重組1型單純皰疹病毒及製備方法和應用的製作方法

2023-05-17 21:18:16 2

專利名稱：重組1型單純皰疹病毒及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子病毒基因工程領域。具體地說，本發明涉及一種重組1型單純皰疹病毒，同時還涉及重組1型單純皰疹病毒的製備方法，還涉及重組1型單純皰疹病毒在抗腫瘤中的應用。
背景技術：
病毒感染敏感宿主細胞(包括腫瘤細胞)並在其內大量複製，最終導致細胞裂解死亡。若病毒只能選擇性地在腫瘤細胞內複製，而對正常細胞無害，則病毒可能成為高效殺腫瘤製劑。這是所有進行癌症治療的最基本的重要原則，可惜目前所有抗癌藥物都做不到這一點，它們敵我不分，在殺死癌細胞的同時也殺死了正常細胞，使癌症治療失敗。我們正是根據這一原則，提出創新性思路，進行較長期的工作，取得了成果，故而提出專利申請。
隨著分子生物學、病毒學、免疫學等相關學科的發展和交叉滲透，利用基因工程方法改造病毒，使其選擇性地殺死腫瘤細胞而對正常細胞安全已經成為可能。基因治療作為一種全新的疾病治療手段，將極大程度地改變人類疾病治療的歷史進程。基因治療有可能率先取得突破的是發病機制明確的遺傳病的治療，如囊性纖維變性[Marshall，1995]。值得探索的研究是感染性疾病，如愛滋病和腫瘤的基因治療。腫瘤患者數量繁多，缺乏有效的治療手段，預後極差，對基因治療提出了迫切要求，而且腫瘤基因治療的倫理學問題較少，因此腫瘤基因治療的研究成為備受關注的熱點。
上世紀初，人們發現腫瘤患者在感染病毒或接種病毒疫苗後，腫瘤偶爾會消退，由此產生了用病毒治療腫瘤的設想。幾十年來，呼腸孤病毒(Reovirus)、流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、流感病毒(Influenza virus)和麻疹病毒(Measles virus)等三十多種野生型病毒(既未經基因工程改造)曾先後用於治療腫瘤，結果大多是相似的治療初期，腫瘤明顯消退，但隨著治療的繼續深入，腫塊恢復生長，由於這類野生型病毒都能感染正常細胞，因而均伴隨有病毒感染和病毒感染引起的免疫反應帶來的毒副作用[Sinkovics J and Horvath J，1993]。在經歷了多次失敗後，人們逐漸放棄了對野生型病毒治療模式的探索[Sinkovics J and Horvath J，1993]。
二十世紀九十年代，分子生物學、腫瘤學及病毒學的發展突飛猛進，腫瘤發生的分子機制，細胞與病毒間的作用機制，信號傳導通路，凋亡抑制與誘發機制等逐漸被闡明。人們開始有目的地選擇和改造一些病毒，例如改造人呼腸孤病毒(Reovirus)，單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)，腺病毒(Adenovirus)，反轉錄病毒(Retrovirus)等，使它們能選擇性地在腫瘤細胞中複製，並進一步殺滅腫塊，但對正常細胞不能造成裂解性感染。這一類病毒，被稱為條件性複製病毒或選擇性複製病毒(Conditionalreplicative viruses)，或溶瘤病毒(Oncolytic viruses)。
構建病毒載體，也就是有目的地構建一種重組病毒，傳統方法是共轉染後同源重組，篩選重組病毒。一種新的方法是細菌人工染色體(BAC，bacterial artificialchromosome)(Shizuya H.et al.，1992)在大腸桿菌的「性質粒」F因子(F factor)的基礎上發展起來的。這種方法不用從野生型病毒中篩選重組體，可以直接得到重組病毒，但必須藉助於同源重組的方法。在大腸桿菌中，同源重組是依賴各種重組酶完成的。依賴RecA蛋白的同源重組(Yang XW，1997)是利用一種溫度敏感型的穿梭載體(shuttlingvector)。這個載體含有一個溫度敏感型複製起始子(ts-ori)，使它在30℃時可在宿主菌中順利複製，而在43℃培養環境中會從宿主菌中丟失；穿梭載體中還包含一個大腸桿菌的RecA基因，它的表達產物可克服因為BAC的宿主菌是重組缺陷型(RecA-)而不能有效進行同源重組的弊端；另外，它也含有篩選標記和負篩選標記，因為如果選擇四環素抗性，鐮孢菌酸就可以作為一種針對四環素的負篩選劑，含有四環素抗性基因的細菌是不能在含鐮孢菌酸的平板上生長的。
許多病毒基因組中存在凋亡誘發基因和凋亡抑制基因，且處於相對平衡狀態。正是由於凋亡誘發基因的存在，病毒才導致細胞凋亡；另一方面，正是由於凋亡抑制基因的存在，病毒在細胞中才得以複製，產生子代病毒，感染周圍的細胞。從整體上看，缺失凋亡抑制基因的病毒感染正常細胞僅能誘發細胞凋亡而不能抑制細胞凋亡，因而細胞死亡，病毒不能複製，不會對機體造成嚴重危害。由於腫瘤細胞呈無限增殖狀態或「凋亡抑制」狀態，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的複製，因此這種病毒在腫瘤細胞內能選擇性增殖，進而裂解殺死腫瘤細胞[Nurse，1997]。
已發現的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirus)的E1B[Rao，1992]、單純皰疹病毒(HSV)的icp34.5[Chou，1992]、痘病毒的CrmA[Datta，1997]、人巨細胞病毒(HCMV)的IE1、IE2[Zhu，1995]、人乳頭瘤病毒(HPV)的E6[Xu，1995]等基因。根據上述理論，缺失這些基因的病毒都可望用於腫瘤的生物治療。
1996年10月，Science報導了美國ONYX製藥公司的Bischoff等人用缺失凋亡抑制基因E1B55K的腺病毒治療腫瘤的研究。這種腺病毒在正常細胞中不複製，但能在癌細胞中複製並最終裂解殺滅癌細胞。將這種腺病毒注入荷人宮頸癌的裸鼠瘤體內，發現所有腫瘤尺寸均顯著減小，60％的實驗腫瘤完全消退[Bischoff，1996]。1997年11月，Science又報導了一期臨床試驗結果32例受試頭頸癌患者中，12例腫瘤尺寸明顯減小，減小幅度可達90％，未發現任何毒副作用。用其他腫瘤進行的安全性實驗和用頭頸癌進行的二期臨床試驗正在進行之中。據報導，在二期臨床中，由於1例患者死亡，故以後的開發工作停止。
另一類改造病毒的方法是缺失病毒核苷酸代謝所需要的酶，包括胸腺核苷酸激酶，核苷酸還原酶，脫氧尿苷酸酶等。這一類病毒裂解殺死腫瘤細胞的分子基礎是腫瘤細胞的核苷酸代謝遠較正常組織細胞旺盛，腫瘤細胞可以為病毒提供DNA複製所必須的這些酶，而正常細胞卻不能，由此達到了選擇性裂解殺死腫瘤細胞的目的。這一類病毒以缺失核糖核苷還原酶(ribonucleotide reductase)的hr3為代表(Mineta，T.et al.，1994)。

發明內容
本發明的目的在於提供一種重組1型單純皰疹病毒，該病毒靶向性強，安全性好，可選擇性地感染腫瘤細胞，而對正常細胞無毒害作用。
本發明的另一個目的在於提供一種製備重組1型單純皰疹病毒的方法，該方法簡單易行，而且檢測直觀明了。
本發明的再一個目的在於提供一種重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防腫瘤中的應用，作為抗腫瘤候選藥物，靶向性強，安全性好，提高了抗腫瘤效果。
本發明還涉及重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防人肝癌中的應用。
本發明還涉及重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防人膀胱癌中的應用。
本發明還涉及重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防入神經膠質瘤中的應用。
本發明還涉及重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防人喉癌中的應用。
為了實現上述目的，本發明採用以下技術措施
重組1型單純皰疹病毒Simplexvirus Herps simplexvirus 1rHSVΔrr-34.5/lac(A Herpes Simplex Virus Type I with an Diplex Inactive icp34.5 and rr gene)，保藏中心編號CCTCC-V200601，保藏日2006年2月14日。一種製備重組1型單純皰疹病毒的步驟如下1.重組質粒pHSV1-Δrr的構建1)重組質粒pAEB的構建細菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes，BAC)BAC-V1(Strathdee CA et al.，1999)整合了HSV-1的全基因組，只在非必須基因UL41(編碼vhs蛋白)處插入了BAC的各個元件(原核複製起點，氯黴素抗性基因)。以HSV-1的細菌人工染色體BAC-V1 DNA為模板用PCR技術分別擴增HSV-1的核糖核苷還原酶大亞基基因(3410bp，Genebank編號NC001806)的A(480bp，140-620nt)、B(388bp，1717-2105nt)兩個片段，A的上下遊引物中含EcoRI酶切位點，B的上下遊引物中含XhoI酶切位點。回收PCR產物，分別以EcoRI和XhoI單酶切，並克隆到質粒pIRES-EGFP(購自Clonetech公司)(IRES為內部核糖體進入位點，EGFP為增強型綠色螢光蛋白基因)的同樣酶切位點，因為pIRES-EGFP的IRES上遊362bp含有一個EcoRI酶切位點，EGFP下遊288bp含有一個XhoI酶切位點，因而可得到重組質粒pAEB，A，B片段可作為同源重組的兩個臂使用。
