細胞毒性t細胞誘導劑的製作方法

2023-05-16 17:46:06

細胞毒性t細胞誘導劑的製作方法
【專利摘要】本發明的目的在於即使沒有佐劑也可使肽發揮作為疫苗的充分的效果，本發明提供一種細胞毒性T細胞誘導劑，其特徵在於，其為含有由猿猴病毒40的VP1構成的病毒樣顆粒的細胞毒性T細胞誘導劑，在上述VP1的DE環和／或HI環中插入有T細胞表位肽。
【專利說明】細胞毒性T細胞誘導劑【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞毒性T細胞(CTL)誘導劑、以及利用其的病毒性疾病或癌症的預防或治療方法。
【背景技術】
[0002]猿猴病毒(Simian virus)40 (SV40)屬於乳多空病毒科,是猿猴多瘤病毒的一種，是小形且沒有被膜的腫瘤病毒。
[0003]SV40病毒的外殼由被稱為VPl的主衣殼蛋白構成。當使VPl基因在昆蟲細胞內等高表達時，VPl被大量合成，在細胞的核內自組裝形成很多病毒樣顆粒(VLP)。由本發明的發明人等提出在該VLP的內部封入藥劑等，用作藥物遞送的方案(國際公開2006/004173)。
[0004]本發明的發明人等確認，當在VPl中插入外源性肽時，大多情況下無法形成正常的VLP，但是在VPl中的DE環、HI環中插入時則形成正常的顆粒。利用該性質，在DE環、HI環插入外源性肽，能夠改變VLP的細胞指向性(專利文獻I)。
[0005]一直以來進行著利用該VLP製作疫苗。例如，在專利文獻2中記載了包含結合有CTL表位肽的VLP的CTL疫苗。
[0006]現有技術文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本國際公開2006/088229
[0009]專利文獻2:日本特開2009-197001號公報

【發明內容】

[0010]發明所要解決的課題
[0011]為了破壞病毒感染細胞等而利用源自病毒的肽作為疫苗。但是，肽的滯留性差，而且易於分解，因此通常與佐劑一起給藥。但是，佐劑多存在副作用，對人給藥時存在問題。
[0012]本發明就是在上述這樣的技術背景下進行的，其目的在於提供一種即使沒有佐劑，也能夠使肽發揮作為疫苗的充分的效果的手段。
[0013]用於解決課題的方法
[0014]本發明的發明人為了解決上述課題而反覆進行了深入研究，結果發現，由將T細胞表位肽插入DE環、HI環而得到的改變型VPl構成的VLP顯示很強的CTL誘導性。
[0015]在專利文獻I中公開了由在DE環、HI環插入外源性肽而得到的改變型VPl構成的VLP。但是，在專利文獻I中，外源性肽是專門為了改變VLP的細胞指向性而插入的，使用外源性肽誘導CTL的思想在專利文獻I中沒有公開。此外，在專利文獻I的權利要求10等中記載了作為外源性肽使用抗原表位，但該抗原表位是為了 VLP能夠與抗體結合而使用的。即，專利文獻I中記載的「表位」是被抗體識別的表位，而不是被T細胞識別的表位(T細胞表位)。
[0016]在專利文獻2中公開了包含結合有CTL表位肽的VLP的CTL疫苗(權利要求182等)。但是，專利文獻2中沒有公開在猿猴病毒40的VPl的DE環和/或HI環中插入CTL表位肽。另外，本發明的CTL誘導劑即使沒有免疫刺激物質也具有充分的CTL誘導效果，但在引用文獻2中公開的疫苗包含含有非甲基化CpG的寡核苷酸等免疫刺激物質(權利要求1)，這點與本發明的CTL誘導劑不同。
[0017]本發明就是基於以上認知而完成的。
[0018]即，本發明提供以下的(I)~(10)。
[0019](I)一種CTL誘導劑，其特徵在於，其為含有由猿猴病毒40的VPl構成的病毒樣顆粒的CTL誘導劑，且上述VPl的DE環和/或HI環中插入有T細胞表位肽。
[0020](2)如在(I)中記載的CTL誘導劑，其特徵在於，T細胞表位肽為源自病毒蛋白質的肽。
[0021](3)如在(I)中記載的CTL誘導劑，其特徵在於，T細胞表位肽為源自流感病毒的HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2 或 PB1-F2 的肽。
[0022](4)如在(I)中記載的CTL誘導劑，其特徵在於，T細胞表位肽為源自對癌細胞特異性的蛋白質的肽。
[0023](5)如在(I)中記載的CTL誘導劑，其特徵在於，T細胞表位肽為源自Melan-A/MART-1、gplOO、MAGE-A3、MAGE-AlO、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1 或 hTERT 的肽。
[0024](6)如在(I)中記載的CTL誘導劑，其特徵在於，T細胞表位肽為由序列號I至39中任意一個序列號所記載的胺基酸序列構成的肽。
[0025](7) 一種人以外的動物的病毒性疾病的預防或治療方法，其特徵在於，將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自病毒蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人以外的動物進行給藥。
[0026](8) 一種人以外的動物的癌症的預防或治療方法，其特徵在於，將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自對癌細胞特異性的蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人以外的動物進行給藥。
[0027](9)一種人的病毒性疾病的預防或治療方法，其特徵在於，將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自病毒蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人進行給藥。
[0028](10) 一種人的癌症的預防或治療方法，其特徵在於，將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自對癌細胞特異性的蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人進行給藥。
[0029]發明的效果
[0030]本發明的CTL誘導劑所含的VLP即使沒有佐劑也具有很強的CTL誘導效果。因此，本發明的CTL誘導劑能夠不產生副作用地進行病毒性疾病、癌症的預防或治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是表示Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的裂解物以及細胞團溶液在SDS-PAGE後的CBB染色的結果的圖。製備的裂解物和細胞團溶液的一部分在10%SDS-PAGE中展開，用CBB染色。Ml-DE-VLP的裂解物在左圖的泳道1-4，泳道1、2將不含CpG佐劑的試樣展開，泳道
3、4將含有CpG佐劑的試樣展開。Ml-DE-VLP的細胞團在左圖的泳道5_6，泳道5、6將不含CpG佐劑的試樣展開，泳道7、8將含有CpG佐劑的試樣展開。Ml-H1-VLP的裂解物在右圖的泳道1-4，泳道1、2將不含CpG佐劑的試樣展開，泳道3、4將含有CpG佐劑的試樣展開。Ml-H1-VLP的細胞團在右圖的泳道5-6，泳道5、6將不含CpG佐劑的試樣展開，泳道7、8將含有CpG佐劑的試樣展開。
[0032]圖2是表示Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的裂解物以及細胞團溶液的足墊免疫後的細胞內細胞因子染色(ICS, Intracellular cytokine staining)分析結果的圖。將Ml-DE-VLP(A、B)和Ml-H1-VLP (C、D)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮(A、C)以及利用吹打進行重懸浮(B、D))對轉基因小鼠進行免疫，一周後用ICS分析。另外，將Ml-DE-VLP (E、F)和Ml-H1-VLP (G、H)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮(E、G))以及裂解物溶液(F、H)對轉基因小鼠進行免疫，兩周後用ICS分析。CpG (_)表示沒有加入CpG佐劑，CpG+表示加入了 CpG佐劑。另外，肽刺激(P印tide pulse) (Ml flu M58-66)(-)表示沒有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(Mlflu M58-66)+表示通過添加上述序列而對CTL進行再誘導。各圖的右上框內的點表示CD8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞，框內的數字表示該細胞的比例。
[0033]圖3是表示Ml-DE-VLP和M1-H1-VLP在不同的免疫途徑中的ICS分析結果的圖。將Ml-DE-VLP (左圖)和Ml-H1-VLP (右圖)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以足跟關節、靜脈內、腹腔內、肌肉內、鼻腔內的途徑進行免疫，一周後進行ICS分析。肽刺激(Mlflu M58-66)(-)表示沒有添加 CTL 表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(MlfIu M58-66) +表示通過添加上述序列而對CTL再誘導。另外，「脾」表示從脾臟提取的淋巴細胞，「肺」表示從肺提取的淋巴細胞。各圖的右上框內的點表示CD8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞,框內的數字表示該細胞的比例。
