用於製備感受態細胞的細胞與其用途、新穎的大腸桿菌與其用途以及製備感受態細胞的方法

2023-05-16 02:01:41 1

專利名稱：用於製備感受態細胞的細胞與其用途、新穎的大腸桿菌與其用途以及製備感受態細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於製備感受態細胞的細胞，且特別涉及一種具備在細胞內自發性累積自體產生的(self-producing)海藻糖能力的細胞，以及以此細胞來製備感受態細胞的方法。
背景技術：
使帶有遺傳信息的DNA分子進入宿主細胞的過程即所謂的「轉化 (transformation) 」。而宿主細胞經過物理或化學方式處理而因此具有容易讓DNA分子進入胞內的特性，即稱為「感受態細胞(competent cell)」。在分子生物學領域及遺傳工程操作上，為了使宿主細胞進行特定DNA或蛋白質的複製或表達，獲得具有易於轉化的感受態細胞，即成了重要而不可或缺的步驟。由於大腸桿菌(Escherichia coli)具有生長快速、容易培養與研究較透徹等優勢，目前已成為所有生物技術相關實驗中最廣泛地用作宿主細胞的微生物。在近代遺傳工程技術演進的歷程上，已有許多製備具轉化能力的大腸桿菌感受態細胞的方法及轉化程序，例如，最早 1970 年 Mandel，M.和 Higa A. (J. Mol. Biol. 53 159)發表的 CaCl2 化學轉化法，以及之後 1983 年 Hanahan，D. (J. Mol. Biol. 166 :557)禾Π 1990 年 Inoue，H. (Gene 96 23)相繼通過在轉化試劑中加入其它不同濃度的陽離子和抗凍劑進行改良。而目前較佳的轉化效率已可達約IO8轉化子/微克質粒DNA(transformants/ μ g plasmid DNA)。而根據上述製備具轉化能力的大腸桿菌感受態細胞的方法所產生的感受態細胞， 其後續所需的儲藏溫度仍皆需為-70至-80°C左右，才能使感受態細胞在保存數月後轉化效率不至於明顯降低。近幾年美國Life Technologies公司研發出一種對溫度相對穩定型的感受態細胞的相關技術(美國專利號7，648，83 ，其突破傳統上感受態細胞必需保存於-70至-80°C 左右的低溫才能維持穩定轉化效率的限制。該實施方式是在製備和保存感受態細胞的試劑中添加特定糖類或化學聚合物分子作為抗凍保護劑，因而可將製備完成的感受態細胞置於較高溫度(例如-20°C )保存，且又不會明顯降低原有的轉化效率。前述技術雖然在保存條件的要求上較先前傳統製備方法節能及方便運送，然而額外添加的特定抗凍保護劑相對地也提高了製備上的成本。因此目前亟需開發出一種應用於感受態細胞的製備的新穎物件及方法，使因此產生的感受態細胞可於較高溫進行保存並同時達到節能、低成本與易於運送等優點，進而使生物細胞的基因轉化技術的實施更為簡易且經濟。

發明內容
本發明提供一種用於製備感受態細胞的細胞，其中該細胞具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力，且該細胞用於感受態細胞的製備。
本發明另外提供一種將具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力的細胞用於製備感受態細胞的用途。本發明還提供一種大腸桿菌(Escherichia coli)，命名為大腸桿菌EcDTreOOl， 其保藏於中國臺灣食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，保藏編號為BCRC No. 910491，其中該大腸桿菌具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力。所述大腸桿菌(命名為大腸桿菌(Escherichia coli)EcDTreOOl)也於2010年11 月11日保藏在德國微生物菌種保藏中心(DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)，Inhoffenstr. 7B, D-38124 不倫瑞克)，保藏號為 DSM 24175。本發明還提供一種將上述大腸桿菌用於製備感受態細胞的用途。本發明又提供一種製備感受態細胞的方法，包括培養上述用於製備感受態細胞的細胞以獲得細胞懸浮液；將該細胞懸浮液置於冰浴中；離心該細胞懸浮液以獲得細胞沉澱；混合轉化試劑和該細胞沉澱；以及獲得感受態細胞懸浮液。為了讓本發明的上述和其它目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉優選具體實施方案，並配合所附圖式，詳細說明如下