2)穿梭質粒pSV1-AEB的構建質粒pSV1-RecA(Yang w.et al.，1997)的RecA基因上遊含有一個SalI酶切位點；重組質粒pAEB的A片段上遊7bp含有一個SalI酶切位點，B片段下遊65bp含有一個SalI酶切位點。用SalI酶切質粒pSV1-RecA4小時後，牛腸去磷酸化酶(CIAP)處理0.5小時，純化回收；同時用SalI酶切質粒pAEB，切下含有A-IRES-EGFP-B的3500bp的片段，純化回收，並與上述SalI酶切的質粒pSV1-RecA連接構建質粒pSV1-AEB。
3)RecA依賴的共整和體的形成將質粒pSV1-AEB電轉化含HSV-1細菌人工染色體BAC-V1 DNA的大腸桿菌DH10B，鋪在含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB平板上，30℃培養過夜。用無菌牙籤隨機挑取菌落至LB中漂洗，漂洗液再次接種在含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB平板上，在43℃過夜培養，使質粒pSV1-AEB的DNA和BAC-V1 DNA通過A、B臂在HSV-1的rr基因處同源重組形成共整和體菌落。
4)rr基因失活重組質粒pHSV1-Δrr的獲得將上述由pSV1-AEB和BAC-V1 DNA的共整和體菌落在含氯黴素(12.5mg/L)的LB平板中劃線，43℃培養過夜，誘導同源重組的發生和共整和體的解離，接著用四環素的反篩選劑鐮胞菌酸篩選重組菌落，得到含HSV-1基因組的rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr(核糖核苷還原酶大亞基基因620-1717nt共1097bp缺失，其中插入了IRES-EGFP基因導致rr基因失活)。
2.重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的構建1)β-半乳糖苷酶(lacZ)表達盒的獲得與純化猴病毒40(SV40)啟動子(1bp-419bp)控制著載體pSV-β-Galactosidase(購自promega公司)上的lacZ基因(710bp-3755bp)的表達，pSV-β-Galactosidased的lacZ基因3′端含有1個PolyA序列(4021bp-4156bp)；SV40啟動子上遊(6814bp)和lacZ編碼序列的近3′末端(3701bp)處各含有1個EcoRI位點，lacZ表達盒下遊4151bp處則含有1個BamHI位點；故用BamHI和EcoRI雙酶消化，DE81膜回收大片段，獲得LacZ表達盒(4160bp)，其中含有SV40(啟動子)-lacZ-polyA.
2)中間載體I pFL的構建載體pFastBac1(購自Gibco公司)多克隆位點(MCS)中含有EcoRI和BamHI位點，用EcoRI和BamHI雙酶切消化，與步驟1)中EcoRI和BamHI雙酶消化的lacZ表達盒連接，構建中間載體I pFL，該中間載體I pFL的lacZ表達盒上遊(即SV40啟動子上遊)具有載體自身的1個Not1位點。
3)中間載體II pBL的構建BamHI和XhoI雙酶切中間載體I pFL以切下lacZ表達盒；同時BamHI和XhoI雙酶切質粒pBluescript-M13成線型DNA；將lacZ表達盒與線型pBluescript-M13連接，構建成中間載體II pBL，使lacZ表達盒下遊也獲得載體本身的1個NotI位點；於是，lacZ表達盒上下遊均帶有NotI位點。
4)轉移載體pIL的構建質粒p4789(B.Roizman.et al.，1994)帶有完整的HSV-1的icp34.5基因(Genebank編號M33699)及其側翼序列；用NotI酶切質粒p4789，以切去icp34.5基因262bp到終止子1084bp的長823bp序列；同時再以NotI酶切中間載體II pBL，獲得lacZ表達盒，並連接到經NotI酶切的質粒p4789上，構建轉移載體pIL。該轉移載體pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp並被lacZ表達盒插入雙重滅活。
5)重組病毒的獲得轉移載體pIL與1.4)中得到的rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr共轉染敘利亞倉鼠腎細胞系(BHK21)(購自中國典型培養物保藏中心，武漢)，經過同源重組，獲得icp34.5基因被lacZ表達盒插入失活、核糖核苷還原酶基因rr被EGFP基因插入失活的重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δrr-34.5/lac，用病毒上清感染含Xgal軟瓊脂培養基的BHK21細胞，挑出藍斑，進行稀釋，再接種BHK21細胞，進行空斑純化。
構建程序包括用PCR方法擴增出HSV核糖核苷還原酶基因rr的兩個片段--480bp的A片段和388bp的B片段，作為同源重組臂。將兩個同源重組臂分別插入pIRES-EGFP載體的EcoRI和XhoI位點，得到中間載體pAEB。將A-IRES-EGFP-B表達盒(2800bp)以SalI切下，插入溫敏型質粒pSV1-RecA中，得到穿梭質粒pSV1-AEB。在第一次同源重組的過程中，pSV1-AEB與BAC-V1 DNA形成了共整合體。第二次同源重組的第一步，是在氯黴素抗性的平板上43℃培養，使共整合體解離，並逐漸丟失pSV1骨架。接著用四環素的反篩選劑鐮胞菌酸篩選重組菌落，只有確實發生了共整合體解離並丟失了pSV1骨架的菌落被篩選出來。經過兩次同源重組，得到含HSV-1基因組和rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr。
將含有lacZ表達盒的質粒載體pSV-β-Galactosidase用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因為lacZ中還含有另一個EcoRI位點)並回收含有SV40啟動子的4160bp的完整lacZ表達盒，插入到同樣用BamHI/EcoRI雙酶切的轉座載體pFastBac1中，構建成中間載體I pFL；將含有lacZ表達盒的載體pFL用BamHI/XhoI雙酶切並回收完整的lacZ表達盒，插入到同樣用BamHI/XhoI雙酶切的質粒載體pBluescript-M13中，構建成中間載體II pBL；用NotI酶切p4789從icp34.5基因中切除從第262個密碼子(262bp)到終止密碼(1084bp)的823bp序列，但保留其左右側翼序列。用NotI酶切pBL並回收完整的lacZ表達盒，將lacZ表達盒用T4DNA連接酶連接到用NotI酶切的p4789質粒載體中，構建成轉移載體pIL。轉移載體pIL與rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr共轉染敘利亞倉鼠腎細胞系BHK21細胞，由於轉移載體pIL被lacZ表達盒插入失活，使icp34.5基因被分開成左右側翼序列，左翼650bp右翼1500bp與pHSV1-Δrr的icp34.5基因左右側翼序列同源，經過同源重組，等位雙交換，獲得icp34.5基因被、lacZ表達盒插入失活、核糖核苷還原酶基因rr被EGFP基因插入失活的重組1型單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac，用病毒上清感染含Xgal軟瓊脂培養基的BHK21細胞，挑出藍斑，進行有限稀釋，再接種BHK21細胞，進一步空斑純化。用PCR擴增icp34.5基因鑑定重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac，即以人工合成的DNA序列CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC和CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC作引物，進行PCR鑑別重組病毒含有被lacZ表達盒插入失活的icp34.5基因；用病毒感染細胞後基因表達的方法鑑定重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac，即以病毒感染細胞5天後綠色螢光蛋白的表達鑑定核糖核苷還原酶基因中被插入的EGFP基因。
本發明的用途是作為抗腫瘤候選藥物，其靶向性強，安全性好。
本重組1型單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac與其它重組1型單純皰疹病毒、野生型1型單純皰疹病毒及其它抗腫瘤藥物相比，具有如下特點1)HSV-1基因組較大(150kb)，一級結構已經清楚，大約70個基因可被代替而仍能在某些細胞中進行複製，因而插入外源基因的容量可高達30kb，為提高治癌效率，可分別插入各種細胞因子基因，突變型病毒容易包裝[Roizman，1996]，是產品更新換代的基礎。