[0034]圖4是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫時的CD107-1CS分析結果的圖。將Ml-DE-VLP (左圖)和Ml-H1-VLP (右圖)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內、腹腔內的途徑進行免疫，一周後進行CD107-1CS分析。肽刺激(Mlflu M58_66)(_)表示沒有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(Mlflu M58-66) +表示通過添加上述序列而對CTL再誘導。另外，「脾」表示從脾臟提取的淋巴細胞。各圖的右上框內的點分別表示⑶8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞(上圖)、⑶8陽性細胞中的⑶107陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞(下圖)，框內的數字表示該細胞的比例。
[0035]圖5是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫時的51鉻釋放分析結果的圖。將Ml-DE-VLP (左圖)和Ml-H1-VLP (右圖)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內、腹腔內的途徑進行免疫，一周後取出淋巴細胞進行培養，用於51鉻釋放分析，培養一周後進行51鉻釋放分析。(_)表示來自沒有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)的靶細胞的鉻釋放的比例，Ml:58-66表示來自添加了上述序列的靶細胞中的鉻釋放的比例。
[0036]圖6是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫時的In vivo CTL分析結果的圖。將Ml-DE-VLP (左圖)和Ml-H1-VLP (右圖)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內、腹腔內的途徑進行免疫，一周後，進行CFSE染色，將混合了 CTL表位序列(GILGFVFTL)的淋巴細胞(CFSE高)和未混合的淋巴細胞(CFSE低)以相同數量靜脈注射導入，一天後進行In vivo CTL分析。各圖表示小鼠的淋巴細胞中的CFSE染色的細胞的CFSE強度(橫軸)和細胞數(縱軸)。圖中的(_)表示使用沒有免疫的小鼠的淋巴細胞的情況，Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP分別表示使用以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫的小鼠的淋巴細胞的情況。框內的字表示利用以下的式子算出的對於淋巴細胞的特異性的損傷率。特異性的損傷率(％)=(1-r (control)/r (immunized))X 100,其中，r (control)表示沒有免疫的小鼠中的(CFSE低的淋巴細胞數/CFSE高的淋巴細胞數)，r (immunized)表示免疫後的小鼠中的(CFSE低的淋巴細胞數/CFSE高的淋巴細胞數)。
[0037]圖7是表示Ml-DE-VLP和M1-H1-VLP的添加引起的淋巴細胞的成熟化的圖。在6小時後(各個的左圖)以及24小時後(各個的右圖)，回收沒有任何添加(直方圖中灰色的區域)、添加了 50%0pt1-preepTM溶液的(上段、直方圖中粗線、中空)、添加了 Ml-DE-VLP(中段、直方圖中粗線、中空)、添加了 Ml-H1-VLP (下段、直方圖中粗線、中空)的淋巴細胞，用FITC-抗⑶80抗體(左)、FITC-抗⑶86抗體(中央)、FITC-抗⑶40抗體(右)染色，進行直方圖分析。縱軸表示細胞數，橫軸表示FITC的強度。用FITC-抗⑶86抗體以及FITC-⑶40抗體染色的以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP孵育的淋巴細胞(直方圖中粗線、中空)中，與沒有任何添加(直方圖中灰色的區域)相比，直方圖向右偏。這表示因為CD86和CD40在淋巴細胞表面表達，所以相對於沒有任何添加的淋巴細胞，FITC-抗⑶86抗體和FITC-抗⑶40抗體更多地與淋巴細胞表面結合。
[0038]圖8是表示以Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫時對流感病毒的病毒挑戰實驗分析結果的圖。〔圖8-aWfMl-DE-VIi^PMl-H1-VLP的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內、腹腔內的途徑免疫，一周後，對免疫的小鼠實施麻醉後，使流感A病毒(A/H1N1/PR8以及A/H3N2/Aich1、濃度:100TCID50/20μl、接種量:20 μl)經鼻感染，4天後從肺製備提取液，根據紅細胞的凝集的分布，以組織培養流感病毒的感染量(tissue culture influenzavirus infectious dose,TCID5tl)算出在該提取液中所含的流感病毒量。左邊的表表示感染A/H1N1/PR8後的小鼠肺的流感病毒量的結果，右邊的表表示感染A/H3N2/Aichi後的小鼠肺的流感病毒量的結果。免疫物(_)表示沒有免疫的小鼠，Ml-DE-VLP表示用Ml-DE-VLP免疫的小鼠的肺的提取液每Iml所含的流感病毒量的組織培養流感病毒的感染量(TCID50),Ml-H1-VLP表示用Ml-H1-VLP免疫的小鼠的肺的提取液每Iml所含的流感病毒量的組織培養流感病毒的感染量(TCID5Q)。〔圖8-b〕將Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內、腹腔內的途徑免疫，一周後，對免疫的小鼠實施麻醉後，使流感A病毒(A/H1N1/PR8、濃度:100TCID5(l/20 μ l、接種量:20 μ l)經鼻感染，將此時的小鼠的體重設為100%，2周每天分析小鼠的體重變化。左圖表示沒有免疫的小鼠的體重變化，中央表示用Ml-DE-VLP免疫的小鼠的體重變化，右圖表示用Ml-H1-VLP免疫的小鼠的體重變化。
[0039]圖9〔圖9-a〕是表示WT1WT-DE-VLP和WT1WT-H1-VLP的裂解物和細胞團溶液在SDS-PAGE後的CBB染色的結果的圖。將製備的裂解物和細胞團溶液的一部分在10%SDS-PAGE中展開，用CBB染色。WT1WT-DE-VLP的裂解物為泳道3，WTlffT-DE-VLP的細胞團為泳道4，WTlffT-H1-VLP的裂解物為泳道5，WTlffT-H1-VLP的細胞團為泳道6。〔圖9-b〕是表示WT1WT-DE-VLP和WT1WT-H1-VLP的不同的免疫途徑中的ICS分析結果的圖。將WTlffT-DE-VLP (圖9-b、上段)和WT1WT-H1-VLP (圖9_b、下段)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內(WTlWT-DE-VLP)、腹腔內(WTlWT-H1-VLP)的途徑免疫，一周後進行ICS分析。肽刺激(RMFPNAPYL) (_)表示沒有添加CTL表位序列(RMFPNAPYL)，肽刺激(RMFPNAPYL)+表示通過添加上述序列而對CTL再誘導。各圖的右上框內的點表示⑶8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞，框內的數字表示該細胞的比例。〔圖9-c〕是表示以WT1WT-DE-VLP和WT1WT-H1-VLP免疫時的51鉻釋放分析結果的圖。將Ml-DE-VLP (左圖)和M1-H1-VLP (右圖)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以肌肉內、腹腔內的途徑免疫，一周後取出淋巴細胞進行培養，用於51鉻釋放分析，培養一周後，進行51鉻釋放分析。(_)表示從沒有添加CTL表位序列(RMFPNAPYL)的靶細胞的鉻釋放的比例，WTlffT表示從添加了上述序列的靶細胞中的鉻釋放的比例。
[0040]圖10是表示通過ICS分析比較IFA (弗氏不完全佐劑，incomplete freund』 sadjuvant)和M1-DE-VLP、M1-H1-VLP的CTL誘導的結果的圖。在將Ml:58_66的CTL表位序列(GILGFVFTL)的肽用IFA懸浮得到的乳濁液以皮下內(s.c.)的途徑進行一次免疫(左上圖)、以及一次免疫一周後進行第二次免疫(左下圖)，經過一周後的小鼠；以及將Ml-DE-VLP(右上圖)和Ml-H1-VLP (右下圖)的細胞團溶液(利用超聲波處理進行重懸浮)以皮下內(s.c.)的途徑進行免疫，經過一周後的小鼠進行ICS分析。肽刺激(Ml:58-66)(-)表示沒有添加CTL表位序列(GILGFVFTL)，肽刺激(Ml: 58-66)+表示通過添加上述序列而對CTL再誘導。另外，「脾」表示從脾臟提取的淋巴細胞。各圖的右上框內的點表示CD8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞，框內的數字表示該細胞的比例。
