麻竹花葯誘導體胚並獲得再生植株的方法
2023-05-16 02:26:41 2
專利名稱：麻竹花葯誘導體胚並獲得再生植株的方法
技術領域：
本發明涉及麻竹的組織培養技術，特別是一種從麻竹花葯誘導體胚，最終獲得再生植株的方法，屬於生物技術和現代農業技術領域。
背景技術：
麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)為禾本科竹亞科牡竹屬麻竹亞屬，原產中國，自然分布於福建、臺灣、廣東、廣西、貴州和雲南等省，是我國華南及東南沿海地區重要的優良、速生、筍材兩用的大型叢生竹種之一。麻竹很少開花，品種選育主要以自然界優良無性系選育為主，遺傳改良受到限制。雖然以麻竹營養器官為外植體能夠獲得愈傷組織，但難以誘導分化，獲得再生植株。1990年Tsay首先報導了麻竹花葯離體培養(Plant CellRep 9，349 - 351)。他們在含2，4_D的培養基上誘導出胚性愈傷並獲得再生植株，經過15個月的培養獲得了十幾棵單倍體植株，移栽生長6個月後死亡，此後未見相關報導。利用花葯離體培養可在短期內獲得性狀豐富的單倍體或純合的二倍體植株，大幅度縮短育種周期，提高選擇效率。對於麻竹來說，通過花葯培養誘導胚性愈傷組織，建立植株再生體系，突破麻竹組織培養技術的瓶頸，將為現代生物技術應用於麻竹育種開闢新的途徑。
發明內容
本發明提供一種麻竹花葯培養方法，通過選擇處於特定發育時期的未成熟花葯、添加植物生長調節劑、優化培養條件來提高麻竹胚性愈傷組織的誘導率和再生植株的成功率，
本發明的具體描述如下:
1、所述的麻竹花葯應選擇小孢子的發育時期為單核靠邊期的花葯，此時從外觀上觀察，小穗呈淡紫色，長1.2cm左右，頂端小花柱頭稍微露出，花葯呈淡黃色。2、所述的外植體在接種前先經過2-6天的低溫(4_15°C )預處理。3、所述的外植體採用流水衝洗I小時，70%乙醇表面消毒，消毒時間為30秒，無菌水衝洗3-5次後，2%次氯酸鈉進行表面消毒，消毒時間控制在10-15分鐘，無菌水衝洗3-5 次。4、所述的體胚誘導與增殖時，培養條件為暗培養；溫度為22_28°C。5、所述的體胚分化時，光照條件為人工輔助光1000-30001ux，光照時間14_16小時/天；溫度為22-27°C。6、所述體胚誘導與增殖培養基M8+2 mg*L_1NAA+0.5 mg*^6^+15mg*L 1PAA+ .5 mg*L ^ΤΞ+δΟΟ mg*L 1CH+100 mg*L 1 Proline+100 mg*L 1 Glutamin+5.4%Maltose+0.8% Agar, pH5.8。7、所述體胚分化培養基為 MS+1 mg-L'1 NAA+0.5 mg L_16-BA+4mg*L ^T+S^oSucrose+0.8% Agar, pH5.8。
8、所述的麻竹生根培養基為 1/2MS+ 3%Sucrose+0.8% Agar 3%，ρΗ5.8。
9、所述組培苗經在生根培養基中培養3-5周後，練苗3-4天，移栽至蛭石泥炭土基質中培養，保持溼度高於80%，每天噴水2-3次。
具體實施方式
步驟I
採集發育時期為單核靠邊期的麻竹花葯。在麻竹花期採集長度為1.0-1.4cm小穗，用鑷子剝去稃片，剝出花葯置於載玻片上，加一小滴醋酸洋紅，用鑷子搗碎，去除殘渣，蓋上玻片，顯微鏡鏡檢，總結小穗長度、外觀等與小孢子發育時期的關係，保證採集、篩選後的小穗中大部分花葯處於單核靠邊期。通常小穗長1.2cm左右的中上部小花的花葯處於單核小孢子晚期，符合花葯培養的發育條件。步驟2 麻竹花葯誘導體胚。採集生長單核晚期的小穗，採用流水衝洗I小時，70%乙醇表面消毒30秒，無菌水衝洗3-5次後，2%次氯酸鈉進行表面消毒10-15分鐘，無菌水衝洗3-5次；將花葯從小穗中剝離，儘量避免花葯受傷，均勻接種到花葯體胚誘導培養基上。步驟3 麻竹體胚分化
體胚在原誘導培養基上或者MS培養基上都可以分化成苗，但是在添加了 6-BA、NAA和KT的分化培養基上分化效率更高。在含6-BA0.5 mg-rSNAAl.0 π^. ΛΚΤ4 mg.!/1的分化培養基上，麻竹花葯體胚分化率可達80%以上，該濃度為麻竹花葯體胚分化最佳激素濃度配比。