2)HSV-1宿主範圍較寬，包括分裂的和非分裂的細胞。可以說它可感染迄今研究過的所有類型的脊椎動物細胞[Fields，1990]。本發明構建的重組單純皰疹病毒可望用於多種腫瘤的治療(人肝癌、人膀胱癌、人神經膠質瘤、人喉癌)。
3)本發明中，icp34.5基因被NotI酶切缺失和lacZ表達盒插入雙重滅活，核糖核苷還原酶基因rr被缺失和EGFP表達盒插入雙重滅活，所以含有這種雙基因雙重滅活的重組1型單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac應該是一種非常穩定的突變型病毒，很難回復突變成野生型，保證了產品的安全性。
4)本發明的重組單純皰疹病毒的核糖核苷還原酶基因rr和icp34.5基因被缺失插入失活。核糖核苷還原酶基因rr是核苷酸代謝必需的酶，腫瘤細胞的核苷酸代謝遠較正常組織細胞旺盛，腫瘤細胞可以為病毒提供DNA複製所必須的這些酶，而正常細胞卻不能(Mineta，1994)。icp34.5是HSV-1基因組中的凋亡抑制基因，也是一個重要的神經毒基因，icp34.5失活的HSV-1，不僅毒力大大下降，還可能使病毒獲得利用腫瘤細胞中有缺陷的IFN-PKR信號傳導途徑的能力，選擇性地在這一類細胞中增值(Farassati，2001)。
5)本發明的重組單純皰疹病毒的icp34.5基因被lacZ插入失活，lacZ在SV40啟動子驅動下高效表達，在X-Gal存在下，空斑成為蘭色，因此，lacZ作為報導基因，可以監測、鑑定重組病毒，作為產品質量檢測標準之一。
6)理論上和實驗室研究已經證明，本發明構建的重組病毒能有效地靶向性殺死幾種人癌細胞，不殺死人體正常細胞，具有安全性。
7)本發明構建的重組單純皰疹病毒能像野生型HSV一樣對抗皰疹病毒的有效藥物阿昔洛韋敏感，為該重組病毒在人體內的應用提供保障。既是，倘若有個別病人因機體差異而出現病毒反應，則可以及時用阿昔洛韋進行治療，絕對保障病人的安全。
8)實驗研究已經證明，該重組單純皰疹病毒用國家藥典允許的Vero細胞生產，滴度較高，便於實現工業化生產。
9)HSV是嗜神經性病毒，icp34.5基因是其關鍵性基因和神經毒力基因[Thompson，1983]，缺失icp34.5基因的重組單純皰疹病毒無神經毒性，對小鼠的半致死劑量下降10萬倍，這是該重組單純皰疹病毒特別適於腦癌治療的分子基礎。


圖1重組1型單純皰疹病毒的構建過程，A為含HSV-1基因組但rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr的構建，B為重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的構建。其中MCS多克隆位點；A，Brr基因左右臂片段；EGFP增強型綠色螢光蛋白基因；IRES內部核糖體進入位點；lacZβ-半乳糖苷酶基因；Ampr氨苄抗性基因；Tetr四環素抗性；PCMVCMV啟動子；PPolh多角體基因啟動子；SV40 promoterSV40啟動子；SV40 polyASV40終止序列；T7 promoterT7啟動子；T3 promoterT3啟動子；p1，p2，p3，p4，p5，p6，p7，p8PCR擴增引物。
圖2同源重組臂A、B的PCR鑑定圖，其中1500bp DNA Ladder分子量參照，2A片段，3B片段，4λDNA HindIII/EcoRI分子量參照。A片段為480bp，B片段為388bp，說明同源重組臂A、B擴增成功。
圖3重組質粒pAEB的PCR和酶切鑑定圖，其中MλDNA HindIII/EcoRI分子量參照；1從pAEB中PCR擴增出的A片段；2EcoRI酶切pAEB產生的A片段；3從pAEB中PCR擴增出的B片段；4XhoI酶切pAEB產生的B片段；5EcoRI酶切pIRES-EGFP使其線型化；6pAEB的PCR，以引物p7、p8擴增EGFP片段；7pAEB的PCR，以引物p1、p6擴增出含A的大片段；8pAEB的PCR，以引物p4、p5擴增出含B的大片段。擴增片段A為480bp，B為388bp；EcoRI單酶切pAEB，釋放出A 480bp和質粒5600bp兩個片段，XhoI單酶切pAEB，釋放出B390bp和質粒5700bp兩個片段；p1和p6，p4和p5配對，擴增產物分別為900bp和780bp，p7、p8引物對則擴增出了710bp的EGFP片段。說明重組質粒pAEB構建成功。(引物擴增位點見圖1A)圖4構建穿梭質粒pSV1-AEB的各質粒酶切鑑定圖，其中MλDNA HindIII/EcoRI分子量參照；1SalI酶切質粒pSV1-AEB，釋放11kb和2.8kb的兩個片段；2SalI酶切使質粒pSV1-RecA使其線性化，產生11kb片段；3SalI酶切質粒pAEB釋放2.8kb、2.3kb和900bp三個片段，其中2.8kb片段為A-IRES-EGFP-B盒。說明穿梭質粒pSV1-AEB構建成功。
圖5pHSV1-Δrr基因組的測序，A為以p1為引物測序的結果，B為以p4為引物測的結果。圖A、B陰影部分為IRES-EGFP序列，其餘為rr基因A片段和B片段序列。IRES-EGFP表達盒取代了HSV-1的核糖核苷還原酶大亞基基因的A、B片段間的區域。說明重組質粒pHSV1-Δrr基因組構建成功。
圖6中間載體I pFL的結構和酶切鑑定圖，其中圖B的AλDNA/HindIII分子量參照；BNotI酶切；CEcoRI酶切；D.BamhI/HindIII酶切。NotI酶切使pFL線性化，產生8.9Kb片段；lacZ含有兩個EcoRI位點，以EcoRI酶切釋放3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切產生4.1Kb和4.7Kb兩個片段。說明中間載體構建成功。
圖7中間載體II pBL的結構和酶切鑑定圖，其中圖B的AλDNA/HindIII分子量參照；BBamHI酶切；CNot1酶切；DBamHI/HindIII酶切。用BamHI酶切使pBL線性化，產生約7.1Kb片段；Not1酶切產生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切後得到3.3Kb和3.7Kb的片段。說明中間載體構建成功。
圖8轉移載體pIL的結構和酶切鑑定圖，其中圖B的AλDNA/HindIII分子量參照；BPstI酶切；CXbaI酶切；DNotI酶切。PstI酶切使pIL線性化，得到9.4Kb片段；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb兩個片段；NotI酶切產生4.1Kb和5.3Kb兩個片段。說明轉移載體構建成功。
圖9 Xgal篩選重組單純皰疹病毒，藍斑(箭頭)表示含有該重組病毒。
圖10 PCR鑑定重組1型單純皰疹病毒，ADNA分子量參照(1543、994、695、515、377bp)；B該重組病毒；C野生病毒。PCR引物為icp34.5基因的缺失區，約1.7Kb，野生病毒檢測到了1.7Kb的缺失片段，而重組病毒的這一片段已被缺失，所以用PCR擴增不出。說明重組1型單純皰疹病毒構建成功。
圖11重組單純皰疹病毒感染Vero細胞5天後綠色螢光蛋白的表達。
圖12 rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV對阿昔洛韋(ACV)的敏感性， 代表wtHSV； 代表rHSVΔrr-34.5/lac。說明阿昔洛韋(ACV)對rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV是同樣敏感。
圖13 rHSVΔrr-34.5/lac在腫瘤細胞和正常細胞中的複製效率， 代表人神經膠質瘤U251細胞； 代表正常羊膜wish細胞。說明該重組病毒在U251細胞中能正常複製，最高病毒滴度在感染24小時，到72小時滴度逐漸緩慢下降，對正常wish細胞無毒害作用。
圖14rHSVΔrr-34.5/lac對人神經膠質瘤U251細胞、人膀胱癌EJ細胞、人肝癌Hep3B細胞、人喉癌Hep2細胞、正常羊膜Wish細胞的殺傷效率， 代表正常羊膜wish細胞； 代表人肝癌Hep3B細胞； 代表人膀胱癌EJ細胞； 代表人神經膠質瘤U251細胞； 代表人喉癌Hep2細胞。說明該病毒對正常羊膜Wish細胞不感染，而對Hep3B細胞殺傷率最高，72小時達100％，以下依次為U251細胞、Hep2細胞和EJ細胞，對U251細胞和Hep2細胞的殺傷率到96小時也達100％。
圖15荷人肝癌細胞Hep-3B的裸鼠模型。
圖16 rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠腫瘤與對照組裸鼠腫瘤的對比，其中A未治療對照組；B低劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組；C高劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組。說明高劑量治療組和低劑量治療組對人肝癌細胞有顯著療效，特別是高劑量治療組有極顯著療效。
