表達鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的傷寒沙門氏菌Ty21a及其用途

2023-05-16 15:19:01 2

表達鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的傷寒沙門氏菌Ty21a及其用途
【專利摘要】本文描述了用於表達鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的質粒構建體的產生。在所公開的質粒中，所述F1-V融合蛋白編碼序列與大腸桿菌htrA啟動子可操作地連接，並且與大腸桿菌HlyA分泌信號序列框內融合。還描述了包含所述F1-V融合蛋白表達質粒的腸道沙門氏菌血清變型傷寒沙門氏菌菌株Ty21a，例如用作抗鼠疫的口服疫苗。
【專利說明】表達鼠疫耶爾森氏菌F1-V融合蛋白的傷寒沙門氏菌Ty21 a 及其用途
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求於2012年5月23日提交的美國臨時申請61/650, 676的優先權，所述 臨時申請以引用的形式全文納入本文。

【技術領域】
[0003] 本公開內容涉及開發用於產生針對鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis)--鼠疫 的致病菌一一的保護作用的免疫原性組合物。本公開內容還涉及包含Fl-V融合蛋白表達 構建體的傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhi)菌株Ty21a，及其使用方法。

【背景技術】
[0004] 鼠疫耶爾森氏菌是鼠疫的致病菌。歷史上已記錄了鼠疫的至少3次大流行，其 殺死了近2億人。鼠疫是人畜共患病（zoonotic disease)，通常通過被感染的跳蚤的 叮咬傳播。鼠疫耶爾森氏菌的天然貯存宿主包括齧齒目動物、松鼠和草原犬鼠 （prairie dog)。目前，鼠疫耶爾森氏菌的大的貯存宿主存在於除了澳大利亞之外的所有主要人類 棲息地（Sun et al.，J Infect Dev Ctries 5(9):614-627, 2011)。鼠疫在世界上許多 地方流行，包括非洲、中國、印度、南美部分地區和美國西南部（Yang et al.，J Immunol 178:1059-1067, 2007 ;Leary et al·，Microb Pathog23:167-179, 1997)。最近的流行病學 研宄表明，全世界每年有大約4000個人類鼠疫病例（Sun et al.，J Infect Dev Ctries 5(9) :614-627, 2011)。因此，鼠疫仍然是嚴重的公共健康問題。
[0005] 鼠疫最常表現為腺鼠疫，其特徵在於突然發熱以及靠近跳蚤叮咬處的淋巴結 腫痛（"炎性淋巴腺腫"）。用抗生素迅速治療通常是有效的（Morton et al.，Vaccine 22:2524-2532, 2004)。但是，細菌能夠從跳蚤叮咬處廣泛傳播，並且在某些情況下，會感染 肺部。如果肺部被感染，鼠疫可在由咳嗽或噴嚏所產生的氣溶膠中傳播，導致原發性肺鼠疫 的爆發（Leary et al·，Microb Pathog 23:167-179,1997)。肺鼠疫是高度傳染性的，並且 通常是致命的（Morton et al.，Vaccine22:2524-2532, 2004)。因為鼠疫是高度傳染性的， 並且能通過氣霧化傳播，鼠疫耶爾森氏菌被認為是潛在的生物武器（Sun et al.，J Infect Dev Ctries 5(9):614-627, 2011 ;Yang et al.，J Immunol 178:1059-1067, 2007)〇


【發明內容】

[0006] 本文公開了用於表達鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白的質粒構建體的產生。還公 開了包含所述公開的質粒構建體的腸道沙門氏菌血清變型傷寒沙門氏菌菌株Ty21a(稱為 "傷寒沙門氏菌Ty2la"或"Ty2la"），例如用作抗鼠疫的疫苗。
[0007] 本文提供了重組核酸分子，包含可操作地連接到誘導型啟動子的鼠疫耶爾森氏 菌Fl-V融合蛋白編碼序列，所述誘導型啟動子在真核宿主細胞中具有活性，如大腸桿菌 (Escherichia coli)htrA啟動子。在某些實施方案中，所述核酸分子包含與SEQ ID N0:1 的核苷酸1-1558至少85 %相同的序列。在一些實施方案中，所述核酸分子還包含分泌信 號肽編碼序列（如大腸桿菌HlyA分泌信號序列），其與Fl-V融合蛋白編碼序列框內融合。 在具體的非限制性實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1的序列。
[0008] 還提供了包含所公開的核酸分子的質粒，以及包含所公開的核酸分子或質粒的傷 寒沙門氏菌Ty2Ia細菌。
[0009] 在一個非限制性實施方案中，提供了重組核酸分子，其包含與大腸桿菌htrA啟動 子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列，以及與所述Fl-V融合蛋 白編碼序列框內融合的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列，其中所述核酸分子的序列包 含SEQ ID N0:1。還提供了包含所述核酸分子、複製起點、選擇性標記以及大腸桿菌HlyB和 HlyD蛋白編碼序列的質粒。還提供了包含所述質粒的傷寒沙門氏菌Ty21a。
[0010] 還提供了免疫原性組合物，其包括包含Fl-V表達質粒的傷寒沙門氏菌Ty2Ia和可 藥用載體。
[0011] 本公開內容還提供了在受試者中引起針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應答的方法，所 述方法是通過給予所述受試者包含Fl-V表達載體的傷寒沙門氏菌Ty21a或是通過給予本 文所公開的免疫原性組合物進行。還提供了在受試者中預防鼠疫、降低發生鼠疫的風險或 治療鼠疫的方法，所述方法是通過給予所述受試者包含本文所公開的質粒或重組核酸分子 的傷寒沙門氏菌Ty21a或是通過給予如本文所公開的免疫原性組合物進行。
[0012] 根據以下參考附圖進行的詳細描述，本發明的前述和其他目的、特徵和優點將會 變得更加顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1是克隆到質粒pHtrFl-V-Hly中的所述合成Fl-V融合DNA插入片段的示意圖。
[0014] 圖2是質粒pHtrFl-V-Hly(9407bp)的示意圖，其由克隆到低拷貝質粒pGB-2中的 鼠疫Fl-V基因融合構建件組成。所述pGB-2複製起點（ORI)的位置與可選擇的大觀黴素 抗性基因（spcR)相鄰。所述合成的基因融合插入片段是由與Fl-V基因連接的（其通過修 飾的接頭（linker)序列相互融合）並且與HlyA細胞外分泌信號（HlyAs)連接的htrA啟 動子組成。所述質粒還包括分泌機器蛋白HlyB和HlyD的編碼序列。
[0015] 圖3示出了通過SDS-PAGE對蛋白質提取物進行的分析。使用pHtrFl-V-hly (包含 鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白）或pHtrPAcm-hly(包含炭疽芽孢桿菌保護性抗原（PA);如 記載於 Osorio et al.，Infect Tmmun 77 (4) : 1475-1482, 2009)轉化傷寒沙門氏菌 Ty21a。 使培養物過夜培養，並收集培養物上清液（S)和細胞沉澱（P)。通過SDS-PAGE分析蛋白質 提取物，並用市售的抗Fl單克隆抗體或抗V單克隆抗體探測。用pHtrFl-V-hly轉化的傷 寒沙門氏菌Ty21a產生並分泌所述Fl-V融合蛋白（58kDa)。
