一種高靈敏度免疫晶片檢測系統及其使用方法

2023-05-16 14:22:06

專利名稱：一種高靈敏度免疫晶片檢測系統及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統及其使用方法，屬於生物晶片技術領域。
背景技術：
在現代血清學檢測技術中，除了 ELISA法之外，還經常採用放免法以及化學發光法等。ELISA法在臨床實驗室已得到普遍的應用，特別是用於各型肝炎標誌物的檢測。但 ELISA法由於操作程序複雜，時間較長，且需要價格昂貴的酶標儀等實驗室非通用設備。 ELISA法需時較長的主要原因，是由於液相中的抗原(或抗體)需經擴散才能與固相上的抗原或抗體反應不適當地縮短反應時間，將使靈敏度降至臨床要求以下。一步法快速檢測試劑盒，雖可提高檢測速度，但有出現假陰性結果的弊端。放免法只能進行單一指標的檢測， 單個指標檢測也需要2 4h，也需要價格昂貴的R-計數器等專用設備，且存在著放射性衰減和汙染。化學發光檢測時間短且靈敏度高，但仍是標記方法的間接判讀結果，未引入分子量等更為客觀的結果判讀體系，檢測正確度易受影響，對每種指標的檢測需專供設計，如多種抗體的檢測存在檢測時間長、成本較高的問題，不利於基層臨床檢驗活動的開展。

發明內容
本發明的目的是為解決現有技術中存在的問題，提供一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，該系統用於檢測時具有檢測速度快、靈敏度高的優點，它不需要螢光掃描儀等昂貴的設備，不需複雜的操作，不受實驗條件的限制，在操作完成後即可直接或間接觀察結果，大大縮短檢測時間和勞動強度。本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點； 反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；或者
反應液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結合的物質； 終止液為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液。本發明上述技術方案中，與生物學指標可特異性結合的物質可以是抗原、抗體、 SPA蛋白、羊抗檢測樣本來源種屬IgG、鼠抗檢測樣本來源種屬IgG、其他動物免疫的抗檢測樣本來源種屬IgG、生物學指標的多克隆抗體等。本發明上述技術方案中，所述載體可以是羧基化等修飾後的載體，一般未修飾的載體其連接方式是物理吸附，修飾後的載體其連接方式是共價鍵結合；但無論是物理吸附和共價鍵結合均不會對本發明的檢測產生本質影響。作為上述技術方案的優選，所述洗滌液的配方如下0. 1 10( v/v)%的TWEEN-20、
50. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的PB緩衝液、0. 1 20 (ν/ν) %的proclin300。作為上述技術方案的優選，所述檢測液包括pH4 7的A液和pH2 7的B液，A 液包括H202和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中， H2O2濃度為0. 005 0. 5 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01 0. 2摩爾每升； 檸檬酸鈉濃度為0. 01 0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升。作為上述技術方案的優選，所述載體為孔徑在0. 1 12微米的多孔性微孔濾膜。作為上述技術方案的優選，所述多孔性微孔濾膜為纖維素類微孔濾膜、尼龍類微孔濾膜或聚氟乙烯類微孔濾膜。所述纖維素類微孔濾膜是指硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、醋酸纖維素與硝酸纖維素的混合物製成的膜、纖維素膜、玻璃纖維素膜等。所述聚氟乙烯類微孔濾膜是指具偏氟乙烯膜和具四氟乙烯膜等。作為上述技術方案的另一種優選，所述載體還可以是聚乙烯、聚苯乙烯、矽橡膠或玻璃材料製成的各種可用於生物學檢測的承載體。本發明的另一個目的是提供一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統的使用方法，它包括以下步驟
1)蛋白反應晶片的製作
用點樣儀將一種或多種能與生物學指標結合的探針溶液或質控點以點陣的形式固化於載體上，室溫乾燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製
配製濃度為0. 01 0. 5摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為0. 01 20%的水溶性色素；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為1 10 (w/v)%的BSA溶液、濃度為1 10 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為0. 1 10 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 1 20 (ν/ν)的proclin300、度為 0. 01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PB緩衝液；
4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下0. 1 10% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的 PB 緩衝液、0. 1 20 (ν/ν) % 的 proclin300 ；
5)能與生物學探針結合物質的生物素標記
①用無水DMSO配置1 20毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；
②用濃度為0.01 0. 2摩爾每升pH6 9的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為 0. 5 5毫克每升的能與生物學探針結合物質溶液；
③按10 200微克每毫克的比率將生物素酯加入上述能與生物學探針結合物質溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育1 h 乩；
④按每100 500微克生物素酯內加入1 100微升的濃度為0.5 2. 0摩爾每升的氯化銨，室溫孵育5 60min ；
⑤將經過步驟③的能與生物學探針結合物質溶液用0.01 0.2摩爾每升的PBS、 CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析2 4 進行純化，或再用蛋白A 或蛋白G層析柱再次純化能與生物學探針結合物質；6)鏈黴親和素能可與生物學探針結合物質與過氧化物辣根酶的複合物標記