圖17各組裸鼠的腫瘤大小隨時間變化的趨勢圖，其中 代表高劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組； 代表中劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組； 代表低劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組； 代表未治療組； 代表化療藥物治療組。說明未治療對照組裸鼠的腫瘤體積隨時間延長而持續大幅增加；各治療組裸鼠的腫瘤體積在治療初期上升幅度較大，但在治療中、後期，治療裸鼠的腫瘤體積上升幅度明顯減小，最終各治療組裸鼠腫瘤體積遠遠小於未治療對照組；化療藥物對照組裸鼠的腫瘤體積也是一直持續增加，但上升幅度小於未治療對照組，最終治療效果不及高，中劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組。
圖18治療後的裸鼠腫瘤圖片。各治療組裸鼠腫瘤體積遠遠小於未治療對照組，高劑量治療組則有極顯著療效。
圖19治療裸鼠各器官的聚合酶基因RT-PCR電泳檢測，僅在腫瘤塊中檢測到rHSVΔrr-34.5/lac的聚合酶基因，其他器官中均檢測不到。說明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細胞中複製，而不感染裸鼠的任何細胞、組織和器官。
圖20治療裸鼠各器官的tk基因RT-PCR電泳檢測，僅在腫瘤塊中檢測到rHSVΔrr-34.5/lac的tk基因，其他器官中均檢測不到。說明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細胞中複製，而不感染裸鼠的任何細胞、組織和器官。
圖21 rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠各臟器病理切片(放大倍數20×3.3)。說明該重組病毒只選擇性的在腫瘤細胞中複製，而對正常組織無害。
圖22未治療組裸鼠各臟器病理切片(放大倍數20×3.3)。以此與圖21的對比，同樣說明重組病毒對正常組織無害。
圖23治療組裸鼠的腦組織電鏡照片(放大倍數40000)和腫瘤組織電鏡照片(放大倍數15000)。在腫瘤組織中可見rHSVΔrr-34.5/lac顆粒(箭頭所示)，而在腦組織未見到，說明rHSVΔrr-34.5/lac只選擇性的在腫瘤細胞中複製，而對腦組織無害。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當說明的是，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中具體實驗條件和方法，通常按照常規條件並參考下列資料進行如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，「分子克隆實驗指南」(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，「細胞實驗指南」；E.哈洛等，科學出版社，2002，「抗體技術實驗指南」等所述的方法，或接照製造廠商操作指南所建議的方法。
實施例1重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的構建和獲得質粒載體pSV-β-Galactosidase購自promega公司，轉座載體pFastBac1購自Gibco公司。載體pSV-β-Galactosidase上含有lacZ表達盒，SV40啟動子控制其表達。質粒載體pBluescript-M13購自Stratagene公司。質粒p4789由芝加哥大學Roizman B教授公開(Lagunoff，M.，and B.Roizman.1994.Expression of a herpes simplex virus1 open reading frame antisense to the γ134.5 gene and transcribed by an RNA 3′coterminal with the unspliced latency-associated transcript.J.Virol.686021-6028)，上面含有完整HSVicp34.5基因及其側翼序列。質粒pIRES-EGFP購自Clonetech公司，這個質粒上含有一個增強型綠色螢光蛋白標記。質粒pSV1-RecA由Rockfeller University的Yang和Heintz教授公開(Yang，X.W.，Model，P.，Heintz，N..1997.Homologous recombination based modification in Escherichia coli andgermline transmission intransgenic mice of a bacterial artiEcial chromosome Nat.Biotechnol.15859-865)。整合了HSV全基因組的細菌人工染色體BAC-V1由加拿大University of Western Ontario的Strathdee CA教授公開(Strathdee CA.1999.Transposing BACs to the future.Nat Biotechnol.Apr；17(4)332-3)，BAC-V1在HSV-1的非必須基因UL41(編碼vhs蛋白，功能是促進蛋白成熟)處插入了BAC的各個元件原核複製起點，氯黴素抗性基因。敘利亞倉鼠腎細胞系BHK21細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC010)。引物p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8由上海生工(SANGON)公司合成。本實施例實驗條件和方法，參考了下列資料「分子克隆實驗指南」(第二版)；「細胞實驗指南」。
rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr的構建重組質粒pAEB的構建細菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes，BAC)BAC-V1整合了HSV-1的全基因組，只在非必須基因UL41(編碼vhs蛋白)處插入了BAC的各個元件(原核複製起點，氯黴素抗性基因)。以HSV-1的細菌人工染色體BAC-V1 DNA為模板用PCR技術分別擴增HSV-1的核糖核苷還原酶大亞基基因(3410bp)的A(480bp，140-620nt)、B(388bp，1717-2105nt)兩個片段(圖2)，A的上下遊引物中含EcoRI酶切位點，B的上下遊引物中含XhoI酶切位點。A上遊引物p15′-cag gaa ttc aat ggc gtg atg gtg ctt t(140-160nt)，A下遊引物p25′-tct gaa ttc gtg tcc tcc gag tca tcc(620-590nt)(gaattc為EcoRI酶切位點)；B上遊引物p35′-tttt ctc gag ctg aac ctg ggg accggc aac(1717-1738nt)，B下遊引物p45′-tttt ctc gag gtc cag gtg gcgaat cag gc(2105-2085nt)(ctc gag為XhoI酶切位點)。PCR條件預變性95℃，5min；25個循環94℃，1min，60℃，1min，72℃，1min；延伸72℃，10min。回收PCR產物，分別以EcoRI和XhoI單酶切，並克隆到質粒pIRES-EGFP(IRES為內部核糖體進入位點，EGFP為增強型綠色螢光蛋白基因)的同樣酶切位點，因為pIRES-EGFP的IRES上遊362bp含有一個EcoRI酶切位點，EGFP下遊288bp含有一個XhoI酶切位點。在pIRES-EGFP的EGFP盒的上下遊設計引物p55′-atg ctc gac ctg cag ttg g(1275-1256nt)，p65′-gtc ctg ctg gag ttcgtg ac(2560-2580nt)。p1和p6、p4和p5配對，以PCR擴增鑑定插入方向，A和B正向插入擴增的產物分別為900bp和780bp，重組質粒命名為pAEB(圖3)。穿梭質粒pSV1-AEB的構建質粒pSV1-RecA的RecA基因上遊含有一個SalI酶切位點；重組質粒pAEB的A片段上遊7bp含有一個SalI酶切位點，B片段下遊65bp含有一個SalI酶切位點。用SalI酶切質粒pSV1-RecA 4小時後，牛腸去磷酸化酶(CIAP)處理0.5小時，純化回收；同時用SalI酶切質粒pAEB，切下含有A-IRES-EGFP-B的2800bp的片段，純化回收，並與上述SalI酶切的質粒pSV1-RecA連接，轉化大腸桿菌DH5α後，塗於含10μg/ml四環素的LB平板上，30℃培養過夜，挑選克隆。以質粒pIRES-EGFP的EGFP表達盒設計引物p75』-atg gtgagc aag ggc gag(1905nt-1923nt)，p85』-gaa cat gtc gag cag gtac(2601nt-2622nt)。以p7和p8為引物，PCR鑑定陽性克隆，鑑定正確的質粒命名為pSV1-AEB(圖4)。