[0041 ] 圖11是表示利用ELISA分析以M1-DE-VLP和M1-H1-VLP孵育時的脾臟提取淋巴細胞的IL-12的分泌量的結果的圖。表的左邊的optiprep表示僅為溶解有VLP的溶劑，wild-type-VLP表示沒有插入CTL表位的野生型的VLP，LPS表示用脂多糖(Iipopolysaccharide)孵育從脾臟提取的淋巴細胞。中央表示孵育時間，右邊表示利用ELISA算出的培養淋巴細胞的培養上清的IL-12的濃度。
【具體實施方式】`
[0042]以下，詳細地說明本發明。
[0043]本發明的CTL誘導劑的特徵在於，含有由猿猴病毒40的VPl構成的病毒樣顆粒，且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有T細胞表位肽。
[0044]本發明中使用的T細胞表位肽只要能夠誘導CTL就沒有特別限定。作為T細胞表位肽，已知有源自病毒蛋白質的肽和源自對癌細胞特異性的蛋白質的肽等，但在本發明中，能夠使用這些肽中的任意的肽。其中，此處「對癌細胞特異性的蛋白質」是指在正常細胞中不表達而僅在癌細胞中表示的蛋白質，或與正常細胞相比較在癌細胞中表達增加的蛋白質。
[0045]作為源自病毒蛋白質的肽，可以例示源自流感病毒的HA、NA、Ml、M2、NP、NSl、NS2、PA、PB1、PB2、PB1-F2等蛋白質的肽。這些之中，優選源自流感病毒的Ml、NP、NSl、PA、PBl、PB2等蛋白質的肽。作為具體的肽，為作為源自流感病毒的Ml的肽的GILGFVFTL (序列號I),ASCMGLIY (序列號 2)、SIIPSGPLK (序列號 3)、ILGFVFTLTV (序列號 4);作為源自 NP 的肽的 CTELKLSDY (序列號 5)、LPFEKSTVM (序列號 6)、ILRGSVAHK (序列號 7)、ELRSRYWAI (序列號8)、SRYWAIRTR (序列號9);作為源自PBl的肽的NMLSTVLGV (序列號10)、RIFLAMIITI(序列號11)、VSDGGPNLY (序列號12);作為源自PB2的肽的VLTGNLQTL (序列號13)、作為源自NSl的肽的IILKANFSV (序列號14)等。[0046]作為源自流感病毒以外的病毒的蛋白質的肽，可以例示源自HIV的Gag、Pol、Env、Tat、Nef、Rev的肽、源自C型肝炎病毒(HCV)的El、E2、Core、NS2、NS3、NS4、NS5的肽、源自人乳頭狀瘤病毒(HPV)的E6、E7的肽等。
[0047]作為源自對癌細胞特異性的蛋白質的肽，可以例示源自Melan-A/MART-1、gplOO、MAGE-A3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-l、WT-UhTERT 等蛋白質的肽。這些之中，優選源自HER2/new、WT-l、MAGE-A3等蛋白質的肽。作為具體的肽，可以例示作為源自HER2/new的肽的 ALCRWGLLL (序列號 15)、QLFEDNYAL (序列號 16)、KIFGSLAFL (序列號 17)、ILHNGAYSL(序列號 18)、IISAVVGIL (序列號 19)、VVLGVVFGI (序列號 20)、RLLQETELV (序列號 21)、VMAGVGSPYV (序列號 22)、CLTSTVQLV (序列號 23)、QLMPYGCLL (序列號 24)、YLEDVRLV (序列號25)、VLVKSPNHV (序列號 26)、YMMVKCWMI (序列號 27)、ELVSEFSRM (序列號 28)、VLRENTSPK(序列號 29)、RWGLLLALL (序列號 30)、TYLPTNASL (序列號 31 )、PYVSRLLGI (序列號 32);作為源自WT-1的肽的RMFPNAPYL (序列號33)、SLGEQQYSV (序列號34)、CMTffNQMNL (序列號35)、YMFPNAPYL (序列號 36)、CMTWNQMNL (序列號 37)、CYTWNQMNL (序列號 38)、RWPSCQKKF(序列號39)等。
[0048]在環中插入的T細胞表位肽的長度只要能夠誘導CTL就沒有限定，通常為3~27個胺基酸，優選為8~11個胺基酸，更優選為9個胺基酸。
[0049]DE環處於從VPl的N末端開始數的127-146位，HI環處於268-277位(國際公開2006/088229)。T細胞表位肽可以插入到這些環中的任意一個，對於DE環來說，優選以137-138位的胺基酸序列被T細胞表位肽取代的方式插入T細胞表位肽，對於HI環來說，優選以273-274位的胺基酸序列被T細胞表位肽取代的方式插入T細胞表位肽。另外，在插入到環中的T細胞表位肽的兩端，通常插入有I~數個間隔胺基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等(國際公開2006/088229)。間隔胺基酸的個數通常為I~9個，優選為I~6個，更優選為3~6個。
[0050]T細胞表位肽既可以插入DE環和HI環的兩者中，也可以僅插入一者。另外，在插入兩者的情況下，既可以插入相同的T細胞表位肽，也可以插入不同的T細胞表位肽。此外，還可以在環中串聯插入兩個以上的T細胞表位肽。
[0051]由在環中插入有外源性肽的VPl構成的病毒樣顆粒的製作方法記載於國際公開2006/088229，因此能夠按照該方法製作由在環中插入有T細胞表位肽的VPl構成的病毒樣顆粒。例如，製作插入有編碼T細胞表位肽的鹼基序列的改變型VPl基因，使用杆狀病毒載體等使該改變型VPl基因在昆蟲細胞內等高表達，由此能夠製作目標病毒樣顆粒。
[0052]本發明的CTL誘導劑對應於作為有效成分的物質的性狀，製成一般的醫藥組合物的形態，組合物的直接送達一般通過非口服的注射(例如皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、肌肉內注射、向組織間隙的空間注射等)實現。作為其他的給藥法，可以列舉黏膜給藥(例如經口、經鼻或肺)、通過眼的給藥、經皮給藥以及栓劑。
[0053]即，在非口服給藥的情況下，能夠以注射劑、經鼻劑、局部給藥劑(經皮劑等)、直腸給藥劑等給藥形態給藥。在口服給藥的情況下，通常能夠以本領域中使用的給藥形態給藥。作為注射劑，可以列舉例如無菌的溶液或混懸液、乳劑等，具體而言，可以列舉水、水一丙二醇溶液、緩衝化液、0.4%的生理食鹽水等。另外，製成液體製劑的情況下，能夠通過冷凍保存或冷凍乾燥等除去水分而進行保存。冷凍乾燥製劑在使用時加入注射用蒸餾水等再溶解使用。作為局部給藥劑，可以列舉例如乳膏、軟膏、洗劑、經皮劑等。作為口服劑或直腸給藥劑，可以列舉例如膠囊、片劑、丸劑、散劑、滴劑、栓劑、液劑等。
[0054]以上的劑型可以利用通常在本領域進行的方法，與藥學上可接受的賦形劑、添加劑一起製劑化。作為藥學上可接受的賦形劑、添加劑，可以列舉載體、結合劑、香料、緩衝劑、增粘劑、著色劑、穩定劑、乳化劑、分散劑、助懸劑、防腐劑、PH調節劑、張力調節劑、浸潤劑等。另外，作為藥學上可接受的載體，可以列舉例如碳酸鎂、乳糖、果膠、澱粉、甲基纖維素等。
[0055]本發明的CTL誘導劑即使沒有佐劑也具有充分的CTL誘導效果，因此既可以不含佐劑，也可以含有佐劑。作為使用的佐劑，可以列舉氫氧化鋁凝膠、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、百日咳菌佐劑、聚(I，C)、CpG-DNA等。
[0056]製劑中的T細胞表位肽的給藥量、製劑的給藥次數根據T細胞表位肽的種類、給藥對象的症狀、年齡、體重、給藥形態等而不同，通常為0.01 μ g~Img,優選為0.1 μ g~500 μ g，更優選為1.0 μ g~100 μ g，優選將其在數日或數月中給藥I次。例如，在初期免疫(即，治療性或預防性給藥)中，對成人患者將1.0μ g~500μ g的肽進行給藥，根據由患者血液中的特異性的CTL活性測定所得到的患者的應答以及狀態，按照從數周至數個月的加強療法，繼續將1.0 μ g~100 μ g的肽進行加強給藥。
[0057]本發明的CTL誘導劑 能夠作為病毒性疾病的預防或治療用疫苗、各種癌症的預防或治療用疫苗使用。
[0058]本發明的CTL誘導劑能夠將人或人以外的動物作為給藥對象。作為人以外的動物，可以列舉家畜(例如牛、馬、豬、雞等)、寵物動物(例如狗、貓等)、實驗動物(小鼠、大鼠等)
坐寸ο
[0059]本發明的CTL誘導劑也能夠在如以下的預防或治療方法中利用。
[0060](A) 一種預防或治療人的病毒性疾病的方法，其將由猿猴病毒40的VPl構成的且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自病毒蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人進行給藥。
[0061](B) 一種預防或治療人以外的動物的病毒性疾病的方法，其將由猿猴病毒40的VPl構成的且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自病毒蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人以外的動物進行給藥。