[0016] 圖4的兩個圖示出了針對Fl-V和PA抗原的總的血清IgG效價。通過腹膜內途 徑，使用3個每兩周一次的劑量（含有產生Fl-V或之前構建的炭疽桿菌PA的傷寒沙門氏 菌Ty2la)免疫10隻6-8周齡小鼠的組。第三組小鼠接受了產生Fl-V的Ty2Ia和產生PA 的Ty21a的1:1的混合物。對照組小鼠接受了 3個劑量的用空pGB-2載體轉化的Ty21a。 經免疫的小鼠接受了 2-5X IO7菌落形成單位形成單位（CFU)/劑量。在第三次和最後一次 免疫後一周收集血清。通過ELISA分析總的循環Fl-V特異性和PA特異性的IgG效價。
[0017] 圖5的圖表示出了針對Fl-V抗原的總的血清IgG效價。每兩周使用以Fl-V質粒 或空pGB-2載體轉化的傷寒沙門氏菌Ty21a，通過腹膜內途徑，免疫8周齡小鼠（每個時間 點每一組η = 5)3次。在0周、2周和4周時，小鼠接受了 2-5X IO7菌落形成單位（CFU)/ 劑量。在〇、1、3和5周時，收集來自每次處理的5隻小鼠的血清。通過ELISA分析總的循 環Fl-V特異性的IgG效價。
[0018] 圖6A-6D的圖表示出了對rFl-V的脾細胞體外回憶應答。未對10隻6-8周齡小鼠 的組進行免疫，或者通過腹膜內途徑使用3個每兩周一次的劑量（含有產生Fl-V或空pGB2 載體的Ty21a)對其進行免疫。經免疫的小鼠接受2-5X IO7CFU/劑量。在第三次和最後一 次免疫後一周收集脾細胞，並在體外用rFl-V刺激72小時。收集培養物上清液並針對細胞 因子進行分析。
[0019] 序列表
[0020] 列於所附序列表中的核酸和胺基酸序列是使用如37C. F. R. 1. 822所定義的核苷 酸鹼基的標準字母縮寫和胺基酸的三字母編碼顯示。只顯示每條核酸序列的一條鏈，但是 應理解任何提及所示鏈時均包括其互補鏈。所述序列表以創建於2013年5月9日的13. 8KB 的ASCII文本文件提交，以引用的方式納入本文。在所附序列表中：
[0021] SEQ ID NO: 1是克隆到質粒pHtrFl-V-Hly中的所述Fl-V融合DNA插入片段的核 苷酸序列。SEQ ID NO: 1包含以下元件：
[0022] 核苷酸1-112 = htrA啟動子序列
[0023] 核苷酸113-562 = Fl抗原編碼序列
[0024] 核苷酸563-580 =接頭序列
[0025] 核苷酸581-1558 = V抗原編碼序列
[0026] 核苷酸1559-1747 = HlyA分泌信號序列
[0027] SEQ ID NO: 2是所述Fl抗原的胺基酸序列。
[0028] SEQ ID NO:3是所述接頭肽的胺基酸序列。
[0029] SEQ ID NO:4是所述V抗原的胺基酸序列。
[0030] SEQ ID NO: 5是所述HlyA分泌信號肽的胺基酸序列。

【具體實施方式】
[0031] I.縮寫
[0032] CFU 菌落形成單位
[0033] ELISA 酶聯免疫吸附測定
[0034] Fl 級分1抗原
[0035] IFN 幹擾素
[0036] IL 白細胞介素
[0037] i.p. 腹膜內
[0038] ORI 複製起點
[0039] PA 保護性抗原
[0040] SDS-PAGE十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳
[0041] TNF 腫瘤壞死因子
[0042] V 毒力抗原
[0043] II.術語和方法
[0044] 除非另有說明，技術術語以常規用法使用。分子生物學中的常用術語 的定義可見於由 Benjamin Lewin, Genes V，published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew et al. (eds. ),The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. ,1994(ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (ed. ), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc. ,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0045] 為了便於閱讀本公開內容的各個實施方案，提供了以下對具體術語的解釋：
[0046] 佐劑：非特異性增強對抗原的免疫應答的物質或載體。佐劑可包括其上吸附有抗 原的礦物質（明礬、氫氧化鋁或磷酸鹽）的懸液；或其中抗原溶液被乳化在礦物油中的油 包水乳劑（例如，弗氏不完全佐劑），有時包含滅活的分枝桿菌（mycobacteria)(弗氏完全 佐劑）以進一步增強抗原性。免疫刺激性寡核苷酸（例如包含CpG基序的那些）也可用 作佐劑（例如，參見美國專利 6, 194, 388、6, 207, 646、6, 214, 806、6, 218, 371、6, 239, 116、 6, 339, 068、6, 406, 705和6, 429, 199)。佐劑還包括生物分子，例如共刺激分子。示例性生物 佐劑包括 IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF- a、IFN- γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 4IBBL。
[0047] 給藥：給予、施用組合物或使其與受試者接觸。給藥可通過許多途徑中的任一種來 完成，例如，局部、口服、皮下、肌內、腹膜內、靜脈內、鞘內和肌肉內給藥。在本文所述的一些 實施方案中，通過口服途徑將免疫原性組合物給予受試者。
[0048] 編碼序列：編碼蛋白或肽（即包含開放閱讀框）的核酸序列。
[0049] Fl抗原：鼠疫耶爾森氏菌毒性蛋白。Fl抗原是由鼠疫耶爾森氏菌特有的IOOkb的 質粒編碼，並且是包含鼠疫耶爾森氏菌的莢膜的主要蛋白組分。所述Fl抗原被認為能阻止 宿主細胞的吞噬作用。所述Fl抗原還被稱為"F1莢膜抗原"。Fl序列是已知的且可公開 獲得（例如在GenBank資料庫中）。示例性的Fl抗原核苷酸序列在本文被列出為SEQ ID NO: 1的核苷酸113-562 ;示例性的Fl胺基酸序列被提供為SEQ ID NO:2。
[0050] 框內融合：是指這樣的兩條核酸序列，即它們被連接起來以使得它們在同一閱讀 框內。
[0051] 融合蛋白：通過表達由編碼兩種不同蛋白質中的至少一部分的核酸序列改造而來 的核酸序列而產生的蛋白質。為了產生融合蛋白，所述核酸序列必須在相同閱讀框內（"框 內"），並且不含內部終止密碼子。
[0052] HlyB和HlyD :原核溶血素分泌蛋白。在本文的一些實施方案中，所公開的質粒編 碼大腸桿菌HlyB和HlyD蛋白。編碼大腸桿菌HlyB和HlyD的低拷貝質粒（pGB-2)之前已 記載於美國專利7, 758, 855中，其以引用的方式納入本文。
[0053] 免疫應答：免疫系統的細胞（如B細胞、T細胞、巨噬細胞或多形核細胞）對刺激 物（如抗原）的應答。免疫應答包括參與宿主防禦反應的任何機體的細胞，包括例如，分泌 幹擾素或細胞因子的上皮細胞。免疫應答包括但不限於先天免疫應答或炎症。如本文所使 用的，保護性免疫應答是指保護受試者免遭感染（預防感染或預防與感染有關的疾病的發 生）的免疫應答。
[0054] 免疫：使受試者受到保護免患疾病（例如，傳染病），例如通過疫苗接種。