RecA依賴的共整和體的形成取5μl質粒pSV1-AEB電轉化200μl含HSV-BAC DNA的大腸桿菌DH10B感受態細胞，鋪在含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB平板上，30℃培養過夜。用無菌牙籤隨機挑取8～10個菌落至1ml LB中漂洗，分別取100μl漂洗液再次接種在兩個含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB平板上，分別於43℃和30℃過夜培養。對照30℃培養的平板上，長滿菌層，而43℃培養的平板上，只有少數菌落，周圍有散在的衛星菌落，挑選20個這種菌落，在含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB平板上劃線，43℃培養過夜，使質粒pSV1-AEB的DNA和BAC-V1 DNA通過A、B臂在HSV-1的rr基因處同源重組形成共整和體菌落。隨機挑取10個菌落接種於5ml含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB培養液中，43℃振蕩培養過夜，提取BAC DNA，以p7、p8為引物進行PCR鑑定。這個共整合體含有pSV1-AEB的四環素抗性基因(Tet+)和BAC-V1的氯黴素抗性基因(Ch1+)，因此是雙抗性的。那些僅帶有單抗性的未轉化克隆在雙抗性的平板上不會生長。由於pSV1-AEB使用的是溫敏型啟動子，43℃培養會使那些單獨存在的pSV1-AEB無法複製，並進一步丟失。只有那些形成共整合體，既能夠利用BAC DNA上的普通複製起始子又同時具有雙抗性的菌落才能在這種條件下生長。
rr基因失活重組質粒pHSV1-Δrr的獲得將上述PCR鑑定的由pSV1-AEB和BAC-V1 DNA形成的共整和體菌液在含氯黴素(12.5mg/L)的LB平板中劃線，43℃培養過夜，誘導同源重組的發生和共整和體的解離，在這一過程中，細菌會丟失溫敏性質粒pSV1，同時也失去四環素抗性基因，由於失去了四環素的壓力作用，共整合體解離，而43℃培養又使溫敏的pSV1骨架無法複製，逐漸丟失。從平板中挑選8-16個單克隆，在鐮孢菌酸(3mg/L)+氯黴素(1.25mg/L)TB平板上劃線，37℃培養2～3天。設兩組對照，一個在含氯黴素(12.5mg/L)和四環素(10mg/L)的LB平板劃線，另一個在12.5μg/ml氯黴素的LB平板上劃線；四環素+氯黴素平板上的克隆應該不生長，鐮孢菌酸+氯黴素平板中的菌落數應少於氯黴素平板。在鐮孢菌酸+氯黴素平板中生長的這些菌落就是重組菌落。在這一過程中，只有那些確實發生了共整合體解離並丟失了pSV1骨架的菌落被篩選出來。挑取10個菌落接種於5ml含12.5mg/L氯黴素的LB培養基中，37℃振蕩培養過夜；提取BAC DNA，分別以p1、p4為引物測序，進行序列分析(圖5)。鑑定正確的質粒命名為pHSV1-Δrr(核糖核苷還原酶大亞基基因620-1717nt共1097bp缺失，其中插入了IRES-EGFP表達盒)。
重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的構建中間載體I pFL的構建從含有lacZ表達盒的載體pSV-β-Galactosidase上用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因lacZ中還含有一個EcoRI位點)並回收完整的帶SV40啟動子的lacZ表達盒(4160bp)，插入到同樣用BamHI/EcoRI雙酶切的轉座載體pFastBac1(多克隆位點中含有EcoRI和BamHI位點)中。取質粒DNA1-5μl加入到50μl的大腸桿菌TG1感受態細胞中進行熱休克轉化，轉化時提前1h將Xgal塗在含Amp的LB平皿上，37℃過夜培養，根據藍色菌落挑選出轉座載體pFL，以NotI、EcoRI、BamHI/HindIII酶切pFL來鑑定陽性克隆(圖6)。NotI酶切使pFL線性化，產生8.9Kb片段；lacZ含有兩個EcoRI位點，以EcoRI酶切釋放3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切產生4.1Kb和4.7Kb兩個片段。
說明中間載體I構建成功。
中間載體IIpBL的構建從含有lacZ表達盒的中間載體I pFL上用BamHI/XhoI雙酶切，並回收完整的帶SV40啟動子的lacZ表達盒，插入到同樣用BamHI/XhoI雙酶切的質粒載體pBluescript-M13中，構建中間載體II pBL。取質粒DNA1-5μl加入到50μl的大腸桿菌TG1感受態細胞中進行熱休克轉化，轉化時提前1h將Xgal塗在含Amp的LB平皿上，37℃過夜培養，根據藍色菌落挑選出轉座載體，以BamHI、NotI、BamHI/HindIII酶切pBL來鑑定(圖7)。BamHI酶切使pBL線性化，產生約7.1Kb片段；Not1酶切產生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切後得到3.3Kb和3.7Kb的片段。說明中間載體II構建成功。
轉移載體pIL的構建用Not1酶切p4789以除去icp34.5基因從第262個密碼子到終止密碼子1084bp的長823bp序列，但保留其左右側翼序列650bp和1500bp；pBL同時也用NotI酶切，並回收完整的帶SV40啟動子的lacZ表達盒，將lacZ表達盒連接到用Not1酶切的p4789中，構建轉移載體pIL。取質粒DNA1-5μl加入到50μl的大腸桿菌TG1感受態細胞中進行熱休克轉化，轉化時提前1h將Xgal塗在含Amp的LB平皿上，37℃過夜培養，根據藍色菌落挑選出轉座載體，用PstI、XbaI、NotI酶切鑑定(圖8)。PstI酶切pIL得到9.4Kb；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb兩個片段；NotI酶切產生4.1Kb和5.3Kb兩個片段。說明轉移載體構建成功。
重組病毒的獲得轉移載體pIL與含有完整HSV-1基因組但rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr共轉染BHK21細胞取兩個預先加入200μL 1640培養基(未加血清)的EP管，一個加20μg pIL和20μg pHSV1-Δrr DNA，混勻；另一個加8μL Lipofectin轉染試劑，混勻。將兩管合併混勻，靜置45min，使Lipofectin包裹DNA。臨用前補加無血清培養液1640，以使轉染混合液能均勻覆蓋細胞層。取70-80％豐度的單層BHK21細胞1瓶，棄培養液。用未加血清的培養液清洗瓶壁數次，然後加轉染混合液。37℃溫育6h後棄轉染混合液，換常規1640培養基，37℃培養。由於轉移載體pIL上插入了lacZ表達盒，icp34.5基因失活，但保留有icp34.5基因的左右側翼序列，它們與pHSV1-Δrr的icp34.5基因左右側翼序列同源；經過同源重組，獲得icp34.5基因被lacZ表達盒插入失活、核糖核苷還原酶基因被EGFP基因插入失活的重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δrr-34.5/lac；用病毒上清0.2ml感染含Xgal軟瓊脂培養基的BHK21細胞，37℃培養36-42小時，挑出藍斑(圖9)，進行有限稀釋，再用0.2ml接種細胞，進一步進行空斑純化。
實施例2重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的鑑定供試病毒為實施例1構建的重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac以及由Rayfield M等公開的HSV-1 F株(Rayfield M.，Michaels G.S.，Feldmann R.，Muzyczka N.1985.Comparisonof the DNA sequence and secondary structure of the herpes simplex virus L/Sjurction and the adeno-associated virus terminal repeat.J Theor Biol.115477-494.)。icp34.5基因引物由上海生工(SANGON)公司合成。非洲綠猴腎Vero細胞系購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC029)。本實施例實驗條件和方法，參考了下列資料「分子克隆實驗指南」(第二版)；「細胞實驗指南」。
