單一單元抗體純化的製作方法
2023-05-18 04:41:06 1
專利名稱：單一單元抗體純化的製作方法
單一單元抗體純化本發明涉及單一單元純化抗體的方法以及可以用在該方法中的裝置。用於醫藥應用的由細胞培養物生產的單克隆抗體的純化是包含大量步驟的過程。這種抗體必然要擺脫所有潛在有害的汙染物，諸如源自生產這些抗體的細胞的蛋白質和DNA、例如胰島素的培養基組分、PEG醚類和消泡劑以及任何可能的感染試劑如病毒和朊病毒(prion)o從生產這些蛋白質的細胞的培養物中純化抗體的典型過程在BioPharmInternational Jun 1,2005, Downstream Processing of Monoclonal Antibodies fromHigh Dilution to High Purity 中有所描述。因為抗體由諸如為雜交瘤細胞或轉化宿主細胞(如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小鼠骨髓瘤衍生的NSO細胞、幼年倉鼠腎(BHK)細胞、人類視網膜衍生的PER. C6 細胞)的細胞生產，所以必須從細胞漿液中優選在純化過程初期去除顆粒狀細胞材料。該過程的這 個部分在本文中被稱為「澄清」。隨後或者作為澄清步驟的一部分，抗體被粗略純化至至少約80%，通常是通過「結合加洗脫」色譜步驟(在IgG的情況下通常使用固定的蛋白質A)。這個在本文中被稱為「捕集「的步驟不僅導致抗體的初期大幅純化，還可以導致體積大幅下降，因而產品濃縮。用於捕集的其他替代方法例如為膨脹床吸附(EBA)、2_相液體分離(利用例如聚乙二醇)或採用易溶鹽(lyotropic salt,諸如硫酸銨)的分級沉澱。澄清和捕集之後，對抗體進行進一步純化。通常，為了充分地去除殘餘雜質，在捕集之後的至少兩個色譜步驟是必需的。捕集之後的色譜步驟通常被稱為中間純化步驟，而最終的色譜步驟通常被稱為精提純(polishing)步驟。這些步驟中的每一個通常以間歇模式作為單一單元操作進行，並且這些步驟中的至少一個以「結合加洗脫」模式進行。此外，每一個色譜步驟都需要特定的負載條件，例如pH、傳導性等等。因此，為了將負載調節至所需要的條件，在每個色譜步驟之前必須進行額外的處理。上述所有這些使得該過程是耗時耗力的。在這些步驟中通常被大體去除的雜質都是過程衍生汙染物，諸如宿主細胞蛋白質、宿主細胞核酸、培養基組分(如果存在)、蛋白質A(如果存在)、內毒素(如果存在)和微生物(如果存在)。現有技術中已經描述了許多這樣純化抗體的方法。-W02007/076032描述了純化抗體(CTLA4_Ig及其變體)的方法，該方法中，親合色譜之後獲得的細胞培養物上層清液或其部分進行陰離子交換色譜以獲得經洗脫的蛋白質產物，並且使經洗脫的蛋白質產物進行疏水作用色譜以獲得富集的蛋白質產物。在這個方法中，經洗脫的蛋白質產物通過如下方法得到，該方法中，抗體首先被陰離子交換色譜材料捕獲，隨後採用洗滌緩衝液洗滌交換色譜材料，此後通過改變工藝條件(例如採用洗脫緩衝液洗脫)從中洗脫抗體。-US2008/016450涉及一種通過如下純化含Fe蛋白質(諸如抗體)的方法使該蛋白質結合到蛋白質A柱上，並且採用pH梯度洗脫體系洗脫。該文獻描述了以流過模式應用疏水作用色譜和陰離子交換色譜的願望(第0058段至0064段)。-W02008/025747涉及在如下工藝中純化Fe-融合蛋白質，所述工藝包括蛋白質A或G色譜、陽離子交換色譜、陰離子交換色譜和羥基磷灰石色譜，特別是以這個順序使用。在這個工藝中，陰離子交換色譜和羥基磷灰石色譜以流過模式應用。-US2007/0167612關注蛋白質(諸如抗體)的純化，其首先被捕集到親合柱，如蛋白質A柱。來自親合柱的洗脫物隨後與陰離子交換材料接觸，從而抗體結合到其上，隨後被洗脫。為了進一步純化，可以使用額外的色譜柱和純化步驟，包括額外的陽離子-交換色譜、陰離子-交換色譜、尺寸排斥色譜、親合色譜、羥基磷灰石色譜和疏水作用色譜。-W02001 /072769描述了高度陰離子化的蛋白質例如硫酸化的蛋白質的純化。為了這個目的，隨後使用「結合-洗脫」模式的陰離子交換色譜和疏水作用色譜。-W02009/058769涉及從抗體製劑中去除雜質的方法。具體的，該專利申請涉及純化抗體(含有疏水變體)的方法。