[0062](C) 一種預防或治療人的癌症的方法，其將由猿猴病毒40的VPl構成的且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自對癌細胞特異性的蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人進行給藥。
[0063](D) 一種預防或治療人以外的動物的癌的方法，其將由猿猴病毒40的VPl構成的且在上述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自對癌細胞特異性的蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人以外的動物進行給藥。
[0064]實施例
[0065]以下，通過實施例對本發明進行更詳細地說明。
[0066]〔實施例1〕MlCTL表位插入SV40VP1基因的製作
[0067]將流感病毒顆粒內部蛋白質Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)(該表位序列為對於人的MHC class I的HLA-A * 0201的表位序列。)插入SV40VP1。具體而言，將VPl的DE環區域(137-138胺基酸區域，經典地將VPl基因的第4位的Ala作為胺基酸序號I)或者將HI環區域(273-274胺基酸區域)用GILGFVFTL取代，製作了 MlCTL表位插入SV40VP1插入突變體(M1-DE-VP1、M1-H1-VP1)。製作方法是以編碼 SV40VP1 的 pFastBacl_SV40wild typeVPl作為模板，按照Overhang PCR法製作。引物使用以下的序列。
[0068]Ml-DE-VPl製作用引物
[0069]1st round
[0070]5』-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0071]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列號 40) 3』_DE21oop (Ml)
[0072]CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCATGAGTTTTTTGTGTCCCTGAATG (序列號 41)
[0073]5』_DE21oop (Ml)
[0074]CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGTGCTGGAAAACCCATTCAAG (序列號 42)
[0075]3』-Kpn1-SV40VPl
[0076]AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列號 43)
[0077]2nd round
[0078]5』-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0079]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列號 44) 3，-Kpn1-SV40VPl
[0080]AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列號 45) Ml-H1-VPl 製作用引物
[0081]1st round
[0082]5』-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0083]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列號 46) 3，-HIlloop (Ml)
[0084]CGTGAACACAAAGCCCAAAATGCCGCCACCGCCGTTGGTAAACAGCCCACAAATG (序列號 47)
[0085]5，-HIlloop (Ml)
[0086]CATTTTGGGCTTTGTGTTCACGTTGGGCGGCGGTGGAACACAGCAGTGGAAGGG (序列號 48)
[0087]3』-Kpn1-SV40VPl
[0088]AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列號 49) 2nd round
[0089]5』-Sal1-Kozac_SV40VPl
[0090]AAAAGTCGACACCATGAAGATGGCCCCAACAAAAAG (序列號 50) 3，-Kpn1-SV40VPl[0091 ] AAAAGGTACCTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTG (序列號 51)
[0092]模板使用IOng,引物逐次加入 50pmol,製備 KOP polymerase2.5units,0.2mMdNTPs, ImM MgCl2, 6mM(NH4)2SO4, IOmM KCl，120mM Tris-HCl (pH8.0),0.l%TritonX-100,0.0OP/oBSA的濃度的混合溶液30 μ I。
[0093]PCR在1st round,2nd round時都在98 °C保溫60秒後，重複25次以下的循環(98°C 15秒、59°C 15秒、74°C 30秒)，最後在74°C保溫I分30秒，轉移至4°C。
[0094]將由Overhang PCR製作的PCR片段用限制性內切酶KpnI和SalI切斷，插入到PFastBacl質粒載體的Kpnl、SalI位點之間，製成了 M1-DE-VP1和M1-H1-VP1質粒。
[0095]〔實施例2〕表達Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl的杆狀病毒的製作
[0096]向載有杆狀病毒基因組的大腸桿菌DHlObac ( invitrogen)中導入Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl質粒進行轉化，製備了重組有Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl的重組杆狀病毒基因組。將重組杆狀病毒基因組轉染入Sf-9細胞,三天後回收其上清,作為含有重組杆狀病毒的溶液。使該溶液的一部分再次感染Sf-9細胞，由此使重組杆狀病毒滴度上升，製成了重組杆狀病毒的儲備溶液。
[0097]〔實施例3〕Ml-DE-VLP 和 Ml-H1-VLP 的製備
[0098]將重組有Ml-DE-VPl和Ml-H1-VPl的重組杆狀病毒以M.0.1.(感染複數，multiplicity of infection) =0.05 ~0.2 感染 3X IO7 個 Sf-9 細胞。感染 3 天后回收Sf-9細胞，用PBS(-)清洗後，將細胞重懸於200 μ I的50%0pt1-pi^p?溶液(20mM Tris-HCl(pH7.9),50%0pt1-prep?)中，進行超聲波破碎，製成裂解物溶液(圖1左圖、泳道1_4、Ml-DE-VPl以及右圖、泳道1-4、M1-H1-VP1)。另一方面，將細胞用Iml的VPl超聲波處理溶液(20mM Tris-HCl (pH7.9)、1%脫氧膽酸鈉)重懸浮，進行超聲波破碎後，以15，OOOrpm,4°C離心5分鐘，分離為上清和細胞團，除去上清。在剩餘的細胞團中加入50%0pt1-pi^p?溶液(20mM Tris-HCl (pH7.9)、50%0pt1-pi^p?)，通過吹打或者進行超聲波處理進行重懸浮，製成了細胞團溶液(圖1左圖、泳道5-8、Ml-DE-VPl以及右圖、泳道5_8、Ml-H1-VPl)。
[0099]將製備得到的裂解物和細胞團溶液的一部分進行SDS-PAGE電泳後，利用CBB染色進行染色(圖1)。
[0100]〔實施例4〕Ml-DE-VLP 和 Ml-H1-VLP 的免疫
[0101]在上述包含Ml-DE-VLP和M1-H1-VLP的裂解物溶液(100 μ I)和細胞團溶液(100 μ I)中，加入作為佐劑的 CpG-olygodeoxyncleotide5002 (TCCATGACGTTCTTGATGTT:序列號52)佐劑5 μ g，對8周齡的轉基因小鼠以足墊、足跟關節、靜脈內、腹腔內、肌肉內、鼻腔內的途徑進行免疫。轉基因小鼠使用以C57BL/6為背景、表達在HLA-A 0201和H_2Db的嵌合體中進一步融合有人的β 2m的小鼠。該小鼠由於敲除了小鼠的β2πι和H-2Db，所以可以認為源自小鼠的MHC class I沒有在細胞表面露出。
[0102]〔實施例5〕從免疫小鼠的脾臟和肺中製備淋巴細胞
[0103]在免疫I周或2周後，從小鼠摘出脾臟和肺，分別放置於加入了 5ml的RPM1-1640培養基的Φ 6cm培養皿中。使用鑷子將脾臟在培養基內充分分散開，將培養基中含有溶出的淋巴細胞的溶液移動至15ml試管，再將Φ 6cm培養皿用5ml的RPM1-1640培養基清洗一次，將上清加入該15ml試管，使總量為10ml。立刻將堆積在15ml試管的底部的組織碎片保留，將上清再次移至新的15ml試管，在室溫以1，200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞變成細胞團。除去上清，分散開細胞團後，為了除去紅細胞，加入250 μ I的NH4Cl-Tris溶液混合後，立即加入IOml的RPM1-1640培養基，在室溫以1，2000rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，再加入IOml的RPM1-1640培養基，以不吸到變性的紅細胞的方式，用移液管轉移至新的15ml試管，再次在室溫以l，200rpm離心5分鐘。除去上清後，將細胞團分散開，並用IOml的RPM1-1640培養基再一次懸浮，在室溫以l，200rpm離心5分鐘。除去上清，最後用2ml的混入有10%FCSRPM1-1640培養基懸浮。為了對淋巴細胞進行計數，在490 μ I的2%乙酸溶液中加入10 μ I的上述懸浮溶液，用Burker-Turk血細胞計數板算出細胞數，用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋或濃縮至2X 107cells/ml。