圖1為曲線圖，其顯示WT和TG兩種感受態細胞懸浮液在以_20°C保存6個月間的轉化效率的穩定度差異。圖2為長條圖，其顯示WT(a)、TG(a)、WT(b)和TG(b)四種感受態細胞懸浮液以-80°C及-20°C保存6個月間的轉化效率的穩定度差異。圖3A顯示，在實施例3中形成WT-B和TG-B組的感受態細胞懸浮液的過程。圖;3B為長條圖，其顯示WT、WT_B、TG和TG-B四組感受態細胞懸浮液在以_20°C保存6個月後的轉化效率的差異。主要組件符號說明
301 -、鋁珠；
303 -、感受態細胞懸浮液；
305 -、試管；
307 -、感受態細胞懸浮液與鋁珠的混合物
309 -、質粒；
311 - W水浴；
313 -、熱休克；
315 -、瓊脂培養基。
具體實施例方式
在本發明中，本發明提供一種具備在細胞內自發性累積自體產生的 (self-producing)海藻糖(trehalose)的能力的細胞，並將此細胞用於感受態細胞的製備。在細胞內累積的海藻糖可幫助細胞內蛋白質避免因低溫造成的變性與聚集，同時也具有穩定細胞膜的功能。因此，由本發明細胞所製備出的感受態細胞，相對於先前技術具有可在相對於較高溫且不需外加特定糖類或化學聚合物分子為抗凍劑的環境中進行保存等優點，且具有高轉化效率。另外此處使用的措辭「自體產生的海藻糖」是指細胞內(within a cell)所產生的海藻糖，而非額外添加於細胞培養基的海藻糖。上述本發明的細胞可通過對微生物進行隨機突變篩選或遺傳工程改造而獲得，但不限於此。微生物可包括，但不限於大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌或黴菌。大腸桿菌可包括，但不限於 DH5 α、JM109、XL1-Blue、HBlOl 或 BL21 等。在一個具體實施方案中，本發明的細胞通過對微生物進行遺傳工程改造而獲得。 上述遺傳工程改造可包括使微生物過表達至少一個內源性編碼海藻糖合成相關酶的基因、 和/或敲除微生物基因組中至少一個內源性編碼海藻糖分解相關酶的基因、和/或將至少一個編碼外源性海藻糖合成相關酶的基因引入微生物的基因組中。在一個具體實施方案中，使微生物過表達至少一個內源性編碼海藻糖合成相關酶的基因是通過將至少一個與目標微生物基因組中的特定基因的核苷酸序列相同或相似的核苷酸序列插入目標微生物中實現的。通過一般重組技術可實現上述微生物遺傳工程改造(參見，例如Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press·)。在一個具體實施方案中，微生物遺傳工程改造可以下述方法來進行。通過聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)從與目標微生物同種的細胞獲得上述至少一個編碼海藻糖合成相關酶的基因的核苷酸序列，和/或通過聚合酶鏈式反應從一種與目標微生物不同種的細胞獲得上述至少一個編碼海藻糖合成相關酶的基因的核苷酸序列。待獲得的酶基因的信息可從例如GenBank檢索。若需要的話，可根據所使用的目標微生物的不同，將所獲得的序列進行編碼最佳化以使其以後在宿主微生物中獲得最佳使用。之後，將由此製備的至少一個編碼出海藻糖合成相關酶基因的核苷酸序列，和/ 或至少一個編碼出海藻糖合成相關酶基因的核苷酸序列插入適合其表達的載體以產生表達上述酶的DNA構建體(DNAconstruct)。或者，進一步將上述DNA構建所形成的基因表達盒的兩端，再各連結一段可與編碼出海藻糖分解相關酶基因的核苷酸序列進行重組交換進而刪除此海藻糖分解相關酶基因的核苷酸序列。或是製備出至少一段可與目標微生物基因組中編碼出海藻糖分解相關酶的基因的核苷酸序列進行重組交換進而刪除此基因的核苷酸序列。然後，將包含於表達構建體中的上述基因表達盒或上述可與目標細胞基因組中編碼出海藻糖分解相關酶的基因的核苷酸序列進行重組交換進而刪除此海藻糖分解相關酶基因的核苷酸序列引入目標細胞中，並選擇陽性轉化子(positive transformant)以獲得本發明的經遺傳工程改造的細胞。又通過本技術領域所知的方法，例如，免疫印跡或酶活性分析，可確認上述基因的過表達或沉默刪除，或者基因的插入。此處使用的措辭「海藻糖合成相關酶」是指參與海藻糖合成的酶(例如，敘述於 Seo 等人，Appl. Environ. Microbiol. ,66(6) :2484_2490，2000 中的大腸桿菌(Escherichia coli)海藻糖合成相關酶)，其可為將其它分子經過至少一步的反應而轉換為海藻糖 (trehalose)的單一酶或酶群或其功能等同物(functional equivalents)。