①新鮮配製1.0 10. 0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.1 1. Oml新鮮配製的0. 01 2. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用1 10毫摩每升的pH為4 7的醋酸鈉緩衝液進行透析，2 6°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入10 100微升0.1 1. 0摩爾每升的pH為7 10碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入0.1 10毫克的鏈黴親和素或能與生物學探針結合物質，室溫避光輕輕攪拌1 6小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.1 1. 0毫升新鮮配製的濃度為1 10毫克每毫升的 NaBH 4溶液混勻，2 6°C靜置1 6小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PBS溶液進行透析，2 6°C，過夜。 ⑧將步驟⑦製得的透析液，在1000 10000 rpm條件下離心去沉澱，上清液為含 HRP-鏈黴親和素或HRP-能與生物學探針結合物質的複合物；
7)檢測液的配製
檢測液包括PH4 7的A液和pH2 7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 005 0. 5 (ν/ν) %、 檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01 0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01 0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升；
8)終止液的配製
配製濃度為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
具體操作如下
首先將檢測樣本加到蛋白晶片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種生物學指標與晶片載體上包被的對應探針進行特異性的反應結合，然後將反應完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合；接下來加入步驟5)製備的生物素標記好的能與生物學探針結合物質和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物或 HRP-能與生物學探針結合物質的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)製備的生物素標記的能與生物學探針結合物質-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結合物質-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測；
或
首先將封閉液滴加蛋白晶片中，再將檢測樣本加入蛋白晶片中，使樣本溶液中的生物學指標與晶片載體上包被的對應探針進行特異性的反應結合，然後將反應完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合，接下來加入步驟5)製備的生物素標記好的能與生物學探針結合物質和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物或HRP-能與生物學探針結合物質的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)製備的生物素標記的能與生物學探針結合物質-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結合物質-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。綜上所述，本發明具有以下有益效果
1、本發明參照膠體金免疫滲濾法和生物晶片的主要技術優勢和實現方式，最大限度的發揮檢測快速、操作簡單、檢測時間短和勞動強度低等等優勢；
2、選用合適的載體以及修飾後的載體，載體上可同時包被一種、兩種或多種與生物學指標可特異性結合的探針，以實現檢測多元化，最大程度發揮此平臺並行檢測的優勢，為臨床檢測提供更為豐富的數據用於醫院、基層衛生服務站等醫療機構的大規模篩查、監測或輔助判斷；
3、目前蛋白晶片無法在探針包被階段使每個點陣有顏色顯示，因為這樣最終的顯色會受到點陣顏色的直接的幹擾，降低了產品的靈敏度和準確度；而本發明採用水溶性的色素對包被階段的探針點陣進行著色，而在封閉操作後顏色徹底消失，這樣不僅有利於在探針包被和產品裝配階段對產品質量進行方便、有效的控制，而且還不會對最終的檢測結果進行任何幹擾；
4、本發明引入生物素-親和素信號放大系統，進一步提高免疫晶片檢測方法的檢測靈敏度，進一步拓寬蛋白晶片系統的檢測範圍，以適應目前臨床檢測不斷發展的要求；
5、本發明將膠體金蛋白晶片檢測方法和化學發光檢測方法相結合，摒棄了膠體金作為蛋白晶片方法的顯色系統，採用了化學發光檢測中的HRP-TMB顯色系統，同時TMB溶液採用優化後的方法進行自行配製，進一步提高的免疫晶片檢測方法的檢測靈敏度；
6、本發明採用的終止液為自製配方，本法可長時間保存免疫滲濾晶片顯色後的點陣， 避免了膠體金顯色點陣時間久置後顏色消失而導致不利於檢測結果的保存、覆核和追溯的問題；
7、本發明在反應顯色後，既可採用肉眼直接比對的方式，也可採用自製的檢測儀器，對顯色後的各顯色點信號進行自動讀取，進一步豐富了判讀方式，增加了判讀方式的可選擇性和靈活性，提高了檢測的準確性。
具體實施例方式本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。實施例一
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點； 反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；
所述檢測液包括PH4的A液和pH2的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 005 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0.01毫克每升；
所述洗滌液的配方如下0. 1 (v/v)%的TWEEN-20、0. 01摩爾每升pH6的PB緩衝液、 0. 1 (v/v)% 的 proclin300 ；
終止液為0. 01 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
所述載體為孔徑在0. 1微米的多孔性硝酸纖維素微孔濾膜。下面通過一種高靈敏度I型糖尿病多種抗體試劑盒(免疫滲濾法)的設計來闡述本發明。包括以下步驟
1)免疫滲濾反應晶片的製作
用點樣儀將確定濃度的穀氨酸脫羧酶-65、ICA、胰島素、酪氨酸磷酸酶、&1T8A、羧基肽酶_H、HSP65、抗胰島受體共8種或其中的幾種抗原溶液和質控點以點陣的形式固化於硝酸纖維素膜上，室溫乾燥2小時，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製
配製濃度為0. 01摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為0. 01的水溶性色素莧菜紅；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為1 (w/v)%的BSA溶液、濃度為1%的蔗糖溶液、濃度為0. 1% 的TWEEN-20、0. 1的proclin300、濃度為0. 01摩爾每升pH為6的PB緩衝液；