[0055] 免疫原性組合物：本文使用的術語意指可用於在受試者中刺激或引發特定的免疫 應答（或免疫原性應答）的組合物。在本文的一些實施方案中，所述免疫原性組合物包括 包含Fl-V表達質粒的傷寒沙門氏菌Ty21a。在一些實施方案中，所述免疫原性應答是保護 性的或提供保護性免疫，因為其使得所述受試者能更好地抵禦鼠疫耶爾森氏菌感染或由鼠 疫耶爾森氏菌所致的疾病進展（例如，腺鼠疫或肺鼠疫）。一種類型的免疫原性組合物的具 體實例是疫苗。
[0056] 在一些實施方案中，免疫原性組合物的"有效量"或"免疫刺激量"是在給藥受試者 時足以產生可檢測的免疫應答的量。這樣的應答可包括，例如，產生特異性針對所述免疫原 性組合物中提供的一種或多種表位的抗體。或者，所述應答可包含針對所述免疫原性組合 物中提供的一種或多種表位的基於T輔助細胞或CTL的應答。所有這三種應答可源自初始 細胞（nai_ve cell)或記憶細胞。在其他實施方案中，免疫原性組合物的"保護性有效量" 是在給藥動物時足以賦予所述動物保護性免疫力（如抵禦鼠疫的保護作用）的量。
[0057] 分離的："分離的"或"純化的"生物組分（例如核酸、肽或蛋白質）已經基本上從 所述組分天然存在於其中的生物體的細胞中其他生物組分中（即，其他的染色體和染色體 夕卜DNA和RNA，以及蛋白質）分離、分開產生或純化出來。已經被"分離"或"純化"的核酸、 肽或蛋白質因此包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白質。所述術語還包括通過在宿主 細胞中重組表達而製備的核酸、肽和蛋白質，以及化學合成的核酸或蛋白質。所述術語"分 離的"或"純化的"不要求絕對的純度；而是旨在作為一個相對術語。因此，例如，分離的生 物組分是這樣的組分，即其中所述生物組分比其細胞內天然環境或其他生產容器中的所述 生物組分更富集。優選地，將製品純化以使得所述生物組分佔所述製品的總生物組分含量 的至少50%，如至少70%、至少90%、至少95 %或更高。
[0058] 核酸分子：多聚形式的核酸，其可包括RNA、cDNA、基因組DNA以及上述的合成形式 和混合聚合物的正義鏈和反義鏈。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或任一類型核苷酸 的修飾形式。本文使用的術語"核酸分子"是"核酸"和"多核苷酸"的同義詞。除非另有說 明，核酸分子的長度通常為至少10個鹼基。所述術語包括單鏈和雙鏈形式的DNA。多核苷 酸可包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸連接鍵（linkage)而連接在一起的天 然存在的和經修飾的核苷酸的任一種或兩種。
[0059] 開放閱讀框（ORF):編碼沒有任何內部終止密碼子的胺基酸的一系列核苷酸三聯 體（密碼子）。這些序列通常可被翻譯成肽/多肽/蛋白質/多聚蛋白。
[0060] 可操作地連接：當第一核酸序列與第二核酸序列的位置處於有功能的關係時，所 述第一核酸序列與第二核酸序列可操作連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表 達，則所述啟動子可操作地連接於所述編碼序列。通常，可操作地連接的DNA序列是連續 的，並且當需要連接兩個蛋白編碼區域時則位於相同的閱讀框中。如果存在內含子，則可操 作地連接的DNA序列可以是不連續的。
[0061] 複製起點（ORI):在基因組或質粒中（DNA複製在其中起始）的特定核酸序列。ORI 的具體結構因物種而異，但是通常所有的都具有高AT含量的特徵。
[0062] 可藥用載體：可用於本公開內容的可藥用載體是常規的。Remington' s Pharmaceutical Sciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 15 版 (1975)描述了適於一種或多種治療化合物或分子以及其他藥物製劑的藥物遞送的組合物 和製劑。
[0063] 通常，所述載體的性質會取決於採用的具體給藥模式。例如，腸胃外製劑通常包括 可注射液體作為載體，所述可注射液體包括可藥用和生理上可接受的液體如水、生理鹽水、 平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。對於固體組合物（例如，粉劑、丸劑、片劑或膠囊劑形 式），常規的無毒固體載體可包括，例如藥品級甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除了生物學 中性的載體之外，待給藥的藥物組合物可包含少量的無毒輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑、 防腐劑和PH緩衝劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。
[0064] 鼠疫：由腸桿菌科家族中的非運動性、生長緩慢的兼性細菌--鼠疫耶爾森氏菌 導致的傳染病。鼠疫耶爾森氏菌是通過嚙齒類動物（特別是大鼠）攜帶，並且在以其為食 的跳蚤中。其他動物和人類通常直接因嚙齒類動物或跳蚤叮咬而感染所述細菌。感染鼠疫 耶爾森氏菌可導致腺鼠疫、敗血性鼠疫或肺鼠疫。
[0065] 在鼠疫耶爾森氏菌誘導的致病的最常見形式一一腺鼠疫中，細菌感染淋巴系統， 使其發炎。腺鼠疫通常通過感染的跳蚤或齧齒動物的叮咬而感染。在少數情況下，來自患鼠 疫的人使用的一塊汙染的衣服或其他材料的鼠疫耶爾森氏菌通過皮膚上的開口進入。腺鼠 疫侵襲淋巴結，並且在暴露於所述細菌的3-7天內，出現類似於流感的症狀，如發熱、頭痛、 寒戰、虛弱和腫脹、觸痛的淋巴腺（炎性淋巴腺腫）。腺鼠疫很少在人和人之間傳播。
[0066] 敗血性鼠疫以與腺鼠疫相同的方式感染，通常通過跳蚤或齧齒動物叮咬感染，並 且細菌在血液中增殖。但是，敗血性鼠疫的特徵在於細菌增殖發生在血流中而不僅僅是在 淋巴系統中。敗血性鼠疫通常作為未治療的腺鼠疫或肺鼠疫的併發症出現，其症狀包括發 熱、寒戰、虛弱、腹痛、休克，以及皮下或其他器官出血。但是，在敗血性鼠疫中不會產生炎性 淋巴腺腫，並且敗血性鼠疫很少在人和人之間傳播。
[0067] 肺鼠疫是鼠疫的最嚴重形式，並且在鼠疫耶爾森氏菌感染肺部並引起肺炎時 發生。當鼠疫耶爾森氏菌被吸入時，可感染肺鼠疫。在暴露於肺鼠疫的空氣播散飛沫 (airborne droplet) 1-3天內，就會產生發熱，頭痛，虛弱，帶有氣短、胸痛、咳嗽以及有時血 痰或水樣痰的肺炎的快速發生。當腺鼠疫和敗血性鼠疫在所述疾病擴散到肺部後未得到治 療時，此類鼠疫可在人和人之間傳播。在這點上，通過所感染的個體咳嗽或噴嚏時釋放到空 氣中的攜帶鼠疫耶爾森氏菌的飛沫（respiratory droplet)，所述疾病可被傳播給其他人。
[0068] 質粒：能夠在宿主細胞中自主複製的環形核酸分子。在本公開內容的一些實施 方案中，所述質粒是低拷貝數質粒。例如，所述低拷貝數質粒可以是在宿主細胞中產生約 1-10(例如3-9或5-7)個拷貝的所述質粒的質粒。在具體實施例中，所述低拷貝數質粒在 宿主細胞中產生約5-7個拷貝。在具體實施例中，所述低拷貝數質粒是基於記載於以引用 的方式納入本文的美國專利7, 758, 855中的pGB-2質粒。
[0069] 預防、治療或減輕疾病："預防"疾病是指抑制疾病的全面發生。"治療"是指當疾 病或病理病症開始發生後減輕疾病或病理病症的徵象（signs)或症狀的治療性幹預。"減 輕"是指減少疾病徵象或症狀的數量或嚴重程度。