正向引物5』-CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC-3』反向引物5』-CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC-3』用PCR技術擴增icp34.5基因進行鑑定。反應體系10×buffer 5μL，dNTP(2.5mM)5μL，正向引物(10pmol/ul)2.5μL，反向引物(10pmol/ul)2.5μL，HSV DNA 5μL，MgCl2(25mM)5μL，ddH2O 25μL，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5μL。擴增條件94℃，90秒；56℃，90秒；72℃，120秒；循環35次。預變性5分鐘(94℃)，終延伸10分鐘(72℃)。結果證明重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac缺失了野生病毒wtHSV中的icp34.5基因(圖10)。
用DMEM培養液在35mm培養板上培養Vero細胞，待Vero細胞長成單層後，棄去DMEM培養液，用PBS洗細胞表面，接種該重組病毒0.2ml，37℃吸附1-2小時，棄去上清，加入2％小牛血清的培養基，37℃培養5天，在倒置螢光顯微鏡下觀察，出現了發綠色螢光的細胞(圖11)。結果證明重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac成功地插入了EGFP基因。
實施例3重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的擴增供試病毒為實施例1構建的重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac。非洲綠猴腎Vero細胞系購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC029)。本實施例實驗條件和方法，參考了下列資料「細胞實驗指南」。
用DMEM培養液在35mm培養板上培養Vero細胞，待Vero細胞長成單層後，棄去DMEM培養液，用PBS洗細胞表面，接種該重組病毒0.2ml，37℃吸附1-2小時，棄去上清，同時設一瓶不加病毒的細胞作對照；加入2％小牛血清的培養基，37℃培養；80％的細胞出現病變後，反覆凍融三次，收穫病毒；在4℃以8000rpm離心30分鐘，收集上清，置於4℃短期保存；若需要長期保存，則加入10％甘油，置於-80℃。
實施例4重組單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac的安全性供試病毒為實施例1構建的重組病毒，以及由Rayfield M等公開的HSV-1 F株(Rayfield M.，Michaels G.S.，Feldmann R.，Muzyczka N.1985.Comparison of the DNAsequence and secondary structure of the herpes simplex virus L/S junction andthe adeno-associated virus terminal repeat.J Theor Biol.115477-494.)。人神經膠質瘤U251細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC093)。人羊膜wish細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC040)。抗皰疹藥物阿昔洛韋(ACV)購自藥店。本實施例實驗條件和方法，參考了下列資料「分子克隆實驗指南」(第二版)；「細胞實驗指南」。
選擇對單純皰疹病毒敏感的昆明種小鼠作受試對象，比較了rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV的半數致死劑量(LD50)。實驗第21天的死亡情況及兩種病毒的LD50見表1。結果表明icp34.5基因的缺失大大地降低了HSV的毒性，rHSVΔrr-34.5/lac的LD50為wtHSV的10萬倍，即毒力降低10萬倍，說明rHSVΔrr-34.5/lac有較好的安全性。
抗皰疹藥物阿昔洛韋(ACV)是毒性極低的藥物前體，HSV tK基因表達產物TK(胸苷激酶)使ACV磷酸化並激活成為細胞毒性藥物而殺死細胞。雖然缺失icp34.5基因和核糖核苷還原酶基因，但HSV的tK基因完整，能有效表達TK酶蛋白，以活化抗皰疹藥物ACV，發揮殺細胞作用；由於rHSVΔrr-34.5/lac感染複製是靶向性的，所以正常細胞中沒有rHSVΔrr-34.5/lac增殖，即沒有tk基因的表達，ACV不會被激活，所以正常細胞既不會由於rHSVΔrr-34.5/lac殺死，也不會被活化的ACV毒殺；而對容許rHSVΔrr-34.5/lac增殖的惡性腫瘤細胞來說，不僅會因rHSVΔrr-34.5/lac增殖而被有效裂解殺死，而且由於rHSVΔrr-34.5/lac有效增殖而使tk基因有效表達，產生TK酶蛋白，激活ACV前體成細胞毒性藥物，與rHSVΔrr-34.5/lac增殖裂解殺癌細胞協同，殺死癌細胞。所以，當用ACV後，只要有rHSVΔrr-34.5/lac基因表達，ACV便被激活，rHSVΔrr-34.5/lac感染的細胞便被殺死，rHSVΔrr-34.5/lac也就失去了增殖的條件，導致rHSVΔrr-34.5/lac被機體的正常免疫系統清除，毒性消除；若沒有應用ACV，rHSVΔrr-34.5/lac便會無限制地增殖並裂解腫瘤細胞，同時釋放子代rHSVΔrr-34.5/lac，子代rHSVΔrr-34.5/lac再感染、裂解新的腫瘤細胞，如此循環，以至所有腫瘤細胞徹底消滅；所有腫瘤細胞徹底消滅了，子代rHSVΔrr-34.5/lac也就失去了繁衍下一代rHSVΔrr-34.5/lac的場所，也就被機體的免疫系統作為異物排斥和吞噬細胞清除。
實驗證明用對rHSVΔrr-34.5/lac敏感的神經膠質瘤U251細胞接種重組型和野生型病毒，換用含不同濃度(0、0.5、0.7、1.0、1.5ug/ml)ACV的培養基培養。計算兩種病毒對ACV的半耐受濃度EC50，比較其敏感性，結果表明rHSVΔrr-34.5/lac和wtHSV一樣，對抗皰疹藥物ACV敏感(見圖12)。所以在用rHSVΔrr-34.5/lac治療腫瘤的過程中，可用阿昔洛韋(ACV)對萬一出現的重組病毒的副作用進行有效控制。
表1.wtHSV和rHSVΔrr-34.5/lac半數致死劑量(LD50)

注ND為沒有進行實驗實施例5重組單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac對人神經膠質瘤、人膀胱癌、人肝癌、人喉癌的殺瘤測定供試病毒為實施例1構建的重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac以及由Rayfield M等公開的HSV-1 F株(Rayfield M.，Michaels G.S.，Feldmann R.，Muzyczka N.1985.Comparison ofthe DNA sequence and secondary structure of the herpes simplex virus L/S junctionand the adeno-associated virus terminal repeat.J Theor Biol.115477-494.)。人神經膠質瘤U251細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC093)。人膀胱癌EJ細胞細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC120)。人肝癌Hep3B細胞細胞細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC070)。人喉癌Hep2細胞細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC004)。人羊膜wish細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC040)。本實施例實驗條件和方法，參考了下列資料「分子克隆實驗指南」(第二版)；「細胞實驗指南」。
以人神經膠質瘤U251細胞為腫瘤細胞的代表，以正常羊膜wish細胞為對照，比較重組單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac在腫瘤細胞和正常細胞中的複製效率，結果見圖13。可以看出rHSVΔrr-34.5/lac選擇性地在人神經膠質瘤U251細胞中複製；而對正常細胞基本上不複製，表明病毒感染正常細胞後誘發其凋亡，病毒不能複製，隨後自然降解。
用MTT法定量測定重組單純皰疹病毒對人神經膠質瘤U251細胞、人膀胱癌EJ細胞、人肝癌Hep3B細胞、人喉癌Hep2細胞的殺傷效率。結果見圖14。試驗結果表明，U251、EJ、Hep3B、Hep2五種人腫瘤細胞對rHSVΔrr-34.5/lac敏感，但這些敏感細胞的增值動力曲線各異。在這些敏感細胞中，Hep3B細胞對rHSVΔrr-34.5/lac感染反應最為迅速，U251和Hep2細胞次之，EJ細胞也比較敏感，正常人羊膜wish細胞對rHSVΔrr-34.5/lac感染不敏感，感染後基本無細胞病變，亦無細胞死亡。本實驗結果引申出一個重要結論任何藥物都不是萬能的，預計本重組病毒適用於肝癌和腦癌的治療，對一些癌症如肺部癌症可能無效。