4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下0. 1 (ν/ν)的TWEEN-20、0. 01摩爾每升pH6的PB緩衝液、0. 1 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置1 20毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；
②用濃度為0.01摩爾每升pH6的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為0. 5毫克每升的抗體溶液；
③按10微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育1 h ；
④按每100微克生物素酯內加入1微升的濃度為0.5摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 5min ；
⑤將經過步驟③的抗體溶液用0.01摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析池進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物標記 ①新鮮配製1. 0毫克每毫升的HRP溶液；②向HRP溶液中加入0.Iml新鮮配製的0. 01摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用1毫摩每升的PH為4的醋酸鈉緩衝液進行透析，2°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入10微升0.1摩爾每升的pH為7碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入0.1毫克的鏈黴親和素，室溫避光輕輕攪拌1小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.1毫升新鮮配製的濃度為1毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，2°C靜置1小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.01摩爾每升pH為6的PBS溶液進行透析， 2°C，過夜。⑧將步驟⑦製得的透析液，在1000 rpm條件下離心去沉澱，上清液為含HRP-鏈黴親和素的結合物；
7)檢測液的配製
檢測液包括PH4的A液和pH2的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 005 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0.01毫克每毫升；
8)終止液的配製
配製濃度為0. 01 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將封閉液滴加免疫滲濾晶片中，再將檢測樣本加入免疫滲濾晶片中，通過滲濾的方式，使樣本溶液中的抗體與晶片載體上包被的對應抗原進行特異性的反應結合，然後將反應完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合，接下來加入步驟5)製備的生物素標記好的抗體和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)製備的標記好的抗體IgG-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例二
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點；
反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；
所述檢測液包括PH5的A液和pH3的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 01 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 04摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 02摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 02毫克每毫升；所述洗滌液的配方如下0. 5 (v/v)%的TWEEN-20、0. 04摩爾每升pH6的PB緩衝液、1 (v/v)% 的 proclin300 ；
終止液為0. 05 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
所述載體為孔徑在0. 1 1微米的多孔性醋酸纖維素膜微孔濾膜。下面通過一種高靈敏度I型糖尿病多種抗體檢測試劑盒(免疫滲濾法)的設計來闡述本發明。包括以下步驟
1)免疫滲濾反應晶片的製作
用點樣儀將將確定濃度的穀氨酸脫羧酶-65、ICA、胰島素、酪氨酸磷酸酶、&1T8A、羧基肽酶_H、HSP65、抗胰島受體共8種或其中的幾種抗原溶液和質控點以點陣的形式固化於載體上，室溫乾燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製
配製濃度為0. 05摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為1%的水溶性色素胭脂紅；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為2 (w/v)%的BSA溶液、濃度為2 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 0. 5 (ν/ν) % 的 TWEEN-20、1 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 04 摩爾每升 pH 為 6 的 PB 緩衝液；
4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下0. 5% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 04摩爾每升pH6的PB緩衝液、1 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置2毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；
②用濃度為0.04摩爾每升pH7的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為1毫克每升的抗體溶液；
③按40微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育濁；
④按每200微克生物素酯內加入10微升的濃度為0.8摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 IOmin ；
⑤將經過步驟③的抗體溶液用0.04摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析IOh進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物標記