[0070] 啟動子：一系列指導核酸轉錄的核酸控制序列。啟動子包括在轉錄起始位點附 近的必需核酸序列。啟動子還任選地包括可定位於距轉錄起始位點起多達幾千個鹼基對 的遠端增強子或抑制子元件。包括組成型啟動子和誘導型啟動子（參見，例如Bitter et al.，Methods in Enzymology 153:516-544, 1987)。在本文的一些實施方案中，所述啟動子 是大腸桿菌的htrA(高溫需求A)基因的啟動子。所述htrA啟動子是在原核細胞的沙門氏 菌感染過程中具有活性的誘導型啟動子。在具體的非限制性實施例中，所述htrA啟動子序 列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1-112。
[0071] 重組體：重組體核酸或蛋白質是具有非天然存在的序列或具有通過人工組合兩個 原本獨立的序列片段而產生的序列的重組體核酸或蛋白質。所述人工組合常常是通過化學 合成或通過人工操縱的分離核酸片段（例如通過遺傳工程技術）完成。
[0072] 腸道沙門氏菌（Salmonella enterica):-種革蘭氏陰性的、杆狀、有鞭毛的細菌。 所述腸道沙門氏菌種包括超過2500種不同的血清變型（serovar)，其中之一是傷寒沙門氏 菌血清變型。
[0073] 傷寒沙門氏菌Ty21a :Ty21a是腸道沙門氏菌血清變型傷寒沙門氏菌的菌株。 Ty21a是減毒的活細菌菌株，其被用作抗傷寒的口服疫苗（Osorio et al.，Infect Immun 77(4):1475-1482, 2009 ；Germanier and Furer1J Infect Dis 131:553-558, 1975 ；ffahdan et al. , Bull WH058:469-474, 1980 ；U. S. Patent No. 3, 856, 935) 〇
[0074] 選擇性標記：編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質賦予表達所述標記的生物體 (如細菌）陽性或陰性選擇優勢。選擇性標記包括，例如，抗生素抗性基因，如壯觀黴素。
[0075] 序列同一性：胺基酸或核酸序列之間的相似性被表示為所述序列之間的相似性， 又稱為序列同一性。序列同一性常以同一性（或相似性或同源性）百分數來度量；所述百 分數越高，兩個序列越相似。當使用常規方法進行比對時，給定基因或蛋白的同系物或變體 具有相對高的序列同一性程度。
[0076] 比對用於比較的序列的方法在本領域中是公知的。多種程序和比對算法記載 於：Smith and Waterman, Adv. AppI. Math. 2:482, 1981 ；Needleman and ffunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970 ；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:2444, 1988 ； Higgins and Sharp,Gene 73:237-244, 1988 ;Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-153, 1989 ；Corpet et al.,Nucleic Acids Research 16:10881-10890,1988； Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 85:2444, 1988;和 Altschul et al. , Nature Genet. 6:119-129, 1994。
[0077] NCBI 基礎局部比對搜索工具（BLAST?) (Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)可以從若干來源獲得，包括美國國立生物技術信息中心（NCBI， Bethesda，MD)和網際網路，用於與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx 聯合使用。
[0078] 在本文的一些實施方案中，提供了與SEQ ID NO: 1-5中有任一個至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相同的核苷酸或氨 基酸序列。
[0079] 血清變型（Serovar):物種或亞種的細分，通過一組特徵性抗原來區分。血清變型 (Serovar)還被稱為"血清型（serotype)
[0080] 信號肽：指導蛋白質翻譯後轉運的短肽鏈（長度一般為3-60個胺基酸）。分泌信 號肽是指導蛋白質從產生其的細胞中分泌的信號肽。在本文的一些實施方案中，所述分泌 信號肽是來自大腸桿菌溶血素蛋白HlyA的信號肽。在具體的非限制性實施例中，所述HlyA 分泌信號肽具有SEQ ID N0:5的胺基酸序列，並且由SEQ ID NO: 1的核苷酸1559-1747編 碼。
[0081] 受試者：活的多細胞脊椎生物一一包括人和非人哺乳動物的種類。
[0082] 治療有效量：足以在用該試劑治療的受試者中達到所需效果的具體試劑的量。例 如，這可以是用於在受試者中引起免疫應答和/或用於預防鼠疫耶爾森氏菌感染的含Fl-V 表達質粒的傷寒沙門氏菌Ty21a的量。理想地，在本公開內容的上下文中，含Fl-V表達質 粒的傷寒沙門氏菌Ty21a的治療有效量是足以在受試者中增加對由鼠疫耶爾森氏菌引起 的感染的抵抗力，預防、減輕和/或治療所述感染，而不會在所述受試者中導致明顯的細胞 毒性作用的量。用於在受試者中增加對感染的抵抗力，預防、減輕和/或治療感染的含Fl-V 表達質粒的傷寒沙門氏菌Ty21a的治療有效量會取決於，例如，被治療的受試者、治療組合 物的給藥方式和其他因素。
[0083] 單位劑量：包含經計算以單獨或共同產生所需作用（如免疫原性作用）的預定量 的活性物質的物理獨立單位。可使用單個單位劑量或多個單位劑量以提供所需作用，例如 免疫原性作用。在一個實施例中，單位劑量包括所需量的如本文所公開的表達Fl-V融合蛋 白的傷寒沙門氏菌。
[0084] V抗原：由IcrV基因編碼的鼠疫耶爾森氏菌毒性蛋白。V抗原是在鼠疫耶爾森氏 菌毒力中發揮多功能作用的分泌蛋白。例如，V抗原是低鈣應答毒性基因表達的正調控因 子，並參與效應蛋白通過II型分泌系統向真核細胞的易位。V抗原還被認為通過抑制細胞 因子如IFN-γ和TNF-α的產生而發揮免疫調節劑的作用。V抗原序列是已知的並可公開 獲得。本文提供的示例性V抗原核苷酸序列為SEQ ID NO: 1的核苷酸581-1558,並且本文 列出的示例性V抗原胺基酸序列為SEQ ID NO: 4。
[0085] 疫苗：可被給予受試者（如獸醫或人類受試者）而賦予對疾病或其他病理病症 (如鼠疫）的免疫力（如主動免疫）的免疫原性組合物。疫苗可用於治療或用於預防。因 此，疫苗可用於降低感染的可能性或降低疾病或病症的症狀的嚴重程度或限制所述疾病或 病症的進展。在本文的實施例中，所述疫苗包含如本文所公開的表達Fl-V融合蛋白的傷寒 沙門氏菌。
[0086] 鼠疫耶爾森氏菌：革蘭氏陰性的、杆狀細菌。鼠疫耶爾森氏菌是能夠感染人類和其 他動物的兼性厭氧菌。鼠疫耶爾森氏菌的感染能導致腺鼠疫、敗血性鼠疫或肺鼠疫。
[0087] 除非另有說明，本文使用的所有技術術語和科學術語的含義與本公開內容所屬領 域的普通技術人員通常所理解的含義相同。除非上下文中另有明確說明，單數術語"一"、 "一個"和"所述"包括複數指代對象。類似地，除非上下文中另有明確說明，詞語"或"意欲 包括"和"。因此，"包含A或B"意指包括A、或B、或A和B。還應理解，對於核酸或多肽給 出的所有鹼基大小或胺基酸大小，以及所有分子量和分子質量值都是近似值，並且用於描 述目的。儘管與本文描述的方法和材料相似或等價的方法和材料可用於本公開內容的實施 或測試，但適合的方法和材料如下所述。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其他參 考文獻以引用的方式全文納入本文。如果出現衝突，以本說明書（包括對術語的解釋）為 準。此外，所述材料、方法和實施例僅是說明性的，不意欲進行限制。
