胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法

2023-05-16 04:45:21 1

專利名稱：胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法
技術領域：
本發明公開了一種胚胎幹細胞誘導分化為肝細胞的方法，特別是一種利用多種細胞生長因子將胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法。
目前，肝臟功能衰竭的治療方法中，肝細胞替代療法(肝細胞移植、生物人工肝等)因其方法簡單、療效可靠而有望成為最理想的治療方法，但其中的理想種子細胞——肝細胞來源問題一直難以解決，ES細胞具有免疫原性低、增殖力旺盛和可塑性強的優點，其誘導分化的肝細胞是肝細胞替代療法中的最理想的細胞來源。但是肝細胞功能複雜，從肝前體細胞、幼稚肝細胞到成熟肝細胞還有許多階段，不但要在定向誘導系統中證明肝細胞的出現，還要誘導並證明其成熟分化，表達正常肝細胞的功能，才能完成肝細胞替代療法中的任務，這就造成了誘導方法複雜而且細胞培養周期很長；另外，成熟肝細胞的鑑定也缺乏特異有效的標記物，常需要幾個標記物一起從不同水平來鑑定才能證明肝細胞的出現，使得鑑定過程過於複雜。由於以上原因，肝細胞在ES細胞定向誘導系統中的研究起步很晚，並且只是研究了部分細胞因子、培養條件對肝細胞分化的作用和部分肝細胞標記物對肝細胞的鑑定，而象各種細胞因子在肝細胞成熟分化中的具體作用、肝細胞分化率等許多重要問題一直未有報導。
Chinzei R等於2002年報導了小鼠ES細胞向肝細胞分化方法(Hepatology，Jul；36(1)22-9)，其具體步驟如下選用BL6系ES細胞，先進行擬胚體(embryonic bodys，EBs)培養5天，讓ES細胞發育為EBs；第6-10天，在培養液中加入酸性纖維細胞生長因子(aFGF，20納克/毫升)和鹼性纖維細胞生長因子(bFGF，10納克/毫升)；第10-16天，在培養液中加入肝細胞生長因子(HGF，10納克/毫升)；第16-21天，在培養液中加入制瘤素(OSM，10納克/毫升)，地塞米松(DEX，10-7摩爾/升)，ITS(胰島素10微克/毫升，轉鐵蛋白5微克/毫升，亞硒酸5納克/毫升)。
經過RT-PCR監測，證明在細胞誘導系統中有白蛋白基因、甲胎蛋白基因、酪氨酸氨基轉移酶基因的表達，表明這些細胞表達了肝細胞特有的基因，從而證明肝細胞的出現；經過蛋白質印跡法(westen blot)監測，發現在誘導的細胞中有白蛋白合成，證明誘導的肝細胞可以表達成熟肝細胞的某些功能，如白蛋白合成功能。
但是，上述胚胎幹細胞誘導分化為肝細胞的方法存在以下的不足誘導方法步驟2中，aFGF和bFGF兩種細胞生長因子中，只用對肝細胞發生及生長作用較好的aFGF即可；培養系統中未選擇採用促進肝細胞發生及生長的關鍵細胞生長因子，導致肝細胞分化率不高。
本發明是通過如下技術方案來實現的。ES細胞經過擬胚體(embryonic bodys EBs)懸浮發育後，植入膠原(白明膠)處理過的培養板或培養瓶中使其貼壁生長，開始自然分化；然後在不同時間段分別加入分化生長因子(TGF)，甲胎蛋白(AFP)，酸性纖維細胞生長因子(aFGF)，肝細胞生長因子(HGF)，制瘤素(OSM)，地塞米松(DEX)，以及胰導素、轉鐵蛋白、亞硒酸(ITS)進行肝細胞定向誘導。
本發明的胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，aFGF和bFGF兩種細胞生長因子中，僅採用了對肝細胞作用較好的aFGF，同時，細胞誘導培養系統中選擇採用了促進肝細胞發生及生長的細胞生長因子TGF、AFP，使培養系統中的細胞生長因子得到優化，肝細胞分化率得到了大幅的提高。
本發明可以按如下所述來選擇細胞誘導培養所需試劑及器材1、ES細胞選用中山大學實驗動物中心建系的BALB/c系小鼠的ES細胞；2、細胞培養試劑ES細胞培養基Dubeco’s Modified Eagle’s Medium(glucose，4.5g/L)(Gibicol，Bra，USA)，20％胎牛血清(四季清，杭州)，0.1mmol/L 2-巰基乙醇(Gibicol，Bra，USA)，25mM HEPES(Gibco BRL，USA)，100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素(Gibco BRL，USA)，1000U/mL重組小鼠白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)(Gibicol，Bra，USA)；EB及EB分化培養基Dubeco’s ModifieEagle’sMedium(glucose，4.5g/L)(Gibicol，Bra，USA)，20％胎牛血清(四季清，杭州)，0.1mmol/L 2-巰基乙醇(Gibicol，Bra，USA)，25mM HEPES(Gibco