①新鮮配製2毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.2ml新鮮配製的0. 05摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用2毫摩每升的pH為5的醋酸鈉緩衝液進行透析，3°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入20微升0.2摩爾每升的pH為7碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入0.5毫克的鏈黴親和素，室溫避光輕輕攪拌2小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.2毫升新鮮配製的濃度為2毫克每毫升的NaBH 4溶液混
11勻，3°C靜置2小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0. 04摩爾每升pH為6的PBS溶液進行透析， 3°C，過夜。⑧將步驟⑦製得的透析液，在2000 rpm條件下離心去沉澱，上清液為含HRP-鏈黴親和素的結合物；
7)檢測液的配製
檢測液包括PH5的A液和pH3的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 01 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 04摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 02摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 02毫克每毫升；
8)終止液的配製
配製濃度為0. 5 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將封閉液滴加免疫滲濾晶片中，再將檢測樣本加入免疫滲濾晶片中，通過滲濾的方式，使樣本溶液中的抗體與晶片載體上包被的對應抗原進行特異性的反應結合，然後將反應完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合，接下來加入步驟5)製備的標記好的抗體和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)製備的標記好的抗體IgG-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例三
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點； 反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；
所述檢測液包括PH5的A液和pH4的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 05 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 08摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 04摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 05毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下1 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 08摩爾每升pH7的PB緩衝液、2 (ν/ν) % 的 proclin300。終止液為1 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為孔徑在0. 1 12微米的多孔性聚偏氟乙烯微孔濾膜。下面通過一種高靈敏度I型糖尿病多種抗體檢測試劑盒(免疫滲濾法)的設計來闡述本發明。包括以下步驟1)免疫滲濾反應晶片的製作
用點樣儀將確定濃度的穀氨酸脫羧酶-65、ICA、胰島素、酪氨酸磷酸酶、&1T8A、羧基肽酶_H、HSP65、抗胰島素共8種或其中的幾種抗原溶液和質控點以點陣的形式固化於多孔性聚偏氟乙烯微孔濾膜上，室溫乾燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製
配製濃度為0. 1摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為m的水溶性色素亮藍；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為4 (w/v)%的BSA溶液、濃度為4 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 1 (v/v)% 的 TWEEN-20、2 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 08 摩爾每升 pH 為 7 的 PB 緩衝液；
4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下1% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 08摩爾每升pH7的PB緩衝液、2 (v/v)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置5毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；
②用濃度為0.08摩爾每升pH7的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為2毫克每升的抗體溶液；
③按80微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育；^ ；
④按每300微克生物素酯內加入20微升的濃度為1.2摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 20min ；
⑤將經過步驟③的抗體溶液用0.08摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析20h進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物標記
①新鮮配製4.0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.4ml新鮮配製的0. 1摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用4毫摩每升的pH為5的醋酸鈉緩衝液進行透析，4°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入40微升0.4摩爾每升的pH為8的碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入1毫克的鏈黴親和素，室溫避光輕輕攪拌3小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.4毫升新鮮配製的濃度為4毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，4°C靜置3小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.08摩爾每升pH為7的PBS溶液進行透析， 4°C，過夜。 ⑧將步驟⑦製得的透析液，在4000 rpm條件下離心去沉澱，上清液為含HRP-鏈黴親和素的結合物；