[0088] III.若干實施方案概述
[0089] 本文公開了用於表達鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白的質粒構建體的開發。還公 開了包含Fl-V融合蛋白表達質粒的腸道沙門氏菌血清型傷寒沙門氏菌菌株Ty21a (在本文 稱為"傷寒沙門氏菌Ty21a"或"Ty21a"），其例如用作抗鼠疫的口服疫苗。
[0090] 本文提供了一種重組核酸分子，其包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連 接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列。所述htrA啟動子是在真核宿主細胞中具有 活性的誘導型啟動子。在某些情況下，所述Fl和V蛋白的編碼區被核酸接頭（如包含SEQ ID NO: 1的核苷酸563-580的接頭）分隔開。
[0091] 在一些實施方案中，所述Fl-V融合蛋白編碼序列與SEQ ID NO: 1的核苷酸 113-1558有至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相 同。在具體的實施例中，所述Fl-V融合蛋白編碼序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸113-1558 或由其組成。
[0092] 在一些實施方案中，所述htrA啟動子序列與SEQ ID NO: 1的核苷酸1-112有至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %相同。在具體的實 施例中，所述htrA啟動子序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1-112或由其組成。
[0093] 在一些實施方案中，所述包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫 耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列的核酸分子包含與SEQ ID NO: 1的核苷酸1-1558有至 少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的序列。在 具體的實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1-1558或由其組成。
[0094] 在一些實施方案中，所述重組核酸分子還包含與Fl-V融合蛋白編碼序列框內融 合的分泌信號肽編碼序列。在一些實施例中，所述分泌信號肽是大腸桿菌HlyA分泌信號 肽。在具體的非限制性實施例中，所述大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列與SEQ ID NO: 1 的核苷酸1559-1747有至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或 至少99%相同，或者包含SEQ ID NO: 1的核苷酸1559-1747或由其組成。
[0095] 在具體的實施方案中，所述重組核酸分子的序列與SEQ ID NO: 1有至少85%、至 少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同。在具體的非限制性 實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1或由其組成。
[0096] 還提供了包含本文所公開的重組核酸分子的質粒。因此，在一些實施方案中，所 述質粒包含與SEQ ID NO: 1有至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%或至少99%相同的核酸序列，或包含SEQ ID NO: 1。
[0097] 在一些實施方案中，所述質粒是低拷貝數質粒。例如，所述低拷貝數質粒可以是在 宿主細胞中產生約1-10或3-9或5-7個拷貝的質粒。在具體的實施例中，所述低拷貝數質 粒在宿主細胞中產生約5-7個拷貝。在具體的實施例中，所述低拷貝數質粒是基於美國專 利7, 758, 855中所述的pGB-2質粒，所述美國專利以引用的方式納入本文。
[0098] 在一些實施方案中，所述質粒還包含選擇性標記。選擇性標記為本領域中所公知 的，適合的選擇性標記可由本領域技術人員根據所述質粒的所需選擇標準和特定用途來進 行選擇。在一些實施例中，選擇性標記是抗生素抗性基因。在一個非限制性實施例中，所述 選擇性標記是壯觀黴素抗性基因。
[0099] 在一些實施方案中，所述質粒還包含大腸桿菌HlyB和HlyB蛋白編碼序列。所述 HlyB和HlyD蛋白是溶血素分泌蛋白，其使得由該質粒編碼的Fl-V融合蛋白能夠進行細胞 外分泌。
[0100] 還提供了包含本文所公開的重組核酸分子或質粒的傷寒沙門氏菌Ty21a細菌。傷 寒沙門氏菌Ty21a是減毒的活細菌菌株，該菌株被批准作為用於傷寒的口服疫苗。已證明 傷寒沙門氏菌Ty21a的給藥是安全的，並且此菌株之前已被有效地用於表達炭疽芽孢桿菌 保護性抗原（PA)(參見，例如，Osorio et al·，Infect Immun 77 (4) :1475-1482, 2009;和美 國專利7, 758, 855,其以引用的方式納入本文）。本文公開了傷寒沙門氏菌Ty21a細菌作為 載體來遞送鼠疫耶爾森氏菌的經克隆的Fl和V抗原（作為融合蛋白）的用途。
[0101] 還提供了包含含有本文公開的質粒或重組核酸分子的傷寒沙門氏菌Ty21a，以及 可藥用載體的免疫原性組合物。在一些實施方案中，所述免疫原性組合物被配製為用於口 服給藥。在一些實施方案中，以單位劑量形式配製所述免疫原性組合物。
[0102] 還提供了在受試者中引起針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應答的方法，所述方法是通 過給予所述受試者包含本文公開的質粒或重組核酸分子的傷寒沙門氏菌Ty21a細菌，或通 過給予如本文所公開的免疫原性組合物進行。在一些實施方案中，所述免疫應答是保護性 免疫應答。在一些實施方案中，治療性地給予所述傷寒沙門氏菌Ty2Ia或所述免疫原性組 合物，例如在鼠疫耶爾森氏菌感染之後。在其他實施方案中，預防性地給予所述傷寒沙門氏 菌Ty21a或所述免疫原性組合物，例如為預防鼠疫耶爾森氏菌感染或降低鼠疫耶爾森氏菌 感染的風險。
[0103] 還提供了在受試者中預防鼠疫、降低發生鼠疫的風險或治療鼠疫的方法，所述方 法是通過給予所述受試者包含本文公開的質粒或重組核酸分子的傷寒沙門氏菌Ty21a，或 通過給予如本文所公開的免疫原性組合物進行。所述鼠疫可以是腺鼠疫、敗血性鼠疫或肺 鼠疫。在一些實施方案中，治療性地給予所述傷寒沙門氏菌Ty21a或所述免疫原性組合物， 例如在所述受試者中已經產生鼠疫的臨床徵象之後。在其他實施方案中，預防性地給予所 述傷寒沙門氏菌Ty21a或所述免疫原性組合物，例如為預防鼠疫或降低鼠疫風險。
[0104] 在一個非限制性實施例中，本文提供了包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作 地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白編碼序列框內融合 的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列的重組核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO:1〇