步驟4
麻竹花葯培養組培苗的生根培養
麻竹花葯培養誘導的是胚性組織，較易生根，體胚形成後，部分體胚在誘導或分化培養基上即可生根成苗，將已生根的和未生根的苗轉入不加任何激素的1/2MS培養基中，添加3%蔗糖，0.8%瓊脂，pH5.8，光照條件為人工輔助光1000-3000LUX，光照時間為16h，溫度為22-27度。培養3-5周，生根率可達97%。步驟5
麻竹花葯培養再生苗的移栽
待組培苗平均每株生根4-5條，根長帶到3-4cm時，即可開始為移栽作準備。煉苗是組培苗移栽前的過渡，可以幫助組培苗逐步適應外界環境，提高成活率。麻竹組培苗煉苗3-4天後，移栽至蛭石泥炭土基質中培養，基質按1:1比例混合，提前鋪滿穴盤，清水浸透；組培苗移栽後保持溼度80%，每天噴水2-3次，2周後即可進行正常管理，移栽成活率達90%以上。
權利要求
1.一種麻竹離體花葯誘導體胚並最終獲得再生植株的方法，包括外植體的選擇、外植體的預處理、外植體的消毒與接種、體胚誘導與增殖、體胚分化、組培苗生根培養與移栽，其特徵在於，所述外植體經消毒後先在添加植物生長調節劑的改良M8培養基上誘導出愈傷組織並形成體胚，再轉移至分化培養基生成植株，在生根培養基上生長3-5周後，移植至泥炭土蛭石基質中於溫室或光照培養箱內培養。
2.根據權利要求1所述的麻竹花葯培養方法，其特徵在於，所述的外植體為麻竹未成熟花葯，從外觀上觀察，小穗呈淡紫色，長1.2cm左右，頂端小花柱頭稍微露出，花葯呈淡黃色。
3.根據權利要求1所述的麻竹花葯培養方法，其特徵在於，所述外植體在接種前先經過2-6天的低溫(4-15°C)預處理。
4.根據權利要求1所述的麻竹花葯培養方法，其特徵在於，所述外植體採用流水衝洗I小時，70%乙醇表面消毒，消毒時間為30秒，無菌水衝洗3-5次後，1%-3%次氯酸鈉進行表面消毒，消毒時間控制在10-15分鐘，無菌水衝洗3-5次。
5.根據權利要求1所述的麻竹花葯培養方法，其特徵在於，所述體胚誘導與增殖時，培養條件為暗培養；溫度為22-28°C ;當誘導體胚分化時，光照條件為人工輔助光1000-30001ux，光照時間14-16小時/天；溫度為22-27。。。
6.根據權利要求1所述的麻竹花葯培養方法，其特徵在於，所述體胚誘導與增殖培養基為 M8+2 mg.!/1 NAA+0.5 mg.171 6-BA+15 mg.171 PAA+7.5 mg.171 STS+500mg*L_1CH+100 mg*L_1 Proline+100 mg*L_1 Glutamin+5.4% Maltose +0.8% Agar, pH5.8。
7.根據權利要求1所述的麻竹花葯培養方法，其特徵在於，所述體胚分化培養基為MS+1 mg*L 1 NAA+0.5 mg*L 1 6-BA+4 mg*L 1 KT+3%Sucrose+0.8% Agar, pH5.8。
全文摘要
本發明公開了麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)花葯誘導體胚並獲得再生植株的方法，屬於生物技術和現代農業技術領域。本發明包括外植體的選擇、外植體的預處理、外植體的消毒與接種、體胚誘導與增殖、體胚分化、組培苗生根培養與移栽，其特徵在於，麻竹花葯體胚誘導與增殖培養基為M8+2mg L-1NAA+0.5mg L-16-BA+15mg L-1PAA+7.5mg L-1STS+500mg L-1CH+100mg L-1Proline+100mg L-1Glutamin+5.4%Maltose+0.8%Agar，pH5.8，所述體胚分化培養基上MS+1mg L-1NAA+0.5mg L-16-BA+4mg L-1KT+3%Sucrose+0.8%Agar，pH5.8；所述麻竹花葯組培苗生根培養基為1/2MS+3%Sucrose+0.8%Agar3%,pH5.8。利用本發明得到的再生苗可用於麻竹品種選育。
文檔編號A01H4/00GK103155862SQ20111041157
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者蔣晶, 喬桂榮, 卓仁英 申請人:蔣晶