7)檢測液的配製
檢測液包括PH5的A液和pH4的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 05 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 08摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 04摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 05毫克每毫升； 8)終止液的配製
配製濃度為1 (w/v)%的疊氮鈉溶液；
首先將封閉液滴加免疫滲濾晶片中，再將檢測樣本加入免疫滲濾晶片中，通過滲濾的方式，使樣本溶液中的抗體與晶片載體上包被的對應抗原進行特異性的反應結合，然後將反應完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合，接下來加入步驟5)製備的標記好的抗體和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)製備的標記好的抗體IgG-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例四
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點； 反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；
所述檢測液包括PH6的A液和pH5的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 1 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 12摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 06摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 1毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下2 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 12摩爾每升pH7的PB緩衝液、5 (v/v)% 的 proclin300。終止液為2 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為玻片。下面通過一種高靈敏度結核分枝桿菌多種抗體蛋白晶片檢測系統的設計來進一步闡述本發明。包括以下步驟
1)免疫反應晶片的製作
用點樣儀將確定濃度的 LAM、ESAT-6、Ag85A、Ag85B、16kDa、38kDa、CFP10、MPT63、 MPT64、MPT70、MPT53、MPT81、MPT84、CFP32、Mtb8、Mtb8. 4、Mtbl6. 3、CFP10_ESAT6 融合蛋白、 MPT63-MPT70融合蛋白、16kDa-38kDa融合蛋白共20種或其中的幾種抗原溶液和質控點以點陣的形式固化於活化後的羧基化玻片上，進行多人份裝配和封閉操作，再室溫乾燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製配製濃度為0. 2摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為5%的水溶性色素果綠；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為6 (w/v)%的BSA溶液、濃度為6 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 2 (v/v)% 的 TWEEN-20、5 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 12 摩爾每升 pH 為 7 的 PB 緩衝液；
4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下2% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 12摩爾每升pH7的PB緩衝液、5 (v/v)% 的 proclin300 ；
5)抗體標記
①用無水DMSO配置10毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；
②用濃度為0.12摩爾每升pH8的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為3毫克每升的抗體溶液；
③按120微克每毫克的比率將生物素酯加入上述抗體溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育4h ；
④按每300微克生物素酯內加入40微升的濃度為1.4摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 30min ；
⑤將經過步驟③的抗體溶液用0.12摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析2 進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物標記
①新鮮配製6.0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.6ml新鮮配製的0. 5摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用6毫摩每升的pH為6的醋酸鈉緩衝液進行透析，4°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入60微升0.6摩爾每升的pH為8碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入2毫克的鏈黴親和素，室溫避光輕輕攪拌4小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.6毫升新鮮配製的濃度為6毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，4°C靜置4小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.12摩爾每升pH為7的PBS溶液進行透析， 4°C，過夜。 ⑧將步驟⑦製得的透析液，在6000rpm條件下離心去沉澱，上清液為含HRP-鏈黴親和素的結合物；
7)檢測液的配製
檢測液包括PH6的A液和pH5的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中, 濃度為0. 1 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 12摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 06摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 1 毫克每毫升；