[0105] 在另一個非限制性實施例中，提供了一種質粒，其包含（i)包含與大腸桿菌htrA 啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白 編碼序列框內融合的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列的重組核酸分子，其中所述核酸 分子的序列包含SEQ ID NO: I ; (ii)複製起點；（iii)選擇性標記；以及（iv)大腸桿菌HlyB 和HlyD蛋白編碼序列。
[0106] 在另一個非限制性實施例中，提供了包含重組核酸分子或質粒的傷寒沙門氏菌 Ty21a，其中所述重組核酸分子或質粒包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠 疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白編碼序列框內融合的大腸桿菌 HlyA分泌信號肽編碼序列，其中所述核酸分子或質粒的序列包含SEQ ID N0:1。還提供了 包括傷寒沙門氏菌Ty21a和可藥用載體的免疫原性組合物。在一些情況下，所述免疫原性 組合物被配製為用於口服給藥。還提供了在受試者中引起針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應答 的方法，所述方法是通過給予所述受試者所述傷寒沙門氏菌Ty21a或所述免疫原性組合物 進行。
[0107] 在另一個非限制性實施例中，提供了用於產生抵禦鼠疫的保護作用的口服疫苗， 其中所述疫苗包含重組核酸分子或質粒，其中所述重組核酸分子或質粒包含與大腸桿菌 htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合 蛋白編碼序列框內融合的大腸桿菌HlyA分泌信號肽編碼序列，其中所述核酸分子或質粒 的序列包含SEQ ID NO: 1。
[0108] 本文公開的重組核酸分子和質粒，以及本文公開的包含所述重組核酸分子或質粒 的傷寒沙門氏菌Ty21a，相對於在先記載的鼠疫疫苗具有若干優勢。例如，所述大腸桿菌 htrA啟動子主要在體內具有活性，從而使得所述Fl-V融合蛋白能夠在哺乳動物宿主細胞 中有效表達，而限制在肉湯培養物中的表達，這促進了用於疫苗生產的表達構建體的穩定 性。宿主細胞中Fl-V的有效表達，增強了在所述宿主中引起的免疫應答，提高了疫苗的效 力。另外，使用低拷貝質粒（如PGB-2質粒），還增強了所述Fl-V表達構建體的穩定性。另 夕卜，使用大腸桿菌HlyA分泌信號以及大腸桿菌HlyB和HlyD蛋白編碼序列增強了所述Fl-V 融合蛋白在宿主中的細胞外分泌，進一步提高了由所述疫苗引起的免疫應答。最後，使用傷 寒沙門氏菌Ty21a使得獲得了用於口服給藥鼠疫疫苗的安全且有效的方式。
[0109] IV.免疫原性組合物的配製和給藥
[0110] 本文公開的重組核酸分子、質粒和免疫原性組合物可方便地以單位劑型呈現，並 通過傳統製藥技術製備。此類技術包括使活性成分和藥物載體或賦形劑結合的步驟。一般 而言，通過使活性成分與液體載體均一且緊密地結合來製備所述製劑。所述製劑可以單位 劑量或多劑量容器（如密封的安瓿瓶和小瓶）呈現，並且可貯存在冷凍乾燥（凍幹）條件 下，僅需要在臨使用前加入無菌液體載體（例如，注射用水）。臨時注射溶液和懸液可由本 領域普通技術人員所通常使用的無菌粉末、顆粒和片劑製備。
[0111] 在某些實施方案中，單位劑型是包含所給予的組分的一個劑量或一個單位或者其 適當級分的那些。應理解，除了以上特別提到的所述組分，本文涵蓋的製劑可包括本領域普 通技術人員通常使用的其他試劑。
[0112] 本文提供的組合物（包括用作免疫原性組合物的那些），可通過不同途徑（如口 月艮（包括口腔和舌下）、直腸、腸胃外、噴霧（aerosol)、鼻內、肌內、皮下、皮內和局部）給 藥。它們可以不同形式給藥，包括但不限於溶液、乳液和懸液、微球、顆粒、微粒、納米顆粒和 脂質體。在具體的實施方案中，所述免疫原性組合物通過口服給藥。
[0113] 給藥量將根據給藥途徑而變化。本領域普通技術人員會了解不同給藥途徑的合適 給藥量。
[0114] 給藥可通過單劑量或多劑量完成。在本公開內容的上下文中，給予受試者的劑量 應足以隨時間引起有益的治療反應，例如預防鼠疫耶爾森氏菌感染或鼠疫的發生。所需劑 量可根據，例如所述受試者的年齡、體重和總體健康狀況而改變。
[0115] 選擇每一劑量中的免疫原性組合物的量作為引起免疫刺激應答而沒有明顯有害 副作用的量。這種量將根據所使用的具體組合物及其如何給藥而變化。初始劑量的範圍可 為約1 μ g到約lmg，一些實施方案具有約10 μ g到約800 μ g的範圍，並且其他實施方案的 範圍是約25 μ g到約500 μ g。在初次給予所述免疫原性組合物之後，受試者可以接受一次 或多次充分間隔的加強給藥。加強給藥的範圍可為約Iyg到約lmg，其他實施方案的範圍 為約IOyg到約750 μ g，還有其他的實施方案的範圍為約50 μ g到約500 μ g。可能需要以 1-5年（例如3年）的間隔進行定期加強以維持保護性免疫的所需水平。
[0116] 當將細菌作為所述免疫原性組合物的組分進行給藥時，可通過製劑中的菌落形成 單位（CFU)的數量來測定劑量。因此，在一些實施例中，含有Fl-V表達構建體的傷寒沙門 氏菌Ty21a治療有效劑量為傷寒沙門氏菌Ty21a的至少100CFU、至少10 3CFU、至少104CFU、 至少 105CFU、至少 106CFU、至少 107CFU、至少 IO8CFU 或至少 IO9CFU,例如 100CFU-109CFU 或 IO3CFU-IO8CFu 或 IO4CFU-IO7CFu 或 Io5CFU-IO6CFUo
[0117] 本文提供了藥物組合物（也稱為免疫原性組合物或免疫刺激組合物），所述藥物 組合物包括單獨的或結合可藥用載體的治療有效劑量的重組核酸分子、質粒或包含Fl-V 表達構建體的傷寒沙門氏菌Ty21a。
[0118] 可藥用載體包括，但不限於，鹽水、緩衝鹽水、右旋糖（dextrose)、水、甘油、乙醇、 及其組合。所述載體和組合物可以是無菌的，並且所述製劑適合所述給藥方式。所述組合 物還可包含少量潤溼劑或乳化劑或pH緩衝劑。所述組合物可以是液體溶液、懸液、乳液、片 劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑或粉末。可使用傳統的粘合劑和載體如甘油三酯將所述組合物配 製成栓劑。口服製劑可包括標準載體如藥物級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖 維素和碳酸鎂。可使用任何常見的藥物載體，如無菌鹽水或芝麻油。所述介質（medium)還 可包含傳統的醫藥輔助材料，例如，調整滲透壓的可藥用鹽、緩衝液、防腐劑等。其他可與本 文提供的組合物和方法一起使用的介質是生理鹽水和芝麻油。
[0119] 所公開的免疫原性組合物可包括其他生物學惰性劑或生物學活性劑（或二者）。 例如，所公開的免疫原性組合物可包括佐劑、載體、賦形劑和抗微生物試劑（如抗生素）。