實施例6荷人肝癌Hep-3B裸鼠模型的建立人肝癌Hep-3B細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC，武漢，細胞號GDC070)，並經體外培養實驗證明rHSVΔrr-34.5/lac能在Hep-3B細胞上複製增殖，產生細胞病變效應(CPE)；用MTT技術證實了rHSVΔrr-34.5/lac對Hep-3B細胞的毒殺作用。本實施例實驗條件和方法，參考了下列資料「細胞實驗指南」。
實驗裸鼠由湖北省實驗動物研究中心提供並負責全程管理和飼養。
大量培養Hep-3B細胞，待細胞形成緻密單層時，消化收集細胞在無菌離心管中，1000rpm，離心5min；收集細胞沉澱，加入10ml新鮮MEM培養基重懸細胞沉澱；取100μl細胞懸液稀釋，混勻後滴加在細胞計數板上計數細胞；1000rpm，5min，離心沉澱細胞；加入新鮮MEM培養基重懸細胞沉澱，使終劑量為5×108cells/ml。
將1ml Hep-3B細胞濃縮液用無菌注射器注射到5隻裸鼠的腋下(0.2ml/只)，一星期後，裸鼠注射部位長出綠豆大小瘤狀突起；30天後，瘤狀突起物增大；處死荷瘤裸鼠，切下瘤狀物，並用解剖刀完全切碎，然後用套筒針管將切碎的瘤狀物全部等量移植到另外的5隻健康裸鼠腋下。30天後，移植的裸鼠腋下均出現直徑約0.8cm的瘤狀物；處死其中1隻移植裸鼠，取瘤狀物作病理檢查和作原代細胞培養，證實瘤狀物為Hep-3B腫瘤塊。另4隻實驗裸鼠20天後，待移植腫瘤生長至直徑3.5cm左右；處死之，切下腫瘤，並搗碎成米粒大小，用套筒針管第二次移植至180隻裸鼠腋下；15天後，80％的移植裸鼠出現移植腫瘤，直徑在0.5cm-1.5cm之間(圖15)；選取125隻作rHSVΔrr-34.5/lac治療實驗。
實施例7重組單純皰疹病毒rHSVΔrr-34.5/lac作為抗腫瘤藥物在治療或預防荷人肝癌Hep-3B裸鼠中的應用供試病毒為實施例1構建的重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac，供試裸鼠為實施例6建立的荷人肝癌Hep-3b裸鼠模型。TRIzol試劑購自Invitrogen公司。PCR引物在基康生物公司合成，擴增單純皰疹病毒DNA多聚酶基因Pol(215bp)的正向引物為GCT CGA GTGCGA AAA AAC GTT C，反向引物為CGG GGC GCT CGG CTA AC；擴增單純皰疹病毒tk基因(335bp)的正向引物為GAC CAG CGC CCA GAT AAC AA，反向引物為CCA GCA TAG CCAGGT CAA GC。PCR反應體系95℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 30sec共30個循環進行擴增。血液學指標用日本東亞醫用電子公司生產的F-820型血球計數儀測定；血液生化指標用德國產Eppendorf FG124型半自動生化分析儀測定，試劑盒由北京中生生物製品有限公司提供。本實施例中的實驗條件和方法參考了下列資料「分子克隆實驗指南」(第二版)；「細胞實驗指南」；「抗體技術實驗指南」。
將選取的125隻裸鼠按腫瘤大小分組，保證每組裸鼠的平均腫瘤大小基本一致，一共分為5個組rHSVΔrr-34.5/lac高劑量(5×106pfu/mL)治療組，rHSVΔrr-34.5/lac中劑量(5×105pfu/mL)治療組，rHSVΔrr-34.5/lac低劑量(5×104pfu/mL)治療組，未治療對照組(注射不含rHSVΔrr-34.5/lac的Vero細胞懸液)，化療藥物阿黴素ADM對照組(3.333mg ADM/ml)。分組後當天，按上述分組施以不同的處理；瘤內注射0.1ml/次/鼠試劑，病毒組每周注射一次，共3次，ADM對照組每間隔三周作一次注射。
治療期間，觀察受試動物生活狀態，記錄裸鼠死亡數，隔天測量裸鼠腫瘤大小及體重，繪製裸鼠腫瘤體積/時間變化曲線。在第三次瘤內注射治療後一個星期開始分三批(每周一批)處死裸鼠；眼球取血，做血常規以及血液生化檢查；取全部腫瘤組織、心、肝、脾、肺、腎和大腦，分別測量重量、用RT-PCR技術檢測重組病毒的mRNA和組織病理學檢測等。
部分解剖後的rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠腫瘤與未治療對照組裸鼠腫瘤照相，結果見圖16。結果表明，未治療對照組裸鼠的瘤塊體積大、顏色鮮豔、血管豐富；高劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠的瘤塊體積最小，血管不豐富；低劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠瘤塊體積比未治療對照組要小，且腫瘤塊血管沒有增生。
各組裸鼠的腫瘤大小隨時間變化的趨勢如圖17。結果表明，未治療對照組裸鼠的腫瘤體積隨時間延長而持續大幅增加，且在治療期間呈加速上升趨勢，腫瘤體積由最初的30mm3增大接近20倍至最終的557mm3；rHSVΔrr-34.5/lac各治療組裸鼠的腫瘤體積在治療初期上升幅度較大，但仍遠遠低於未治療對照組的上升幅度，且在治療中、後期，治療裸鼠的腫瘤體積上升幅度明顯減小，最終各rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠腫瘤體積遠遠小於未治療對照組；化療藥物阿黴素對照組裸鼠的腫瘤體積也是一直持續增加，但上升幅度小於未治療對照組，最終治療效果不及高、中劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組，只是略優於低劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組。各組腫瘤大小變化趨勢說明，在治療初期，rHSVΔrr-34.5/lac增殖尚不佔優勢，癌細胞增加數目大於rHSVΔrr-34.5/lac殺死癌細胞數目，所以腫瘤體積仍在增大；隨著rHSVΔrr-34.5/lac在腫瘤細胞中複製直至rHSVΔrr-34.5/lac趨於對數增殖，在治療的中、後期，rHSVΔrr-34.5/lac殺死癌細胞數大於癌細胞自身增殖數，以至腫瘤平均體積迅速減小、乃至消失(圖18)。
rHSVΔrr-34.5/lac對荷人肝癌Hep-3B裸鼠的治療效果見表2。rHSVΔrr-34.5/lac對在體Hep-3B腫瘤有非常顯著的抑制作用；rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠生活狀態正常，高、中、低劑量治療組裸鼠均沒有因rHSVΔrr-34.5/lac副作用引起死亡。未治療對照組因沒有得到治療，有將近30％的裸鼠死於快速生長的腫瘤；而其餘的裸鼠腫瘤體積增長得很大，並且生活狀態極差。化療藥物對照組裸鼠經ADM治療後腫瘤體積和重量有所減少，但是有明顯的副作用，裸鼠生活狀態不好，死亡率達15％。rHSVΔrr-34.5/lac顯示了極好的抗癌效果和安全性。
表2.rHSVΔrr-34.5/lac對荷Hep-3B裸鼠治療效果一覽表

用RT-PCR技術鑑定rHSVΔrr-34.5/lac在組織內的分布。迅速解剖各組實驗裸鼠，收集腫瘤、心、肝、脾、肺、腎和大腦等組織，立刻將其置於-20℃保存。取材結束後，立即分別用TRIzol提取腫瘤和各臟器細胞的總RNA。分別以單純皰疹病毒多聚酶基因(215bp)和tk基因(335bp)引物對提取的裸鼠各組織總RNA進行RT-PCR。結果見圖19、20。實驗結果顯示，rHSVΔrr-34.5/lac基因轉錄僅見之於治療組裸鼠的腫瘤組織中，而兩個對照(未治療對照組和ADM對照組)裸鼠腫瘤組織和所有實驗動物的心、肝、脾、肺、腎和腦組織都沒有擴增出相應該基因序列條帶，從而證明了rHSVΔrr-34.5/lac只在治療組裸鼠的腫瘤組織中複製。這就說明了rHSVΔrr-34.5/lac不感染實驗動物正常組織和細胞，即對實驗動物正常組織無害，rHSVΔrr-34.5/lac具有極好的靶向性抗癌效果。
試驗在中期和結束時分別對受試動物進行了血液學和血液生化學指標檢測分析。血液學分析共有白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白劑量(MCHC)、血小板計數(PLT)、紅細胞體積分布寬度變異數(RDW-CV)、血小板體積分布寬度(PDW)、血小板平均體積(MPV)等11項指標；血液生化分析共有尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、三酸甘油脂(TRI)、膽固醇(CHO)、總蛋白(TP)、谷丙轉氨酶(GOT)、穀草轉氨酶(GPT)、肌酐(CRE)、鹼性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBI)等10項指標。計算了各試驗組裸鼠的血液學和血液生化檢測均值和標準差，並進行了顯著性檢驗(見表3、4)。
結果(表3)表明rHSVΔrr-34.5/lac各治療組與未治療對照組比較，11項血液學指標均無顯著性差異(P＞0.05)；而ADM藥物對照組與未治療對照組比較，白細胞計數(WBC)顯著減少(P＜0.05)，此外，其它10項血液學指標均無顯著性差異(P＞0.05)。