8)終止液的配製
配製濃度為2 Cw/v) %的疊氮鈉溶液；首先將檢測樣本加到蛋白晶片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種抗體與晶片載體上包被的對應抗原探針進行特異性共價的反應結合，然後將反應完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合；接下來加入步驟5)製備的標記好的抗體和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-步驟5)製備的標記好的抗體IgG-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例五
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點； 反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；
所述檢測液包括PH6的A液和pH6的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 2 (w/v) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 16摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 08摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 0. 5毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下5 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 16摩爾每升pH8的PB緩衝液、10 (v/v)% 的 proclin300。終止液為5 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為矽橡膠片。下面通過一種高靈敏度結核分枝桿菌多種抗體蛋白晶片檢測系統的設計來進一步闡述本發明。包括以下步驟
1)免疫反應晶片的製作
載體上我們選用羧基化的矽橡膠片，用點樣儀將確定濃度的LAM、ESAT-6、Ag85A、 Ag85B、16kDa、38kDa、CFP10、MPT63、MPT64、MPT70、MPT53、MPT81、MPT84、CFP32、Mtb8、 Mtb8. 4、Mtbl6. 3、CFP10_ESAT6 融合蛋白、MPT63-MPT70 融合蛋白、16kDa_38kDa 融合蛋白共 20種或其中的幾種抗原溶液和質控點以點陣的形式固化於活化後的羧基化矽橡膠片上，進行多人份裝配和封閉操作，再室溫乾燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製
配製濃度為0. 3摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為10%的水溶性色素牛奶巧克力
棕；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為8 (w/v)%的BSA溶液、濃度為8 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 5 (ν/ν) % 的 TWEEN-20、10 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 16 摩爾每升 pH 為 8 的 PB 緩衝液；4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下5% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 16摩爾每升pH8的PB緩衝液、10 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)SPA抗體標記
①用無水DMSO配置15毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；
②用濃度為0.16摩爾每升pH8的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為4毫克每升的 SPA抗體溶液；
③按160微克每毫克的比率將生物素酯加入上述SPA抗體溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育釙；
④按每400微克生物素酯內加入60微升的濃度為1.6摩爾每升的氯化銨，室溫孵育 40min ；
⑤將經過步驟③的SPA抗體溶液用0.16摩爾每升的PBS、CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析3 進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化SPA 抗體；
6)過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物標記
①新鮮配製8毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入0.8ml新鮮配製的1. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用8毫摩每升的pH為6的醋酸鈉緩衝液進行透析，5°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入80微升0.8摩爾每升的pH為9碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入5毫克的鏈黴親和素，室溫避光輕輕攪拌5小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.8毫升新鮮配製的濃度為8毫克每毫升的NaBH 4溶液混勻，5°C靜置5小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.16摩爾每升pH為8的PBS溶液進行透析， 5°C，過夜。 ⑧將步驟⑦製得的透析液，在8000 rpm條件下離心去沉澱，上清液為含HRP-鏈黴親和素的結合物；
7)檢測液的配製
檢測液包括PH6的A液和pH6的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 2 (w/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 16摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 08摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 5 毫克每毫升；
8)終止液的配製
