10)中所述的螢光紫杉醇(FLUTAX-2)購買與分子探針公司，其產品號 P22310。步驟(11)中所述的顯微鏡為奧林巴斯BX51螢光顯微鏡，照相採用Cool SNAP-Pro 數位相機。紫杉醇(Taxol)是一類可以與β _微管特異性結合的物質，FLUTAX是紫杉醇的一種衍生物，是將螢光素與紫杉醇結合而成。FLUTAX與β -微管特異性結合後，通過螢光顯微鏡觀察可以顯示刺激隱核蟲細胞的微管骨架結構。本發明中所涉及的V/V的單位均為mL/mL，所涉及的W/V的單位均為g/mL。有益效果本發明的方法操作簡單，耗時少，且環保無汙染。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。實施例I(I)用微量移液器吸取100 μ L 1% (V/V)多聚賴氨酸水溶液在潔淨的載玻片上塗一片直徑為Icm的圓形區域，風乾過夜待用；(2)於萊卡Wild M5體視顯微鏡下，用微吸管吸取10隻狀態良好的刺激隱核蟲滋養體期細胞，將其移入盛有ImL含有0.5% (W/V)皂苷的PHEM緩衝液的凹面皿中，滲透 Imin ；
(3)用微吸管吸除80%左右上步皂苷溶液，隨後用微量移液器向凹面皿中加入 ImLPHEM溶液浸浴5秒；(4)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨後用微吸管將滲透後的細胞移入盛有ImL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的另一凹面皿中，固定20秒；(5)吸除80%左右上步多聚甲醛溶液，隨後用微量移液器向凹面皿中加入ImL PHEM溶液，浸浴5秒；(6)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨後用微吸管將固定後的細胞轉移至塗有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)用微吸管吸除多餘液體，隨後迅速用微量移液器向細胞上滴加O. ImL 0.5% (V/V) Triton X-100 水溶液，處理 3min ；(8)吸除上步Triton X-100水溶液，隨後用微量移液器向細胞上滴加O. ImL PHEM 溶液，浸浴5秒；(9)吸除上步PHEM溶液，隨後用微量移液器向細胞上滴加O. ImL O.Olmol/L磷酸緩衝液(PBS，含有 136. 8mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/ LKH2PO4, pH 7. 4)漂洗蟲體3次，每次3min ；(10)吸除上步PBS溶液，隨後迅速用微量移液器向細胞上滴加0.02mL含有 lymol/L螢光紫杉醇(FLUTAX-2，分子探針公司，產品號P22310)的PBS (0. 01mol/L)溶液，於室溫避光孵育IOmin ；(11)吸除上步溶液，隨後用微量移液器向細胞上滴加0. ImL 0. 01mol/L PBS緩衝液漂洗蟲體3次，每次3min，然後吸除多餘的溶液，加蓋蓋玻片；用奧林巴斯BX51螢光顯微鏡觀察，Cool SNAP-Pro數位相機照相。螢光的激發波長為492nm，發射波長為520nm。實施例2(I)用微量移液器吸取50 μ L 1% (V/V)多聚賴氨酸水溶液在潔淨的載玻片上塗一片直徑為Icm的圓形區域，風乾過夜待用；(2)於萊卡Wild M5體視顯微鏡下，用微吸管吸取15隻狀態良好的刺激隱核蟲幼蟲期細胞，將其移入盛有ImL含有0. 5% (W/V)皂苷的PHEM緩衝液的凹面皿中，滲透Imin ；(3)用微吸管吸除80%左右上步皂苷溶液，隨後用微量移液器向凹面皿中加入 ImLPHEM溶液浸浴3秒；(4)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨後用微吸管將滲透後的細胞移入盛有ImL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的另一凹面皿中，固定10秒；(5)吸除80%左右上步多聚甲醛溶液，隨後用微量移液器向凹面皿中加入ImL PHEM溶液，浸浴3秒；(6)吸除80%左右上步PHEM溶液，隨後用微吸管將固定後的細胞轉移至塗有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)用微吸管吸除多餘液體，隨後迅速用微量移液器向細胞上滴加0. ImL 0.5% (V/V) Triton X-100 水溶液，處理 2min ；(8)吸除上步Triton X-100水溶液，隨後用微量移液器向細胞上滴加0. ImL PHEM 溶液，浸浴3秒；(9)吸除上步PHEM溶液，隨後用微量移液器向細胞上滴加0. ImL O.Olmol/L磷酸緩衝液(PBS，含有 136. 8mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/ LKH2PO4, pH 7. 4)漂洗蟲體2次，每次3min ；(10)吸除上步PBS溶液，隨後迅速用微量移液器向細胞上滴加O. 02mL含有 lymol/L螢光紫杉醇(FLUTAX-2，分子探針公司，產品號P22310)的PBS (O. Olmol/L)溶液，於室溫避光孵育IOmin ；(11)吸除上步溶液，隨後用微量移液器向細胞上滴加O. ImL O. Olmol/L PBS緩衝液漂洗蟲體2次，每次3min，然後吸除多餘的溶液，加蓋蓋玻片；用奧林巴斯BX51螢光顯微鏡觀察，Cool SNAP-Pro數位相機照相。螢光的激發波長為492nm，發射波長為520nm。