在一個具體實施方案中，上述海藻糖合成相關酶可包括，但不限於海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS) (EC2. 4. 1. 15)、海藻糖 _6_ 磷酸 舞酸 Bl (trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP)(EC 3. 1.3.12)> α , α _ 海藻 || 磷酸合成酶(UDP 形成)(α，α -trehalose-phosphate synthase (UDP-forming)) (EC 2.4.1.15)、α , α-海藻糖合成酶(α，α -trehalose synthase) (EC 2. 4. 1. 245)、海藻糖磷酸酶(trehalose-phosphatase) (EC 3. 1. 3. 12)、4_ α -D- ((1 — 4) - α -D-葡萄糖酸)
M 7K 0 S$ (4-alpha-D-((l 4) -alpha-D-glucano)trehalosetrehalohydrolase) (EC 3. 2. 1. 141)、(1 — 4)-a -D-葡聚糖 1_ a -D-葡糖基變位酶((1 — 4) - a -D-glucan 1-a -D-glucosylmutase) (EC 5· 4· 99· 15)、α -D-葡萄糖基轉移酶 (α -D-glucosyltransferase) (EC 5. 4. 99. 16)和/或前述酶的功能等同物等。上述海藻糖合成相關酶的詳細資料如表1所示。表1、示範的海藻糖合成相關酶
權利要求
1.一種用於製備感受態細胞的細胞，其中該細胞具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力，且該細胞用於感受態細胞的製備。
2.如權利要求1所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中該細胞通過對微生物進行隨機突變篩選或遺傳工程改造而獲得。
3.如權利要求2所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述微生物包括大腸桿菌、 酵母菌或黴菌。
4.如權利要求3所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述大腸桿菌包括DH5α、 JM109、XL1-Blue、HBlOl 或 BL21。
5.如權利要求2所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述遺傳工程改造包括使所述微生物過表達至少一個內源性編碼海藻糖合成相關酶的基因、和/或敲除所述微生物基因組中至少一個內源性編碼海藻糖分解相關酶的基因、和/或將至少一個編碼外源性海藻糖合成相關酶的基因引入該微生物的基因組中。
6.如權利要求5所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中該海藻糖合成相關酶包括海藻糖-6-磷酸合成酶(EC 2. 4. 1. 15)、海藻糖-6-磷酸磷酸酶(EC 3. 1. 3. 12)、α，α -海藻糖磷酸合成酶(UDP形成)(EC 2. 4. 1.15), α, α -海藻糖合成酶(EC 2. 4. 1. 245)、海藻糖磷酸酶(EC 3. 1.3. 12)、4-0-0-((1 — 4)-(1-0-葡萄糖酸)海藻糖水解酶(EC 3.2. 1. 141)、 (1 — 4)-α-D-葡聚糖1-α-D-葡糖基變位酶(EC 5.4.99.15)、α-D-葡萄糖基轉移酶 (EC5. 4. 99. 16)和/或前述酶的功能等同物。
7.如權利要求5所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述海藻糖分解相關酶包括細胞質海藻糖酶、周質海藻糖酶和/或前述酶的功能等同物。