配製濃度為5 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將檢測樣本加到蛋白晶片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種抗體與晶片載體上包被的對應抗原探針進行特異性的共價反應結合，然後將反應完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合；接下來加入步驟5)標記好的SPA生物素化抗體和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-SPA生物素化抗體IgG-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。實施例六
一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；
所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點； 反應液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結合的物質； 所述檢測液包括PH7的A液和pH7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液， B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 5 (ν/ν) %、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為 1.0毫克每毫升；
所述洗滌液的配方如下10 (ν/ν)%的TWEEN-20、0. 2摩爾每升pH8的PB緩衝液、20 (v/v)% 的 proclin300。終止液為10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液。所述載體為尼龍膜。下面通過一種高靈敏度結核分枝桿菌多種抗體蛋白晶片檢測系統的設計來進一步闡述本發明。包括以下步驟
1)免疫反應晶片的製作
載體上我們選用尼龍膜，用點樣儀將確定濃度的LAM、ESAT-6、Ag85A、Ag85B、16kDa、 38kDa、CFP10、MPT63、MPT64、MPT70、MPT53、MPT81、MPT84、CFP32、Mtb8、Mtb8. 4、Mtbl6. 3、 CFP10-ESAT6融合蛋白、MPT63-MPT70融合蛋白、16kDa_38kDa融合蛋白共20種或其中的幾種抗原溶液和質控點以點陣的形式固化於尼龍膜片上，進行多人份裝配和封閉操作，再室溫乾燥，2 8°C密封保存；
2)點樣稀釋液的配製
配製濃度為0. 5摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為20%的水溶性色素(葡萄紫)；
3)封閉液的配製
封閉液的配方如下濃度為10 (w/v)%的BSA溶液、濃度為10 (w/v)%的蔗糖溶液、濃度為 10 (v/v)% 的 TWEEN-20.20 (ν/ν)的 proclin300、濃度為 0. 2 摩爾每升 pH 為 8 的 PB 緩衝液；
4)洗滌液的配製
洗滌液的配方如下10% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 2摩爾每升pH8的PB緩衝液、20 (ν/ ν)% 的 proclin300 ；
5)過氧化物辣根酶標記羊抗人IgG
①新鮮配製10.0毫克每毫升的HRP溶液；
②向HRP溶液中加入1.Oml新鮮配製的2. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；
③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用10毫摩每升的pH為7的醋酸鈉緩衝液進行透析，6°C靜置或攪拌；
④向步驟③製得的溶液中加入100微升1.0摩爾每升的pH為10碳酸鹽緩衝液；
⑤向步驟④製得的溶液中加入10毫克的羊抗人IgG，室溫避光輕輕攪拌6小時；
⑥向步驟⑤製得的溶液中加1.0毫升新鮮配製的濃度為10毫克每毫升的NaBH4溶液混勻，6°C靜置6小時；
⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.2摩爾每升pH為8的PBS溶液進行透析， 6°C，過夜。 ⑧將步驟⑦製得的透析液，在10000 rpm條件下離心去沉澱，上清液為含HRP-羊抗人IgG的結合物；
6)檢測液的配製
檢測液包括PH7的A液和pH7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中, 濃度為0. 5 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為1. 0毫克每毫升；
7)終止液的配製
配製濃度為10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液；
首先將檢測樣本加到蛋白晶片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種抗體與晶片載體上包被的對應抗原探針進行特異性的反應結合，然後將反應完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合；接下來加入步驟5)製備好的HRP-羊抗人IgG 複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-抗原-抗體-HRP-羊抗人IgG的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入TMB A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。
權利要求
1.一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，其特徵在於它包括晶片反應系統和顯色系統； 晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點；反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；或者反應液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結合的物質；終止液為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液。
2.根據權利要求1所述的一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，其特徵在於，所述洗滌液的配方如下0. 1 10 (v/v)%的TWEEN-20、0. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的PB緩衝液、 0. 1 20 (ν/ν)% 的 proclin300。
3.根據權利要求1或2所述的一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，其特徵在於所述檢測液包括PH4 7的A液和pH2 7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2A濃度為0. 005 0. 5 (v/v)%、檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0.01 0.2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0.01 0. 1摩爾每升，B液中 TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升。