[0104]摘出的肺轉移至沒有混入培養基的Φ 6cm培養皿中，用剪刀充分剪碎後，用IOml的 50unit/ml Collagenase Typel、混入有 10%FCS 的 RPM1-1640 培養基懸浮，以 I 小時、37°C用5%C02培養箱孵育。孵育後，通過IOOym Nylon制的cell strainer (細胞過濾器)(BDFalcon),將上清回收至50ml試管,將殘留在strainer的組織片用cell scraper (細胞刮棒)磨碎後，再使其通過IOml混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，將總量20ml的溶液回收至50ml試管。將回收的溶液在室溫、1，200rpm離心5分鐘，除去上清，將細胞團分散開後，加入10mlRPM1-1640培養基，將懸浮液移至15ml試管。將轉移後的15ml試管在室溫、1，200rpm離心5分鐘，除去上清，將細胞團分散開後，再加入IOml RPM1-1640培養基，在室溫、1，200rpm離心5分鐘，由此清洗細胞。除去上清後,將細胞團分散開,最後加入IOml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，在室溫、1，200rpm離心5分鐘，除去上清，將細胞團分散開後，加入250 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基。
[0105]〔實施例6〕ICS分析
[0106]為了研究在按照上述方法從脾臟和肺中回收的淋巴細胞中，與Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)反應而被誘導的CTL的存在，進行了 ICS分析。在96孔圓底培養板中，每I孔加入5 μ I的以混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋25倍的BD GolgiPlug? (BD),在其中再加入以混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋的20 μ M的Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL, Operon) 100 μ I。作為陰性對照，加入不含肽的10%RCS混入RPM1-1640培養基 100u I ο
[0107]在該孔中加入上述製備的從脾臟製備的淋巴細胞和從肺製備的淋巴細胞100 μ I後，以5小時、37°C、5%C02培養箱孵育。
[0108]孵育後，以4°C、1, 400rpm短暫離心(spin down)除去上清，用旋潤混合器將細胞分散開後，每I孔加入FACS緩衝液(2%FCS，0.l%sodium azide (疊氮鈉)，1XPBS (-))200 μ 1，再以4°C、l，400rpm短暫離心除去上清，將細胞分散開後，加入用FACS緩衝液稀釋至 5μ g/ml 的 Mouse BD Fe Block? (BD Pharmingen) 100 μ I,在 4°C 鮮育 10 分鐘。
[0109]孵育後，以4 °C、1，400rpm短暫離心，除去上清，將細胞分散開後，在每I孔加入FACS緩衝液200 μ 1，再以4°C、1，400rpm短暫離心，除去上清，再進行一次利用FACS緩衝液的清洗操作。在分散開的細胞中，每I孔加入用FACS緩衝液稀釋至10 μ g/ml的FITCRatAnt1-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen) 50 μ I,在 4°C 的暗處孵育 30 分鐘。
[0110]在孵育後，進行2次用200 μ I的FACS緩衝液的清洗操作後，在分散開的細胞中，每 I 孔加入 100 μ I 的 BD Cytofix/Cytoperm? (BD Biosciences),在 4°C 的暗處孵育 20分鐘。孵育後，用 200 μ I 的 IXBD Perm/Wash? (BD biosciences)進行 2 次與用 FACS 緩衝液進行的清洗操作同樣的操作後，在分散開的細胞中，加入用IXBD Perm/Wash?稀釋至10yg/ml 的 PE ant1-mouse IFN-Y Clone: XMG1.2 (BioLegend) 50 μ I,在 4°C 的暗處孵育30分鐘。
[0111]孵育後，進行2次用200μ I的IXBD Perm/Wash?的清洗操作後,在分散開的細胞中，每I孔中加入100 μ I的FACS固定緩衝液(1%甲醛，I XFACS緩衝液)，在4°C的暗處孵育過夜。
[0112]孵育後，將400 μ I的FACS緩衝液加入到5ml的聚苯乙烯試管中，在其中加入用100 μ I的FACS固定緩衝液固定的樣品後，用FACScan (BD)進行點矩陣作圖分析。分析中使用Cell Quest (BD)的軟體。圖2、圖3表示ICS的2維分析的結果。
[0113]如圖2所示，在任意的測定結果中，通過CTL表位肽的孵育，CD8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞數的比例增大。另外，沒有加入CpG的試樣也得到了⑶8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞數的比例增大的結果。從這些結果可知，Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP即使沒有佐劑，也具有能夠誘導CTL的可能性。
[0114]如圖3所示，在將Ml-DE-VLP進行肌肉內給藥時，以及將Ml-H1-VLP進行腹腔內給藥時，通過CTL表位肽的孵育，⑶8陽性/細胞內IFN- Y陽性細胞數顯著增多。
[0115]〔實施例7〕CD107-1CS 分析
[0116]為了研究在用實施例5的方法從脾臟回收的淋巴細胞中，與Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)反應而被誘導的具有細胞毒活性的CTL的存在，進行了⑶107-1CS分析。在96孔圓底培養板中，每I孔加入5 μ I用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋25倍的BDGolgiPlug?(BD),並且每I孔加入5 μ I用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋25倍的BD GolgiStop?(BD)、0.8μ g FITC Rat Ant1-Mouse CD107a Clone:1D4BCBD Pharmingen),在其中進一步加入用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋的20 μ M的Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL、Operon) 100 μ I。作為陰性對照，加入不含肽的混入有10%RCS的RPM1-1640培養基100 μ I。
[0117]在該孔中加入在實施例5中製備得到的從脾臟製備的淋巴細胞100μ I後，在暗處、37°C用5%C02培養箱孵育6小時。
[0118]孵育後，以4°C、l，400rpm短暫離心，除去上清，用旋渦混合器將細胞分散開後，在每 I 孔中加入 FACS 緩衝液(2%FCS，0.l%sodium azide, IXPBS (-)) 200 μ 1，再以 4°C、1，400rpm短暫離心，除去上清，將細胞分散開後，加入用FACS緩衝液稀釋至5 μ g/ml的Mouse BD Fe Block? (BD Pharmingen) 100 μ 1，在 4°C孵育 10 分鐘。
[0119]孵育後，以4°C、l，400rpm短暫離心，除去上清，將細胞分散開後、每I孔中加入FACS緩衝液200 μ 1，再以4°C、1，400rpm短暫離心，除去上清，再進行一次利用FACS緩衝液的清洗操作。在分散開的細胞中，每I孔中加入用FACS緩衝液稀釋至10 μ g/ml的PE/Cy5Rat Ant1-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen)50 μ I,在 4°C 的暗處孵育 30 分鐘。
[0120]孵育後，進行2次用200 μ I的FACS緩衝液的清洗操作後，在分散開的細胞中，每I孔中加入 100 μ I 的 BD Cytofix/Cytoperm?(BD Biosciences),在 4°C 的暗處孵育 20 分鐘。孵育後，用200 μ I的IXBD Perm/Wash? (BD biosciences)進行2次與用FACS緩衝液進行的清洗操作同樣的操作後，在分散開的細胞中，加入用IXBD Perm/Wash?稀釋至10 μ g/ml 的 PE ant1-mouse IFN- y Clone:XMG1.2(BioLegend)50 μ 1，在 4°C 的暗處孵育 30 分鐘。