BRL，USA)，100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素(Gibco BRL，USA)；細胞生長因子小鼠轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)(sigma，USA)，小鼠甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)(sigma，USA)，小鼠酸性纖維細胞生長因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)(sigma，USA)，小鼠肝細胞生長因子(hepatocyte growthfactor，HGF)(sigma，USA)，小鼠制瘤素oncnstatinM，OSM)(sigma，USA)，地塞米松(dexamethasone，DEX)(sigma，USA)，胰島素(insulin)，(sigma，USA)，轉鐵蛋白(transferrin)(Gibco BRL，USA)，亞硒酸(selenious acid，)(天津市化學試劑研究所)，白明膠(Sigma，USA)。
具體誘導及鑑定過程為(一)ES細胞的肝細胞定向分化培養1、ES細胞培養將保存在液氮中的ES-BLAB/c細胞取出，立即置於37-39℃的環境中解凍復甦，離心棄上清去除DMSO以及殘存的胰酶，加入ES培養基吹散，以2×104cells/ml的密度將細胞轉至一次性塑料培養瓶中，每天換液一次，每2-3天傳代一次；2、ES細胞發育為EBsES細胞換用Ebs培養基，將細胞轉至玻璃培養瓶中用搖動培養法培養，每1小時搖動細胞一次，使其懸浮生長發育為EBs，第2-3天每3小時搖動一次，第4-5天每1小時搖動一次；EBs的發育分化期間每1-2天換液一次，搖動培養法培養5天，開始培養EBs的當天作為細胞分化的第一天；EBs培養時換用玻璃培養瓶是因為玻璃培養瓶未經過促細胞黏附作用處理，瓶底光滑，易於EBs懸浮生長；搖動培養法操作時，開始培養EBs的第一天非常重要，因為此時的ES細胞尚處在向EBs分化的初期，ES細胞黏附性強的特點使其容易貼壁，此時的懸浮生長對EBs的發育及形成良好的EBs結構非常重要，貼壁不但影響ES細胞向EBs的發育分化，還會阻礙正常EBs結構的形成及EBs的生長；第2-3天則影響相對較小，第4-5天又因為EBs重量增大易於貼壁，又要十分注意1小時搖動一次；本試驗未選用懸滴培養法，是因為搖動培養法產生EBs數量充足，而懸滴培養法產生的EBs數量非常小，難以滿足本實驗RT-PCR和ICC等方法檢測對大量分化細胞的需求。
3、肝細胞定向誘導分化EBs懸浮發育生長5天後，於第6天轉至0.1％白明膠處理過的6孔培養板和24孔培養板上，讓其充分貼壁生長分化，每2天換液一次，胚體貼壁並向四周生長分化，白明膠在此處的作用是模擬體內細胞基質的作用；第7天-第11天，加入aFGF，終濃度為100ng/ml；第7天-19天，加入TGF，終濃度為20ng/ml；AFP，終濃度為20ng/ml；第11天-第19天，加入HGF和OSM，終濃度為20ng/ml和10ng/ml，10-7M地塞米松，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，5μg/ml亞硒酸。
設立兩組對照組(1)自第七天開始，只用EBs培養液，不加入aFGF、HGF、OSM等生長因子，其他培養條件同細胞因子組，使EBs細胞自然分化；(2)用前述文獻中的誘導方法進行ES細胞向肝細胞方向的誘導。
肝細胞鑑定1、細胞分化形態觀察進行EBs培養的第一天作為細胞分化的第一天，每天在顯微鏡下觀察細胞生長狀態，EBs發育狀況，貼壁生長後細胞分化類型及生長狀態，觀察是否有典型肝細胞形態結構的細胞出現。
2、AFP、ALB、TAT、G6P基因在培養系統中表達的RT-PCR檢測從ES細胞分化的第1天開始，每隔1天，至19天為止.即於第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天收集生長因子組和對照組分化的細胞，常規凍存於液氮中，於第19天時一起進行以上四中基因的RT-PCR檢測，總RNA提取和RT-PCR步驟按試劑盒說明。
3、上清中AFP、ALB和尿素濃度的測定從ES細胞分化的第1天到19天，每天收集生長因子組和對照組培養上清液3毫升，於4℃保存，第15天時用放射免疫法測定AFP、ALB的濃度，用自動生化分析儀進行尿素濃度的測定，並進行生長因子組和對照組不同時間段分析。
4、AFP、ALB、CK8、CK18鑑定EBs貼壁分化後第2天開始，即第7、9、11、13、15、17、19天在24孔板中培養的分化細胞進行間接免疫螢光和SABC法免疫細胞化學檢測，觀察各種肝細胞特異指標表達和肝細胞形態結構以及空間分布規律。