結果(表4)表明rHSVΔrr-34.5/lac各治療組與未治療對照組比較，10項生化指標均無顯著性差異(P＞0.05)。從而可以得出結論rHSVΔrr-34.5/lac對受試動物的肝功能、腎功能、酶類、以及血脂等項目均無不良影響；而化療藥物阿黴素對照組與未治療對照組比較，總膽蛋白(TBI)指標比未治療對照組指標顯著增高(P＜0.05)，表明對肝功能有毒副作用，而rHSVΔrr-34.5/lac治療不產生毒副作用。
表3.血液學指標檢測結果

表4.血液生化指標檢測結果

系統臨床病檢在實驗裸鼠處死後立即進行。先觀察各組實驗裸鼠的胸腔、腹腔、顱腔及各臟器的位置、形狀、大小、質地、色澤等情況，均未發現異常；再對心、肝、脾、肺、腎、腦等器官和腫瘤稱重並計算臟器和腫瘤係數，對各給藥組與未治療對照組間進行顯著性檢驗(t檢驗)，結果見表5。研究結果表明，rHSVΔrr-34.5/lac各治療組與未治療對照組比較，各臟器重量及臟器係數均無顯著性差異(P＞0.05)，定量的說明了rHSVΔrr-34.5/lac對治療裸鼠各正常臟器無任何影響和副作用；而rHSVΔrr-34.5/lac各治療組與未治療對照組比較，腫瘤顯著縮小，rHSVΔrr-34.5/lac各治療組與未治療對照組之間腫瘤重量和腫瘤係數均有顯著性差異(P＜0.05)，其中高、中劑量rHSVΔrr-34.5/lac治療組之間有極顯著性差異(P＜0.01)，反映了rHSVΔrr-34.5/lac對荷Hep-3B裸鼠腫瘤存在極有效的抑制作用。
表5.系統臨床病檢結果

對實驗各組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦進行病理切片檢查，結果見圖21、22。結果表明rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠與未治療對照組裸鼠的各臟器均正常，說明rHSVΔrr-34.5/lac不影響受試裸鼠的正常組織。
對實驗組裸鼠的腦和腫瘤組織進行電鏡觀察，結果見圖23。結果表明在rHSVΔrr-34.5/lac治療組裸鼠的腦組織中檢測不到rHSVΔrr-34.5/lac，而在腫瘤組織中清晰可見rHSVΔrr-34.5/lac顆粒。
權利要求
1.一種重組1型單純皰疹病毒，其特徵在於重組1型單純皰疹病毒(SimplexvirusHerps simplexvirus 1)rHSVΔrr-34.5/lac，CCTCC-V200601。
2.一種用於實現權利要求1所述的重組1型單純皰疹病毒的製備方法，包括下列步驟A.重組質粒pHSV1-Δrr的構建首先是重組質粒pAEB的構建，細菌人工染色體BAC-V1整合了HSV-1的全基因組，只在非必須基因UL41處插入了BAC的各個元件，以HSV-1的細菌人工染色體BAC-V1 DNA為模板用PCR分別擴增HSV-1的核糖核苷還原酶大亞基基因3410bp的長480bp的A片段，位於140-620nt，和長388bp的B片段，位於1717-2105nt，A的上下遊引物中含EcoRI酶切位點，B的上下遊引物中含XhoI酶切位點，回收PCR產物，分別以EcoRI和XhoI單酶切，並克隆到質粒pIRES-EGFP的同樣酶切位點，pIRES-EGFP的IRES上遊362bp含有一個BcoRI酶切位點，EGFP下遊288bp含有一個XhoI酶切位點，得到重組質粒pAEB，其中A，B片段作為同源重組的兩個臂使用；其次是穿梭質粒pSV1-AEB的構建，質粒pSV1-RecA的RecA基因上遊含有一個SalI酶切位點，重組質粒pAEB的A片段上遊7bp含有一個SalI酶切位點，B片段下遊65bp含有一個SalI酶切位點，用SalI酶切質粒pSV1-RecA 4小時後，牛腸去磷酸化酶處理0.5小時，純化回收，同時用SalI酶切質粒pAEB，切下含有A-IRES-EGFP-B的3500bp的片段，純化回收，並與SalI酶切的線型質粒pSV1-RecA連接構建質粒pSV1-AEB；第三是RecA依賴的共整和體的形成，將質粒pSV1-AEB電轉化含HSV-1細菌人工染色體BAC-V1DNA的大腸桿菌DH10B，鋪在含氯黴素12.5mg/L和四環素10mg/L的LB平板上，30℃培養過夜，用無菌牙籤隨機挑取菌落至LB中漂洗，漂洗液再次接種在含氯黴素12.5mg/L和四環素10mg/L的LB平板上，在43℃過夜培養，使質粒pSV1-AEB的DNA和BAC-V1 DNA通過A、B臂在HSV-1的rr基因處同源重組形成共整和體菌落；第四是rr基因失活重組質粒pHSV1-Δrr的獲得，將上述由pSV1-AEB和BAC-V1DNA的共整和體菌落在含氯黴素12.5mg/L的LB平板中劃線，43℃培養過夜，誘導同源重組的發生和共整和體的解離，接著用四環素的反篩選劑鐮胞菌酸篩選重組菌落，得到含HSV-1基因組的rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr；B.重組病毒rHSVΔrr-34.5/lac的構建首先是β-半乳糖苷酶表達盒的獲得與純化，猴病毒SV40啟動子控制著載體pSV-β-Galactosidase上的lacZ基因的表達，pSV-β-Galactosidase的lacZ基因3′端含有1個PolyA序列，位於4021bp-4156bp，SV40啟動子上遊6814bp處和lacZ編碼序列的近3′末端3701bp處各含有1個EcoRI位點，lacZ表達盒下遊4151bp處則含有1個BamHI位點，用BamHI和EcoRI雙酶消化，DE81膜回收片段，獲得LacZ表達盒4160bp；其次是中間載體I pFL的構建，載體pFastBacl多克隆位點中含有EcoRI和BamHI位點，用EcoRI/BamHI雙酶切消化，與EcoRI和BamHI雙酶消化的lacZ表達盒連接，構建中間載體I pFL，中間載體I pFL的lacZ表達盒上遊具有載體自身的1個Not1位點；第三是中間載體II pBL的構建，BamHI/XhoI雙酶切中間載體I pFL以切下lacZ表達盒，同時以BamHI/XhoI雙酶切質粒pBluescript-M13成線型DNA，將lacZ表達盒與線型pBluescript-M13連接，構建成中間載體II pBL，使lacZ表達盒下遊也獲得載體本身的1個NotI位點，lacZ表達盒上下遊均帶有NotI位點；第四是轉移載體pIL的構建，質粒p4789帶有完整的HSV-1的icp34.5基因及其側翼序列，用NotI酶切質粒p4789，以切去icp34.5基因262bp到終止子1084bp的長823bp序列，同時再以NotI酶切中間載體II pBL，獲得lacZ表達盒，並連接到經NotI酶切的質粒p4789上，構建轉移載體pIL，該轉移載體pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp並被lacZ表達盒插入雙重滅活；第五是重組病毒的獲得，轉移載體pIL與步驟A中得到的rr基因失活的重組質粒pHSV1-Δrr共轉染敘利亞倉鼠腎細胞系BHK21，經過同源重組，獲得icp34.5基因被lacZ表達盒插入失活、核糖核苷還原酶基因rr被EGFP基因插入失活的重組1型單純皰疹病毒rHSV-1Δrr-34.5/lac，用病毒上清感染含Xgal軟瓊脂培養基的BHK21細胞，挑出藍斑，進行稀釋，再接種BHK21細胞，進行空斑純化。
3.重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防腫瘤中的應用。
4.重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防人肝癌腫瘤中的應用。
5.重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防人膀胱癌細胞的應用。
6.重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防入神經膠質瘤細胞中的應用。
7.重組1型單純皰疹病毒作為抗腫瘤藥物在治療或預防人喉癌細胞中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種重組1型單純皰疹病毒及製備方法，重組1型單純皰疹病毒為rHSVΔrr－34.5/lac，CCTCC－V200601。步驟是重組質粒pAEB構建，穿梭質粒pSV1－AEB構建，RecA依賴的共整和體的形成，同源重組產生rr基因失活的重組質粒pHSV1－Δrr；β－半乳糖苷酶表達盒的獲得與純化，中間載體I pFL構建，中間載體II pBL構建，轉移載體pIL構建，重組1型單純皰疹病毒rHSVΔrr－34.5/lac的獲得。本發明中凋亡抑制基因icp34.5也是神經毒基因被報導基因lacZ插入失活，核糖核苷還原酶基因rr被EGFP插入失活，重組1型單純皰疹病毒僅在腫瘤細胞中複製，同時作為抗腫瘤藥物在治療或預防腫瘤中的應用，對正常細胞安全，具有很好的靶向性和選擇性。
文檔編號C12N15/861GK1844376SQ200610018400
公開日2006年10月11日 申請日期2006年2月23日 優先權日2006年2月23日
發明者齊義鵬, 祝華斌, 董長垣, 肖庚富, 蘭萍, 薛峰, 蘇越, 胡寶利, 肖巍 申請人:武漢大學