[0121]孵育後,進行2次用200μ I的IXBD Perm/Wash?的清洗操作後,在分散開的細胞中，每I孔中加入100 μ I的FACS固定緩衝液(1%甲醛，I XFACS緩衝液)，在4°C的暗處孵育過夜。
[0122]孵育後，在5ml的聚苯乙烯試管中加入400 μ I的FACS緩衝液，在其中加入100 μ I的用FACS固定緩衝液固定的樣品後，用FACScan(BD)進行點矩陣作圖分析。分析使用CellQuest (BD)的軟體。圖4表示⑶107-1CS的二維分析的結果。
[0123]如圖4所示，可知在任意的測定結果中，通過CTL表位肽的孵育而使⑶8陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞數的比例增大的情況下，⑶8陽性/⑶107陽性/細胞內IFN-Y陽性細胞數的比例也都增大。由於⑶8陽性/⑶107陽性/細胞內IFN- Y陽性細胞具有細胞毒活性，所以可知利用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的免疫，存在能夠誘導具有細胞毒性的CTL的可能性。[0124]〔實施例8〕51 絡釋放(51Chrome release)分析
[0125]為了顯示實施例7所示的⑶8陽性/⑶107陽性/細胞內IFN- Y陽性細胞的細胞毒作用，進行了 51鉻釋放分析。從沒有免疫的小鼠中用與實施例5同樣的方法製備脾臟的淋巴細胞。在2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基中的沒有免疫的小鼠的脾臟淋巴細
2.4X IO8Cells 中，加入 IOmM 的 Ml 的 CTL 表位的肽(GILGFVFTL，Operon) 4 μ 1，在 15ml試管中，以37°C、5%C02培養箱孵育2小時。孵育後，照射20Gy (格瑞)的X射線。照射後，以室溫、1，2000rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，為了對淋巴細胞進行計數，在490 μ I的2%乙酸溶液加入10 μ I的淋巴細胞溶液，用Burker-Turk血細胞計數板算出細胞數，用混入有10%FCS 的 RPM1-1640 培養基稀釋至 5X 106cells/ml。
[0126]同時，通過肌肉注射免疫約50 μ g的M1-DE-VLP，並且通過腹腔注射免疫約50 μ g的M1-H1-VLP，免疫I周后，從小鼠中摘出脾臟，分別放置於加入了 5ml的RPM1-1640培養基的Φ6(^培養皿中。使用鑷子將脾臟在培養基內充分分散，將培養基中含有溶出的淋巴細胞的溶液移至15ml試管，用5ml的RPM1-1640培養基將Φ 6cm培養皿再清洗一次，將上清加入該15ml試管中，使總量為10ml。進行了免疫的淋巴細胞由於沒有除去血液，所以立刻將堆積在15ml試管的底部的組織碎片保留，再次將上清移至新的15ml試管，以室溫、1，200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，為了對淋巴細胞進行計數，在490 μ I的2%乙酸溶液加入10 μ I的淋巴細胞溶液，用Burker-Turk血細胞計數板算出細胞數，用混入有10%FCS的 RPM1-1640 培養基稀釋至 5X106cells/ml。
[0127]在48孔培養板中，每I孔中，將500 μ I沒有實施上述免疫的、以Ml的CTL表位的肽孵育、經過X射線照射的淋巴細胞5X106cellS/ml與500 μ I經過免疫的淋巴細胞5Χ 106cells/ml混合。該孔每I個樣品製作了 24個孔。混合後，以37°C、5%C02培養箱孵育7天。
[0128]7天的孵育後，將24孔中的淋巴細胞收集到I支50ml試管中，以室溫、1，200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，為了對淋巴細胞進行計數，在20 μ I的0.4%臺盼藍(Trypan Blue)溶液(Gibco)中加入20 μ I的淋巴細胞溶液，用Burker-Turk血細胞計數板算出細胞數，用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋或濃縮至7.5X 106cells/ml。將該製備得到的淋巴細胞作為效應細胞。
[0129]同時，將lX106cells/ml的RMA-HHD培養細胞各Iml分注入2支15ml試管，在一個試管中加入IOmM的Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL，Operon)5 μ 1，以37°C、5%C02培養箱孵育2小時。在另一個試管中沒有加入肽。孵育後，以室溫、1，OOOrpm離心5分鐘，使細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入IOOyCi (微西韋特)的Na251CrO4溶液，在37°C、5%C02培養箱孵育30分鐘。孵育後，以室溫、I, OOOrpm離心5分鐘，使細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，為了進行清洗操作，加入Iml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，以室溫、I, 200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團，除去上清。重複5次該清洗操作。最後，除去上清後，加入Iml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基。在新的15ml試管中，混合500 μ I該細胞溶液與9.5ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，稀釋20倍。將該細胞溶液作為靶細胞。
[0130]在96孔板中分別加入100μ I的靶細胞(5X103cells)，在其中，加入效應細胞100μ I (7.5X105cells)，使效應細胞:靶細胞的比率為150:1 ;加入效應細胞20 μ I(1.5 X IO5Cells)和80 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，使效應細胞:靶細胞的比率為30:1 ;加入效應細胞10 μ I (7.5Χ IO4Cells)和90 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，使效應細胞:靶細胞的比率為15:1。作為陽性對照，加入100 μ I的5%Triton-X100溶液，作為陰性對照，加入100 μ I的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基。混合後，以37°C、5%C02培養箱孵育4小時。
[0131]孵育後，使用Supernatant collection system (Molecular Devices)回收上清，用 AUTO WELL GAMMA SYSTEM(ARC_380CL，Aloka)以及ALOKA RIA ProgramCARCAS ver.3.11，Aloka)對釋放的51Cr的伽馬射線進行計數、分析。圖5表示51鉻釋放分析的結果。
[0132]如圖5所示，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫、製備的淋巴細胞選擇性地損傷提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的細胞(圖5的Ml: 58-66)，由此誘導51Cr的釋放，因此可知，通過Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的免疫，能夠誘導出選擇性地損傷提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的細胞的 CTL。
[0133]〔實施例9〕In vivo CTL 分析
[0134]為了分析實施例8所示的選擇性損傷提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的細胞的CTL實際上在動物體內選擇性地損傷提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的細胞，進行了 Invivo CTL分析。通過肌肉注射免疫約50 μ g的M1-DE-VLP，並且通過腹腔注射免疫約50 μ g的 Ml-H1-VLP。