4.根據權利要求1或2所述的一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，其特徵在於所述載體為孔徑在0. 1 12微米的多孔性微孔濾膜。
5.根據權利要求4所述的一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，其特徵在於所述多孔性微孔濾膜為纖維素類微孔濾膜、尼龍類微孔濾膜或聚氟乙烯類微孔濾膜。
6.根據權利要求1或2所述的一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統，其特徵在於所述載體為聚乙烯、聚苯乙烯、矽橡膠或玻璃材料製成的各種可用於生物學檢測的承載體。
7.一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統的使用方法，包括以下步驟1)蛋白反應晶片的製作用點樣儀將一種或多種能與生物學指標結合的探針溶液或質控點以點陣的形式固化於載體上，室溫乾燥，2 8°C密封保存；2)點樣稀釋液的配製配製濃度為0. 01 0. 5摩爾每升的PB緩衝液，其中含有濃度為0. 01 20%的水溶性色素；3)封閉液的配製封閉液的配方如下濃度為1 10 (w/v) %的BSA溶液、濃度為1 10 (w/v) %的蔗糖溶液、濃度為0. 1 10 (ν/ν) %的TWEEN-20、0. 1 20 (ν/ν)的proclin300、濃度為 0. 01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PB緩衝液；4)洗滌液的配製洗滌液的配方如下0. 1 10% (ν/ν)的TWEEN-20、0. 01 0. 2摩爾每升pH6 8的 PB 緩衝液、0. 1 20 (ν/ν) % 的 proclin300 ；5)能與生物學探針結合物質的生物素標記①用無水DMSO配置1 20毫克每毫升的生物素N—羥基琥珀醯亞胺酯溶液；②用濃度為0.01 0. 2摩爾每升pH6 9的硼酸鹽緩衝液為溶劑配製濃度至少為 0. 5 5毫克每升的能與生物學探針結合的物質的溶液；③按10 200微克每毫克的比率將生物素酯加入上述能與生物學探針結合的物質的溶液中，混合均勻後並在室溫下孵育1 h 他；④按每100 500微克生物素酯內加入1 100微升的濃度為0.5 2. 0摩爾每升的氯化銨，室溫孵育5 60min ；⑤將經過步驟③的能與生物學探針結合的物質的溶液用0.01 0. 2摩爾每升的 PBS、CBS、醋酸鹽緩衝液、碳酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液透析2 4 進行純化，或再用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化能與生物學探針結合物質；6)鏈黴親和素或能與生物學探針結合的物質與過氧化物辣根酶的複合物標記①新鮮配製1.0 10. 0毫克每毫升的HRP溶液；②向HRP溶液中加入0.1 1. Oml新鮮配製的0. 01 2. 0摩爾每升的過碘酸鈉，室溫下避光靜置或攪拌；③將步驟②製得的溶液裝入透析袋中，用1 10毫摩每升的pH為4 7的醋酸鈉緩衝液進行透析，2 6°C靜置或攪拌；④向步驟③製得的溶液中加入10 100微升0.1 1. 0摩爾每升的pH為7 10碳酸鹽緩衝液；⑤向步驟④製得的溶液中加入0.1 10毫克的鏈黴親和素或能與生物學探針結合的物質，室溫避光輕輕攪拌1 6小時；⑥向步驟⑤製得的溶液中加0.1 1. 0毫升新鮮配製的濃度為1 10毫克每毫升的 NaBH 4溶液混勻，2 6°C靜置1 6小時；⑦將步驟⑥製得的溶液裝入透析袋中，用0.01 0. 2摩爾每升pH為6 8的PBS溶液進行透析，2 6°C，過夜；⑧將步驟⑦製得的透析液，在1000 10000rpm條件下離心去沉澱，上清液為含 HRP-鏈黴親和素或HRP-能與生物學探針結合物質的複合物；7)檢測液的配製檢測液包括PH4 7的A液和pH2 7的B液，A液包括H2A和檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，B液包括TMB-HCl和檸檬酸鈉-鹽酸溶液；其中，H2O2濃度為0. 005 0. 5 (ν/ν) %、 檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液濃度為0. 01 0. 2摩爾每升；檸檬酸鈉濃度為0. 01 0. 1摩爾每升，B液中TMB-HCl的濃度為0. 01 1. 0毫克每毫升；8)終止液的配製配製濃度為0. 01 10. 0 (w/v) %的疊氮鈉溶液；具體操作如下首先將檢測樣本加到蛋白晶片上，通過搖床溫育的方式，使樣本溶液中多種生物學指標與晶片載體上包被的對應探針進行特異性的反應結合，然後將反應完成的載體用洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合；接下來加入步驟5)製備的生物素標記好的能與生物學探針結合物質和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物或 HRP-能與生物學探針結合物質的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)製備的生物素標記的能與生物學探針結合物質-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結合物質-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測；或首先將封閉液滴加蛋白晶片中，再將檢測樣本加入蛋白晶片中，使樣本溶液中的生物學指標與晶片載體上包被的對應探針進行特異性的反應結合，然後將反應完成的膜面滴加洗滌液進行洗滌，以減少其它幹擾物質的非特性結合，接下來加入步驟5)製備的生物素標記好的能與生物學探針結合物質和步驟6)製備好的過氧化物辣根酶和鏈黴親和素的複合物或HRP-能與生物學探針結合物質的複合物，進行搖床溫育，這樣就形成了載體-探針-生物學指標-步驟5)製備的生物素標記的能與生物學探針結合物質-鏈黴親和素-過氧化物辣根酶的複合物或載體-探針-生物學指標-能與生物學探針結合物質-過氧化物辣根酶的複合物，再將反應完成的載體表面用洗滌液進行洗滌，再加入檢測液A液與B液的混合液以及終止液，完成整個晶片的反應過程，最後棄去載體上所有液體；如果待測樣本中含有目標檢測的生物學功能指標，在顯色完成後通過肉眼顏色識別完成樣本的檢測，或通過檢測系統完成對顏色點陣的信號讀取後與檢測儀中設置的色卡進行自動比對完成樣本的檢測。
全文摘要
本發明涉及一種高靈敏度蛋白晶片檢測系統及其使用方法，屬於生物晶片技術領域。它包括晶片反應系統和顯色系統；晶片反應系統包括載體、反應液和洗滌液；顯色系統包括檢測液和終止液；所述載體上包被有能與生物學指標特異性結合的探針點陣或質控點；反應液包括兩種，一種為能與生物學指標結合的生物素標記物，另一種為過氧化物辣根酶與鏈黴親和素的複合物；或者反應液為過氧化物辣根酶標記的能與生物學指標相結合的物質；終止液為0.01～10.0(w/v)%的疊氮鈉溶液。本發明具有檢測速度快、靈敏度高的優點。
文檔編號G01N33/535GK102338801SQ20111022406
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者張燦 申請人:張燦