5、對定向誘導分化第19天的細胞進行DAB顯色的SAB法免疫細胞化學染色後，不進行蘇木素復染，對ALB、CK8和CK18三個指標的陽性細胞數和全部培養系統中細胞數計數並算出三種陽性細胞率，計算三者的平均數，即為肝細胞分化率。AFP雖為幼稚肝細胞的標記物，但是因為它在軟黃囊和一些內胚層前體細胞中也有表達，為了提高肝細胞分化率計算的精確性，不將AFP陽性細胞率計算在內。經過細胞分化率計算得到本發明的誘導分化方法肝細胞分化率為31.6％；對照組(1)的分化率為依次分別為8.2％，對照組(2)的分化率為15.6％。從分化率結果可以看出，本發明的誘導方法在分化效率方面有很大的提高。
另外，利用本ES細胞誘導系統，只要改變細胞因子的部分成分即可進行向造血細胞、神經細胞、骨細胞等細胞方向的定向誘導。
權利要求
1.一種胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，包括ES細胞培養、ES細胞發育為EBs、EBs培養、EBs肝細胞分化步驟，其特徵是該方法中所採用的細胞生長因子為細胞轉化生長因子TGF，肝細胞分化促進因子甲胎蛋白AFP，酸性纖維細胞生長因子aFGF，肝細胞生長因子HGF，制瘤素OSM，地塞米松DEX，ITS即胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸。
2.按權利要求1所述的胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，其特徵是其具體的誘導分化步驟如下(1)、ES細胞培養將保存在液氮中的ES細胞取出，立即置於37-39℃的環境中解凍復甦，離心棄上清去除DMSO以及殘存的胰酶，加入ES培養基吹散，以2×104cells/ml的密度將細胞轉至一次性塑料培養瓶中，每天換液一次，每2-3天傳代一次；(2)、ES細胞發育為EBsES細胞換用EBs培養基，將細胞轉至未經過促細胞黏附作用處理、瓶底光滑的玻璃培養瓶中用搖動培養法培養，每1小時搖動細胞一次，使其懸浮生長發育為EBs，第2-3天每3小時搖動一次，第4-5天每小時搖動一次；EBs的發育分化期間每1-2天換液一次，搖動培養法培養5天；(3)、肝細胞定向誘導分化EBs懸浮發育生長5天後，於第6天轉至0.1％白明膠處理過的6孔培養板和24孔培養板上，讓其充分貼壁生長分化，每2天換液一次，胚體貼壁並向四周生長分化；第7天-第11天，加入aFGF，終濃度為100ng/ml；第7天-19天，加入TGF，終濃度為20ng/ml，AFP，終濃度為20ng/ml；第11天-第19天，加入HGF和OSM，終濃度分別為20ng/ml和10ng/ml，10-7M地塞米松，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，5μg/ml亞硒酸。
3.按權利要求1或2所述的胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，其特徵是所述的ES細胞選用BALB/c系小鼠的ES細胞。
4.按權利要求1或2所述的胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，其特徵是ES細胞培養用的培養基是glucose，4.5g/L，20％胎牛血清，0.1mmol/L 2-巰基乙醇，25mM HEPES，100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素，1000U/mL重組小鼠白血病抑制因子；而EB及EB分化培養基是glucose，4.5g/L，20％胎牛血清，0.1mmol/L 2-巰基乙醇，25mMHEPES，100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素。
5.按權利要求3所述的胚胎幹細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，其特徵是ES細胞培養用的培養基是glucose，4.5g/L，20％胎牛血清，0.1mmol/L 2-巰基乙醇，25mM HEPES，100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素，1000U/mL重組小鼠白血病抑制因子；而EB及EB分化培養基是glucose，4.5g/L，20％胎牛血清，0.1mmol/L 2-巰基乙醇，25mM HEPES，100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素。
全文摘要
本發明公開了一種胚胎幹細胞誘導分化為肝細胞的方法，ES分化用的細胞生長因子分別是轉化生長因子TGF，甲胎蛋白AFP，酸性纖維細胞生長因子aFGF，肝細胞生長因子HGF，制瘤素OSM，地塞米松DEX，以及胰導素、轉鐵蛋白、亞硒酸(ITS)，其肝細胞分化率為30％以上。
文檔編號C12N5/071GK1478888SQ0313976
公開日2004年3月3日 申請日期2003年7月9日 優先權日2003年7月9日
發明者胡安斌, 蔡繼業 申請人:暨南大學