權利要求
1.一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法，包括(1)將50-100μ O. 5-1.5% (V/V)多聚賴氨酸水溶液塗在潔淨的載玻片上，風乾，得到塗有多聚賴氨酸的載玻片；(2)吸取10-15隻刺激隱核蟲細胞，將其移入盛有ImL含有O.5% (W/V)皂苷的PHEM 溶液的容器中，滲透O. 5-2min ；(3)吸除70-90%步驟(2)後的溶液，然後加入O.5-2mL PHEM溶液浸浴3_5秒；(4)吸除70-90%步驟(3)後的溶液，得滲透後的細胞，然後將滲透後的細胞移入盛有O.5-2mL 4% (W/V)多聚甲醛溶液的容器中，固定10-20秒；(5)吸除70-90%步驟(4)後的多聚甲醛溶液，然後加入O.5-2mL PHEM溶液，浸浴3_5秒；(6)吸除70-90%步驟(5)後的溶液，得固定後的細胞，再將固定後的細胞轉移至步驟(I)得到的塗有多聚賴氨酸的載玻片上；(7)吸除步驟(6)後的多餘液體，然後迅速向細胞上滴加O.05-0. 2mL 0.5% (V/V) Triton X-IOO 水溶液，處理 2_3min ；(8)吸除步驟(7)後的TritonX-100水溶液，然後向細胞上滴加O. 05-0. 2mL PHEM溶液，浸浴3-5秒；(9)吸除步驟(8)後的PHEM溶液，然後向細胞上滴加O.05-0. 2mL O. Olmol/L磷酸緩衝液PBS漂洗蟲體2-3次，每次2-4min ；(10)吸除步驟(9)後的PBS溶液，隨後迅速向細胞上滴加O.01-0. 03mL含有I μ mo I/L 螢光紫杉醇的0. 01mol/L的PBS溶液，於室溫避光孵育5_15min ；(11)吸除步驟(10)後的溶液，隨後向細胞上滴加0.05-0. 2mL 0. 01mol/L PBS緩衝液漂洗蟲體2-3次，每次2-4min，然後吸除多餘的溶液，加蓋蓋玻片；最後用顯微鏡觀察並照相，其中螢光的激發波長為492nm，發射波長為520nm。
2.根據權利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法，其特徵在於步驟(I)中所述的塗有多聚賴氨酸的載玻片上的多聚賴氨酸呈直徑Icm的圓形。
3.根據權利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法，其特徵在於步驟(2)所述的操作於萊卡Wild M5體視顯微鏡下進行。
4.根據權利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法，其特徵在於步驟(2)和(4)所述的容器為凹面皿。
5.根據權利要求I所述的一種顯不刺激隱核蟲微管骨架結構的直接突光標記方法， 其特徵在於步驟(2)、(3)、(5)和(8)中所述的PHEM溶液為pH值為6.9，含有60mmol/ LPIPES,25mmol/L HEPES, IOmmoI/L EGTA 和 6mmol/L MgCl2 · 6H20 的水溶液。
6.根據權利要求I所述的一種顯不刺激隱核蟲微管骨架結構的直接突光標記方法，其特徵在於步驟(9)、(10)和(11)中所述的磷酸緩衝液PBS為pH值為7. 4，含有136. 8mmol/ L NaCl, 2. 7mmol/L KCI, 10. lmmol/L Na2HPO4,1. 8mmol/L KH2PO4 的水溶液。
7.根據權利要求I所述的一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法， 其特徵在於步驟(11)中所述的顯微鏡為奧林巴斯BX51螢光顯微鏡，照相採用Cool SNAP-Pro數位相機。
全文摘要
本發明涉及一種顯示刺激隱核蟲微管骨架結構的直接螢光標記方法，包括先製備塗有多聚賴氨酸的載玻片；然後將刺激隱核蟲細胞用含有皂苷的PHEM溶液滲透，加入PHEM溶液浸浴；然後將滲透後的細胞用多聚甲醛溶液固定後用PHEM溶液浸浴，再將固定後的細胞移至上述塗有多聚賴氨酸的載玻片上；吸除多餘液體後向細胞上滴加Triton X-100水溶液，然後用PHEM溶液浸浴、0.01mol/L磷酸緩衝液漂洗；用含有1μmol/L螢光紫杉醇的PBS溶液於室溫避光孵育後用0.01mol/L PBS緩衝液漂洗，再吸除多餘的溶液，加蓋蓋玻片；最後用顯微鏡觀察並照相。本發明的方法操作簡單，效率高，且環保無汙染。
文檔編號C12Q1/02GK102608082SQ20111040748
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者孫鵬, 尹飛, 彭士明, 施兆鴻 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所