8.如權利要求1所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中該細胞通過使大腸桿菌 DH5a的細胞過表達至少一個內源性編碼海藻糖合成相關酶的基因和敲除該大腸桿菌 DH5 α的細胞基因組中至少一個內源性編碼海藻糖分解相關酶的基因來獲得。
9.如權利要求8所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述海藻糖合成相關酶包括海藻糖-6-磷酸合成酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶。
10.如權利要求9所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述海藻糖-6-磷酸合成酶的胺基酸序列和該海藻糖-6-磷酸磷酸酶的胺基酸序列分別為序列辨識號1的序列和序列辨識號2的序列。
11.如權利要求9所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中編碼所述海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列和編碼所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的核苷酸序列分別為序列辨識號3的序列和序列辨識號4的序列，或與前述序列具有至少80%序列相似性的序列。
12.如權利要求8所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中該海藻糖分解相關酶包括細胞質海藻糖酶。
13.如權利要求12所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中編碼該細胞質海藻糖酶基因的核苷酸序列為序列辨識號5的序列，或與前述序列具有80%序列相似性的序列。
14.如權利要求8所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述海藻糖分解相關酶包括周質海藻糖酶。
15.如權利要求14所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中編碼出該周質海藻糖酶基因的核苷酸序列為序列辨識號6的序列，或與前述序列具有80%序列相似性的序列。
16.如權利要求1所述的用於製備感受態細胞的細胞，其中所述細胞於2010年11月 11日保藏在德國微生物菌種保藏中心，保藏號為DSM 24175.
17.一種將具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力的細胞用於製備感受態細胞的用途。
18.一種新穎的大腸桿菌，其保藏於德國微生物菌種保藏中心，保藏號為DSM 24175, 其中該大腸桿菌具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力。
19.一種將權利要求18所述的大腸桿菌用於製備感受態細胞的用途。
20.一種製備感受態細胞的方法，包括培養如權利要求1所述的用於製備感受態細胞的細胞以獲得細胞懸浮液；將該細胞懸浮液置於冰浴中；離心該細胞懸浮液以獲得細胞沉澱；混合轉化試劑和該細胞沉澱；以及獲得感受態細胞懸浮液。
21.如權利要求20所述的製備感受態細胞的方法，其中所述感受態細胞懸浮液保存於-10°C以下。
22.如權利要求20所述的製備感受態細胞的方法，其中所述感受態細胞懸浮液保存於-20"C。
23.如權利要求20所述的製備感受態細胞的方法，另外包括將至少一個固體球狀物加至所述感受態細胞懸浮液中。
24.如權利要求23所述的製備感受態細胞的方法，其中所述固體球狀物的形成材料包括玻璃、陶瓷、不鏽鋼、鐵或鋁。
25.如權利要求23所述的製備感受態細胞的方法，其中所述固體球狀物的粒徑為約 2-6mm。
全文摘要
本發明涉及用於製備感受態細胞的細胞與其用途、新穎的大腸桿菌與其用途以及製備感受態細胞的方法。本發明提供了一種用於製備感受態細胞的細胞，其中該細胞具備在細胞內自發性累積自體產生的海藻糖的能力，且該細胞用於感受態細胞的製備。
文檔編號C12N1/19GK102559507SQ20111002131
公開日2012年7月11日 申請日期2011年1月17日 優先權日2010年12月14日
發明者洪婷婷, 王嘉宏, 蔡孟吟, 鄧克立 申請人:財團法人工業技術研究院