[0120] 任選地，可將一種或多種細胞因子，如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、 TNF-α或IFN-γ ;-種或多種生長因子，如GM-CSF或G-CSF ; -種或多種分子，如0X-40L 或41BBL;或這些物質的組合用作生物佐劑（參見，例如，Salgaller et al.，1998，J. Surg. Oncol. 68 (2) : 122-38 ；Lotze et al. , 2000, Cancer J. Sci. Am. 6 (Suppl l):S61-6； Cao et al. , 1998, Stem Cells 16(Suppl I) : 251-60 ；Kuiper et al. , 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90)。可將這些分子通過全身（或局部）給予所述宿主。
[0121] 提供了以下實施例以舉例說明某些具體特徵和/或實施方案。這些實施例不應被 解釋為將本公開內容限制於所描述的具體特徵或實施方案中。
[0122] 實施例
[0123] 實施例1 :質粒構建以及Fl-V表達和分泌的分析
[0124] 本實施例描述了用於在傷寒沙門氏菌疫苗菌株Ty21a中表達鼠疫耶爾森氏菌莢 膜蛋白級分I(Fl)/毒力抗原融合蛋白前體（LcrV)融合蛋白（稱為Fl-V融合蛋白）的遺 傳穩定質粒系統的產生。
[0125] 之前已經開發了用於優化的炭疽芽孢桿菌保護性抗原（PA)表達的遺傳穩 定的質粒表達系統（參見 Osorio et al. , Infect Immun77 (4) : 1475-1482, 2009 ;美 國專利7, 758, 855,其以引用的方式納入本文）。為了產生用於表達鼠疫耶爾森氏菌 Fl-V融合蛋白的質粒系統，對之前公開的鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合基因的合成構建體 (GenBank登錄號AY924380. 1)進行了修飾。將已在Ty21a中成功使用的低拷貝數質粒 pGB-2 (Osorio et al. , Infect Tmmun77(4):1475-1482, 2009 ；Xu et al. , Infect Tmmun 70(8):4414-4423,2002)用作質粒構建的骨架。將合成的Fl-V融合基因克隆至質粒pGB-2 中htrA啟動子的下遊（圖2)。
[0126] 為了誘導細胞外表達，使用大腸桿菌α-溶血素蛋白HlyA的分泌信號肽（最後66 個胺基酸）製備了合成的Fl-V融合基因（缺少終止子）的框內基因融合（圖1和圖2)。 所述質粒載體中還包括編碼HlyA轉運裝置的必要組分一一HlyB和HlyD的基因（圖2)。
[0127] 克隆到質粒pHtrFl-V-Hly中的所述Fl-V融合DNA插入片段的DNA序列：
[0128] tggacttttgtaaagatggacaataaatttttactttttccagaaactttattccggaacttcgcgtta taaaatgaatctgacgtacacagcaattttaaggagaggacatatggcagatttaactgcaagcaccactgcaacgg caactcttgttgaaccagcccgcatcactcttacatataaggaaggcgctccaattacaattatggacaatggaaac atcgatacagaattacttgttggtacgcttactcttggcggctataaaacaggaaccactagcacatctgttaactt tacagatgccgcgggtgatcccatgtacttaacatttacttctcaggatggaaataaccaccaattcactacaaaag tgattggcaaggattctagagattttgatatctctcctaaggtaaacggtgagaaccttgtgggggatgacgtcgtc ttggctacgggcagccaggatttctttgttcgctcaattggttccaaaggcggtaaacttgcagcaggtaaatacac tgatgctgtaaccgtaaccgtatctaaccaaggatccatcgaaggtcgtatgattagagcctacgaacaaaacccac aacattttattgaggatctagaaaaagttagggtggaacaacttactggtcatggttcttcagttttagaagaattg gttcagttagtcaaagataaaaatatagatatttccattaaatatgatcccagaaaagattcggaggtttttgccaa tagagtaattactgatgatatcgaattgctcaagaaaatcctagcttattttctacccgaggatgccattcttaaag gcggtcattatgacaaccaactgcaaaatggcatcaagcgagtaaaagagttccttgaatcatcgccgaatacacaa tgggaattgcgggcgttcatggcagtaatgcacttctctttaaccgccgatcgtatcgatgatgatattttgaaagt gattgttgattcaatgaatcatcatggtgatgcccgtagcaagttgcgtgaagaattagctgagettaccgccgaat taaagatttattcagttattcaagccgaaattaataagcatctgtctagtagtggcaccataaatatccatgataaa tccattaatctcatggataaaaatttatatggttatacagatgaagagatttttaaagccagcgcagagtacaaaat tctcgagaaaatgcctcaaaccaccattcaggtggatgggagcgagaaaaaaatagtctcgataaaggactttcttg gaagtgagaataaaagaaccggggcgttgggtaatctgaaaaactcatactcttataataaagataataatgaatta tctcactttgccaccacctgctcggataagtccaggccgctcaacgacttggttagccaaaaaacaactcagctgtc tgatattacatcacgttttaattcagetattgaagcactgaaccgtttcattcagaaatatgattcagtgatgcaac gtctgctagatgacacgtctggtaaatatgcatcaacttatgcagacctggataatctgaatccattaattaatgaa atcagcaaaattatttcagctgcaggtaacttcgatgttaaggaggaaagatctgccgcttctttattgcagttgtc cggtaatgccagtgatttttcatatggacggaactcaataactttgaccgcatcagcataa(SEQ ID NO :1)
[0129] 為了評估Fl-V在傷寒沙門氏菌Ty21a中的表達和分泌，將用pHtrFl-V-hly或之 前構建的編碼炭疽芽孢桿菌PA的質粒（Osorio et al·，Infect Immun 77(4) : 1475-1482， 2009)轉化的Ty21a在具有壯觀黴素選擇的培養基中過夜生長，隨後通過離心收集。將所得 上清級分濃縮至約為原來的1/10。同時將所得沉澱級分裂解在與所濃縮的上清液體積相等 的體積中。使用市售的針對Fl或LcrV的單克隆抗體，通過蛋白質印跡法分析等體積的所 述上清部分和沉澱級分。
[0130] 如圖3所示，所得結果清楚地證明pHtrFl-V轉化的Ty21a產生並分泌Fl-V融合蛋 白。實際上，在沉澱級分中檢測不到F1-V。根據所翻譯的DNA序列，所述Fl-V融合蛋白的 預測分子量約為58kDa。所觀察到的Ty21a分泌的Fl-V的稍高分子量，可能反映了添加了 66個胺基酸的分泌信號肽HlyA。使用抗LcrV的抗體對Fl-V的檢測檢測到約為55-58kDa 的第二產物。這條帶可能代表已經切除HlyA的F1-V。