[0135]免疫I周后，從未免疫的3隻小鼠中摘出脾臟，放置於加入有5ml的RPM1-1640培養基的Φ6οπι培養皿。使用鑷子將脾臟在培養基內充分分散，將在培養基中含有溶出的淋巴細胞的溶液移至15ml試管，將Φ 6cm培養皿用5ml的RPM1-1640培養基再清洗一次，將上清加入該15ml試管,使總量為10ml。沒有免疫的淋巴細胞由於沒有除去血液，因此立刻將堆積在15ml試管的底部的組織碎片保留，將上清再移至新的15ml試管，以室溫、1，200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基。將製備得到的沒有免疫的淋巴細胞Iml分別注入2支15ml試管中，在其中一支試管中加入1μ I的IOmM的Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL，Operon)，以I小時、37°C在5%C02培養箱孵育。孵育後，以室溫、I, 2000rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，再加入IOml的RPM1-1640培養基，以室溫、1，2000rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清,將細胞團分散開後,加入20ml的混入有0.1%BSA的PBS (_)溶液，在用CTL表位肽(GILGFVFTL)孵育的淋巴細胞溶液中，加入10 μ I的5mM羧基突光素二醋酸鹽玻拍酸亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidylester) (CFSE) (Molecular Probes),在沒有用肽孵育的淋巴細胞溶液中，加入1μ I的5mMCFSE,充分混合後，在37°C的水浴中振蕩培養10分鐘。振蕩後，以室溫、I, 200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入IOml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，以室溫、1，200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入2ml的混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，為了對淋巴細胞進行計數，在490 μ I的2%乙酸溶液中加入10 μ I的淋巴細胞溶液，用Burker-Turk血細胞計數板算出細胞數，用10%FCS混入RPM1-1640培養基稀釋或濃縮成為5X 107cells/ml。將由CFSE標記的沒有用肽孵育的淋巴細胞5X107cellS/ml和孵育的淋巴細胞5X 107cellS/ml等量混合，製成CFSE標記淋巴細胞溶液。
[0136]將沒有免疫的小鼠利用肌肉注射免疫約50 μ g的M1-DE-VLP，並且利用腹腔注射免疫約50 μ g的M1-H1-VLP，對經過一周的各個小鼠靜脈注射上述製備的CFSE標記淋巴細胞溶液200 μ I,使其經過一天。
[0137]經過一天後，從小鼠中摘出脾臟，置於加入有5ml的RPM1-1640培養基的Φ6αιι培養皿。使用鑷子將脾臟在培養基內充分分散開，將在培養基中含有溶出的淋巴細胞的溶液移至15ml試管，將Φ 6cm培養皿用5ml的RPM1-1640培養基再清洗一次，將上清加入該15ml試管，使總量為10ml。淋巴細胞由於沒有除去血液，所以立刻將堆積在15ml試管的底部的組織碎片保留，將上清再移至新的15ml試管，以室溫、1，200rpm離心5分鐘，使淋巴細胞成為細胞團。除去上清，將細胞團分散開後，加入Iml的FACS固定緩衝液(1%甲醛，I XFACS緩衝液)。將500 μ I的FACS緩衝液加入5ml的聚苯乙烯試管，在其中加入用200 μ I的FACS固定緩衝液固定的淋巴細胞溶液後，用FACScan (BD)進行直方圖分析。分析使用Cell Quest(BD)的軟體。圖6表示In vivo CTL分析的結果。
[0138]如圖6所示，從沒有免疫的小鼠製備淋巴細胞時，沒有混合CTL表位序列的淋巴細胞(在圖中的「低」的位置表示。)和混合了 CTL表位序列的淋巴細胞(在圖中的「高」的位置表示。)的細胞數基本相同。另一方面，從用Ml-DE-VLP或Ml-H1-VLP免疫的小鼠中製備淋巴細胞時，與沒有混合CTL表位序列的淋巴細胞(在圖中的「低」的位置表示。)相比，混合了CTL表位序列的淋巴細胞(在圖中的「高」的位置表示。)的細胞數更少。由此可知，通過由Ml-DE-VLP或Ml-H1-VLP的免疫而誘導的CTL，實際上在動物體內選擇性地損傷提呈Ml的CTL表位肽的細胞。
[0139]〔實施例10〕淋巴細胞的成熟化分析
[0140]用與實施例5同樣的方法，從C57BL/6小鼠的脾臟中純化除去了紅細胞的淋巴細胞，用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋，以達到I X 107cells/ml。在96孔板中，加入a)沒有任何添加的 50%0pt1-pi^p? 溶液(20mM Tris-HCl (ρΗ7.9)，50%0pt1-prep?) 5 μ 1，加入b)實施例3製備的Ml-DE-VLP溶液5 μ 1、或者c)Ml-HI_VLP溶液5 μ 1，在其中加入上述製備的淋巴細胞50 μ 1，並加入混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，使每I孔的總量為200 μ l。用吹打混合後，將該板以37°C、5%C02培養箱孵育6小時或24小時。
[0141]孵育後以4°C、l，400rpm短暫離心，除去上清，用旋渦混合器將細胞分散開後，在每 I 孔中加入 FACS 緩衝液(2%FCS，0.l%sodium azide, IXPBS (-)) 200 μ 1，再以 4°C、1，400rpm短暫離心，除去上清，將細胞分散開後，加入用FACS緩衝液稀釋至10 μ g/ml的FITC Armenian Hamster Ant1-Mouse CD80Clone:16-10A1 (BD Pharmingen)、或 FITC RatAnt1-Mouse CD86Clone:GL-KBD Pharmingen)、或者 FITC Armenian Hamster Ant1-MouseCD40Clone:HM40-3 (BD Pharmingen) 100 μ 1，在 4°C、暗處孵育 30 分鐘。
[0142]孵育後，進行2次用200 μ I的FACS緩衝液的清洗操作，然後在分散開的細胞中，每I孔中加入100μ I的FACS固定緩衝液(1%甲醛，IXFACS緩衝液)，在4°C的暗處孵育過夜。
[0143]孵育後，在5ml的聚苯乙烯試管中加入400μ I的FACS緩衝液，在其中加入用100 μ I的FACS固定緩衝液固定的樣品，然後，用FACScan (BD)進行直方圖分析。分析使用Cell Quest (BD)的軟體。圖7表示直方圖的結果。
[0144]如圖7所示，50%0pt1-prep?溶液不誘導⑶80、⑶86、⑶40的成熟化標記物的表達，與之相對，混入Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的溶液誘導CD86、CD40的成熟化標記物的表達。CD86的表達對於細胞毒性T細胞的活化很重要，因此可知Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP具有細胞毒性T細胞的活化作用。
[0145]〔實施例11〕病毒挑戰實驗
[0146]為了分析選擇性損傷提呈Ml的CTL表位肽(GILGFVFTL)的細胞的CTL對於流感病毒感染的影響，進行了病毒挑戰實驗。對HLA-A2轉基因小鼠(HHD小鼠)利用肌肉注射免疫約50 μ g的Ml-DE-VLP,並且利用腹腔注射免疫約50 μ g的M1-H1-VLP。
[0147]免疫I周后，將流感病毒(A/H1N1/PR8和A/H3N2/Aichi)用PBS (-)以組織培養流感病毒的感染劑量(tissue culture influenza virus infectious dose) (TCID5tl)計稀釋至1001^105(|/2(^1，對免疫的小鼠實施麻醉後，將該稀釋溶液2(^1經鼻感染。 [0148]感染4天後，取出小鼠肺，加入Iml的PBS (_)後，用組織勻漿器(玻璃勻漿器，帶凸起，10ml，812-770-02，池本理化)將組織研碎至看不到為止，之後，將溶液移至15ml試管。用離心機以4°C、2000rpm離心5分鐘，將上清移至帶有螺紋蓋的2ml試管。為了通過加入雞的紅細胞而根據紅細胞的凝集算出流感病毒量，將小鼠肺研碎得到的上清100μ I加到圓底的96孔板的列Α，從列B至G加入混入有5%FCS的DMEM培養基90 μ 1，作為陰性對照在列H加入混入有5%FCS的DMEM培養基100 μ I。從列A使10 μ I移動到列B，用吹打進行懸浮後，重複進行從列B使10 μ I移動至列C進行懸浮的操作，直至列G，製作流感病毒感染肺上清的10倍稀釋系列。為了算出平均值，每一個樣品製作5個該系列。在該系列中全部各加入2.5 X 105cel I s/ml的MDCK細胞100 μ 1，然後以35°C、5%C02培養箱孵育24小時。孵育後，將培養上清用移液器全部除去，加入200 μ I的混入有0.0002%胰蛋白酶(2 μ Ι/ml胰蛋白酶)的DMEM培養基後，再以35°C、5%C02培養箱孵育3天。孵育後，加入50 μ I的0.8%雞血液(雞保存血液，0109-1，日本Biotest研究所)，在4°C靜置I小時。根據紅細胞的凝集分布算出組織培養流感病毒的感染劑量(TCID5tl)。
[0149]如圖8a所示，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫的小鼠肺中的流感病毒滴度，與不進行免疫的小鼠相比較，低約10倍，由此表明Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫具有抑制流感病毒在肺中增殖的效果。