[0131] 實施例2 :疫苗構建體在小鼠中的免疫原性
[0132] 本實施例描述了包含Fl-V融合表達構建體的傷寒沙門氏菌Ty21a的免疫原性，這 是通過血清IgG效價和經刺激的脾細胞的細胞因子表達所測定。
[0133] 通過免疫A/J小鼠檢測了表達Fl-V的Ty21a誘導保護性免疫應答的能力。通過 腹膜內（i.P.)途徑，使用三個每兩周一次的劑量（包含產生Fl-V或之前構建的炭疽PA的 Ty21a)對10隻6-8周齡的小鼠的組進行免疫。第三組小鼠接受了產生Fl-V的Ty21a和 產生PA的Ty21a的1:1的混合物。對照組小鼠接受了 3個劑量的用空pGB-2載體轉化的 Ty21a。免疫的小鼠接受2-5X IO7CFU/劑量。在第三次和最後一次免疫後一周，收集血清 和脾細胞。通過ELISA分析總的循環Fl-V和PA特異性的IgG效價。
[0134] Fl-V融合蛋白在Ty21a中的表達導致在小鼠中產生高的抗Fl-V血清IgG效價，其 平均的幾何平均效價約為500, 000 (圖4)。使用表達Fl-V的Ty21a和表達PA的Ty21a進 行的伴隨免疫導致在小鼠中產生高的抗Fl-V和抗PA IgG效價。表達空載體pGB2的Ty21a 對照菌株未導致循環的抗Fl-V IgG或抗PA IgG。
[0135] 在隨後的實驗中，在以使用Fl-V質粒或空pGB-2質粒轉化的Ty21a每兩周進行3 次免疫（i. P.)的8周齡小鼠中確定了總的血清IgG效價。經免疫的小鼠在0周、2周和4 周時接受了 2-5X IO7CFU/劑，並在0周、1周、3周和5周時收集血清。通過ELISA分析總 的循環Fl-V特異性的IgG效價。所得結果表明，3次免疫在小鼠中產生了高的抗Fl-V IgG 效價（圖5)。
[0136] 幾項現有研宄已經表明，下一代鼠疫疫苗應旨在同時誘導鼠疫耶爾森氏菌特異性 的Ig和細胞介導的免疫（CMI)應答。基於此，對在體外用rFl-V刺激72小時的所收集的 脾細胞的細胞因子應答進行了測量。
[0137] 未對10隻6-8周齡小鼠的組進行免疫（對照組），或者通過腹膜內途徑使用3個 每兩周一次的劑量（包含產生Fl-V的Ty21a或空載體pGB2的Ty21a)對它們進行免疫。經 免疫的小鼠接受2-5 X IO7CFU/劑量。在第三次和最後一次免疫後一周，收集脾細胞，並在 體外用rFl-V刺激72小時。收集培養物上清液並針對細胞因子產生進行分析。
[0138] 如圖6A-6D所示，對rFl-V的細胞因子（IL-2、IFN-y、TNF-a和IL-17)回憶應答 是可變的。來自未經免疫的小鼠的脾細胞在用rFl-V刺激時不分泌IL-2、IFN-γ、TNF-a 或IL-17。但是，來自一些以經pHtrFl-V-hly轉化的Ty21a免疫的小鼠的脾細胞表達大量 的IL-2、IFN-y、TNF-a和IL-17。一隻以經單獨的pGB2轉化的Ty21a免疫的小鼠對rFl-V 具有明顯的IFN- γ和TNF- α回憶應答。
[0139] 實施例3 :預防或抑制鼠疫耶爾森氏菌感染的方法
[0140] 本實施例描述了可被用於預防或抑制鼠疫耶爾森氏菌感染，從而在處於患病風險 中的受試者中預防或抑制發生鼠疫的示例性方法。
[0141] 選擇處於鼠疫耶爾森氏菌感染的風險中的受試者用於進行治療。例如，所述受試 者可以是生活在鼠疫是地方流行病的地區的個體，或者是已經與其他鼠疫受害者接觸過的 受試者。給予所述受試者包含含有Fl-V融合蛋白表達構建體的傷寒沙門氏菌Ty21a細菌 的免疫原性組合物。所述Fl-V表達質粒包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的 鼠疫耶爾森氏菌Fl-V融合蛋白編碼序列以及與Fl-V融合蛋白編碼序列框內融合的大腸杆 菌HlyA分泌信號肽編碼序列（SEQ ID NO: 1)。所述免疫原性組合物的合適的治療有效劑量 可由有經驗的開業醫生選擇。在一些實施例中，所述劑量為約IO6-約108CFU。為了引起足 夠的針對鼠疫耶爾森氏菌的免疫應答，可根據需要給予所述受試者單劑量或多劑量。
[0142] 考慮到所公開的本發明的原理所適用的許多可能的實施方案，應認識到，所示出 的實施方案只是本發明的優選實例，而不應被認為是對本發明範圍的限制。相反，本發明的 範圍是由以下的權利要求書所限定。因此，本發明人要求保護所有落入這些權利要求的範 圍和主旨的發明作為本發明人的發明。
【權利要求】
1. 一種重組核酸分子，包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森 氏菌（Yersinia pestis)Fl-V融合蛋白編碼序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID N0:1 的核巧酸1-1558至少95 %相同的序列。
2. 權利要求1的重組核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO: 1的核巧酸1-1558 的序列。
3. 權利要求1或2的重組核酸分子，還包含與F1-V融合蛋白編碼序列框內融合的分泌 信號膚編碼序列。
4. 權利要求3的重組核酸分子，其中所述分泌信號膚是大腸桿菌HlyA分泌信號膚。
5. 權利要求3或4的重組核酸分子，其中所述核酸分子的序列與SEQ ID NO: 1至少 95%相同。
6. 權利要求5的重組核酸分子，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO: 1。
7. -種重組核酸分子，包含與大腸桿菌htrA啟動子序列可操作地連接的鼠疫耶爾森 氏菌F1-V融合蛋白編碼序列，並且還包含與F1-V融合蛋白編碼序列框內融合的大腸桿菌 HlyA分泌信號膚編碼序列，其中所述核酸分子的序列包含SEQ ID NO: 1。
8. -種包含權利要求1-7中任一項的重組核酸分子的質粒。
9. 權利要求8的質粒，其中所述質粒是低拷貝數質粒。
10. 權利要求8或權利要求9的質粒，其還包含選擇性標記。
11. 權利要求10的質粒，其中所述選擇性標記是抗生素抗性基因。
12. 權利要求8-11中任一項的質粒，還包含大腸桿菌HlyB和HlyD蛋白編碼序列。
13. -種質粒，包含權利要求7的重組核酸分子、複製起點、選擇性標記W及大腸桿菌 HlyB和HlyD蛋白編碼序列。
14. 一種傷寒沙口氏菌（Salmonella Typhi)Ty21a細菌，包含權利要求1-7中任一項的 重組核酸分子或權利要求8-13中任一項的質粒。
15. -種免疫原性組合物，包括權利要求14的傷寒沙口氏菌Ty21a細菌和可藥用載體。
16. 權利要求15的免疫原性組合物，其中所述組合物被配製為用於口服給藥。
17. -種在受試者中引起針對抗鼠疫耶爾森氏菌的免疫應答的方法，包括給予所述受 試者權利要求14的傷寒沙口氏菌Ty21a細菌，或給予權利要求15或權利要求16的免疫原 性組合物。
18. 權利要求17的方法，其中所述免疫應答是保護性免疫應答。
19. 一種在受試者中預防鼠疫、降低發生鼠疫的風險或治療鼠疫的方法，包括給予所述 受試者權利要求14的傷寒沙口氏菌Ty21a細菌，或給予權利要求15或權利要求16的免疫 原性組合物。
【文檔編號】A61K39/02GK104470537SQ201380038155
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2012年5月23日
【發明者】D·J·埃科, M·奧索裡奧, M·R·富特 申請人:美國政府(由衛生和人類服務部的部長所代表)