[0150]另外，從流感病毒(A/H1N1/PR8)感染之後，2周每天測定小鼠的體重，記錄將感染前的體重設為100%時的體重變化。如圖8b所示，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP免疫的小鼠的體重大致維持其原來的體重，與之相對，未進行免疫的小鼠觀察到顯著的體重降低，由此表明利用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的免疫對於抑制由流感病毒感染引起的體重降低也有效
果O
[0151]〔實施例12〕插入有癌CTL表位的VLP免疫
[0152]用與實施例1到3相同的方法，代替Ml的CTL表位序列(GILGFVFTL)，製備了插入有對於作為癌抗原已知的WTl的HLA-A2的CTL表位序列(RMFPNAPYL)的VLP(WTIWT-DE-VLP、WTIWT-H1-VLP)(圖9_a)。用與實施例4到6相同的方法，對HLA-A2轉基因小鼠進行免疫，製備淋巴細胞，進行了對於WTl的CTL表位序列的ICS分析(圖9-b)。另外，利用與實施例8同樣的方法，進行了對於WTl的CTL表位序列的51鉻釋放分析。
[0153]如圖9所示，可知與插入了 Ml的CTL表位序列的VLP同樣，製備插入有WTl的CTL表位序列的VLP (圖9-a)，並進行免疫，由此，對於WTl的CTL表位序列(RMFPNAPYL)的CTL被誘導(圖9-b)，所誘導的對於WTl的CTL表位的CTL選擇性地損傷提呈WTl的CTL表位序列的細胞(圖9-c)。由此，表明VLP是能夠誘導對於各種CTL表位序列的CTL的有用的載體。
[0154]〔實施例13〕 利用MlCTLpeptide懸浮IFA乳濁液進行CTL誘導的ICS分析
[0155]利用與實施例3到6同樣的方法，進行Ml-DE-VLP (圖10，右上圖)和M1-H1-VLP(圖10,右下圖)的ICS分析。免疫通過在鼠蹊部皮下(subcutaneous, s.c.)注射與實施例4同樣製備的100 μ I的Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP的細胞團溶液來進行。
[0156]另一方面，懸浮有Ml的CTL表位的肽(GILGFVFTL)的IFA乳濁液如下製備，即，用450 μ I的PBS (-)稀釋20 μ g/μ I濃度的在DMSO溶劑中溶解的GILGFVFTL肽(Operon)50 μ I,與 500 μ I 的弗氏不完全佐劑(incomplete freund』 s adjuvant, IFA) (Sigma) 一起，利用雙注射器法(Two-syringe法)(GP注射器接頭，NIPRO) (Inject2ml, B.BRAUN)混和。通過在鼠蹊部皮下(subcutaneous, s.c.)注射所製備的乳池液100 μ I進行免疫。進行一次免疫(圖10，左上圖)，並且在一次免疫一周後進行第二次免疫(圖10，左下圖)，經過一周，使用經過一周後的小鼠，利用與實施例5到6同樣的方法進行ICS分析。
[0157]如圖10所示，相比於通過MlCTL P印tide懸浮IFA乳濁液一次免疫、二次免疫的小鼠脾臟淋巴細胞，用Ml-DE-VLP和Ml-H1-VLP —次免疫的小鼠的脾臟淋巴細胞，通過與MlCTL peptide的孵育所誘導的⑶8陽性/細胞內IFN- Y陽性CTL的比例更高。由此表明，相比於作為經典的佐劑已知的IFA，使用VLP構建的本發明的細胞毒性T細胞誘導劑的⑶8陽性/胞內IFN- Y陽性CTL的誘導效率更好。
[0158]〔實施例14〕脾臟淋巴細胞的IL-12的分泌量的ELISA分析
[0159]利用與實施例5同樣的方法，從HLA-A2轉基因小鼠的脾臟中純化除去了紅細胞的淋巴細胞，用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋，使其達到I X 107cells/ml。在96孔板中，加入 a)沒有任何添加的 50%0pt1-pi^p?溶液(20mM Tris-HClCρΗ7.9)，50%0pt1-prep?)5 μ l、b)高度純化的野生型SV40VPl-VLP(500ng/y 1)5μ l、c)實施例3所製備的Ml-DE-VLP溶液5 μ 1、或者d) Ml-H1-VLP溶液5 μ 1，在其中加入上述製備的淋巴細胞50 μ 1，並加入混入有10%FCS的RPM1-1640培養基，使每I孔的總量為200 μ I。或者，在上述純化的淋巴細胞50 μ I中，加入用混入有10%FCS的RPM1-1640培養基稀釋至IOOng/μ I的LPS(Sigma) 150 μ I。吹打混合後，以37°C、5%C02培養箱將該板孵育6小時或24小時。孵育後，以4°C、I, 400rpm短暫離心,將上清回收到Eppendorf管，以4°C、15, OOOrpm短暫離心，將上清回收到新的Eppendorf管。將回收的培養上清的50 μ I用IL-12的enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) (Mouse Total IL-12ELISA Kit, Thermo SCIENTIFIC)按照試劑盒的操作說明書進行分析，算出培養上清中的IL-12的濃度(圖11)。
[0160]如圖11所示，當用將小鼠的淋巴細胞與將外源的Ml的CTL表位插入到VLP的DE環或HI環而得到的VLP (Ml-DE-VLP、Ml-H1-VLP)孵育時，與野生型的SV40VP1VLP相比，培養上清中的IL-12的濃度增大約20倍，由此表明通過插入外源的表位，相比於野生型的VLP，作為佐劑的活性被增強，作為細胞毒性T細胞誘導劑的效果增大。[0161]產業上的可利用性
[0162]本發明可用作病毒性疾病、癌症的預防藥物或治療藥物，因此能夠在製藥等產業領域中利用。
[0163]本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本國專利申請(特願2011-107874號和特願2011-191208號)的說明書和/或附圖中記載的內容。另外，本說明書中引用的全部發行物、專利和專利申請直接作為參考`在本說明書中引用。
【權利要求】
1.一種細胞毒性T細胞誘導劑，其特徵在於: 其為含有由猿猴病毒40的VPl構成的病毒樣顆粒的細胞毒性T細胞誘導劑，所述VPl的DE環和/或HI環中插入有T細胞表位肽。
2.如權利要求1所述的細胞毒性T細胞誘導劑，其特徵在於: T細胞表位肽為源自病毒蛋白質的肽。
3.如權利要求1所述的細胞毒性T細胞誘導劑，其特徵在於: T細胞表位肽為源自流感病毒的HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2或PB1-F2的肽。
4.如權利要求1所述的細胞毒性T細胞誘導劑，其特徵在於: T細胞表位肽為源自對癌細胞特異性的蛋白質的肽。
5.如權利要求1所述的細胞毒性T細胞誘導劑，其特徵在於: T 細胞表位肽為源自 Melan-A/MART-1、gplOO、MAGE-A3、MAGE-AlO, CEA、HER2/new、NY-E50-UWT-1 或 hTERT 的肽。
6.如權利要求1所述的細胞 毒性T細胞誘導劑，其特徵在於: T細胞表位肽為由序列號I至39中任意一個序列號所記載的胺基酸序列構成的肽。
7.一種人以外的動物的病毒性疾病的預防或治療方法，其特徵在於:將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在所述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自病毒蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人以外的動物進行給藥。
8.一種人以外的動物的癌症的預防或治療方法，其特徵在於: 將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在所述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自對癌細胞特異性的蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人以外的動物進行給藥。
9.一種人的病毒性疾病的預防或治療方法，其特徵在於: 將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在所述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自病毒蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人進行給藥。
10.一種人的癌症的預防或治療方法，其特徵在於: 將由猿猴病毒40的VPl構成的、且在所述VPl的DE環和/或HI環中插入有源自對癌細胞特異性的蛋白質的T細胞表位肽的病毒樣顆粒對人進行給藥。
【文檔編號】A61K39/00GK103747799SQ201280031425
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年4月24日 優先權日:2011年5月13日
【發明者】半田宏, 川野雅章, 松井政則 申請人:Lsip基金運營聯合公司