為了這個目的，樣品被加載在蛋白質A柱上；採用適當的洗脫液從蛋白質A柱上洗脫，加載在陽離子和/或陰離子交換柱上；從這個離子交換柱上洗脫，加載在疏水作用色譜(HIC)柱上，其中HIC柱為流過模式；此後收集經純化的材料。需 注意，僅HIC柱以流過模式應用。-EP1614694關注免疫球蛋白的純化和分離。具體地，其關注以按順序的蛋白質A柱、陰離子交換柱和陽離子交換柱步驟以及可選的疏水作用柱步驟從細胞培養物中純化抗體。這些步驟中，陰離子交換色譜步驟以流過模式操作，而其他所有步驟以「結合-洗脫」模式操作。-W02008/051448涉及減少利用蛋白質A親合色譜法純化的抗體製劑中的蛋白質A。業已暗示這種蛋白質汙染可以利用電荷修飾的深層過濾器去除。這個去除步驟可以在常規用於抗體製劑的純化步驟之前或之後進行。-EP0530447描述了通過組合陰離子、陽離子和疏水作用色譜和特定的殺菌步驟的抗體純化。色譜步驟的順序可以變化。每個色譜步驟都是以「結合-洗脫」模式操作的。-Kuczewski,M.等人(2009) [Biotechn. Bioengn. 105, 296-305] 描述了使用疏水作用膜吸收器用於抗體的精提純。-Chen，J 等人(2008) [J. Chrom. A 1177，272—281] 比較了抗體純化中的常規的和新一代的疏水作用色譜樹脂(如混合模式)。-Zhou, J. X.等人(2006) [J. Chrom. A 113466-73].描述了使用疏水作用膜吸收器作為疏水作用柱色譜的替代方案。-Gottschalk,U. (2008) [Biotechnol. Prog. 24,496-503].討論了在抗體純化中柱色譜與膜吸收器的使用相比的不足。-Wang, C.等人(2007) [J. Chrom. A 1155,74-84].在流過工藝中使用裝核的陰離子交換色譜用於從抗體材料中去除痕量汙染物(精提純)。與未經裝核的陰離子材料相比。-Azevedo, A.等人(2008 年)[J. Chrom. A. 1213，154-161].組合水性兩相提取、疏水作用色譜和尺寸排斥色譜進行抗體純化的集成工藝。-Boi，C. (2007) [J. Chrom. B. 848，19-27].這篇綜述認為使用膜吸收器作為用於單克隆抗體的純化的捕集和精提純步驟的替代技術。上述方法的缺點在於操作時間長、可變成本高(例如由於結合-洗脫步驟本身所必然需要的高柱容量，因此需要大量昂貴的樹脂)和固定成本高(由於勞動力成本)。根據本發明，可以通過使用串聯的順次連接(in-line)的陰離子交換色譜(AEX)和疏水作用色譜(HIC) 二者以流過模式、優選以一個單個單元操作方式操作來實現從細胞培養物生產的抗體中非常有效地去除殘餘雜質。在AEX之後和HIC之前可以在線混合(in-line mixing)易溶鹽以調節用於疏水作用色譜的恰當條件。這個方法使用分離的、串聯連接的、順次連接的AEX和HIC裝置(二者均以流過模式使用)所帶來的優點是相當大程度地降低了操作時間以及勞動和操作成本。此外，需要較小的(因而成本較低的)色譜單元，這是因為所有單元以流過模式操作，從而僅需要足夠的結合雜質而非結合產物的能力。因此，本發明可被定義為一種從生物反應器中生產的細胞漿液(cell broth)中純化抗體的方法，該方法至少包含中間純化步驟和精提純步驟，其中新穎的純化步驟包括串聯的、順次連接的陰離子交換色譜(AEX)處理和疏水作用色譜(HIC)處理，所述陰離子交換色譜產生流過級份形式的分離混合物，所述疏水作用色譜產生流過級份形式的經純化的抗體製劑，並且其中所述經純化的抗體製劑進行至少一個進一步的純化步驟。在本發明的上下文中，「分離混合物」是指從本發明的第一離子交換步驟中得到的 溶液，「經純化的抗體製劑」是指從本發明的第二離子交換步驟中得到的溶液。本申請通篇採用這個術語。「串聯順次連接的AEX和HIC」是指，AEX和HIC以AEX裝置的流出物直接進入HIC裝置而沒有中間存儲的方式串聯連接。「流過模式」在本文中是指待純化的抗體通過色譜裝置。這與通常在抗體純化中使用的「捕集模式」相反，在捕集模式中，抗體首先被結合到色譜材料上，並且在隨後的步驟中被洗脫(即通過改變介質條件或組成而被釋放)。在具體的實施方式中，本發明的方法包括作為單一單元操作的AEX和HIC的處理。「單一單元操作」在本文中是指，兩個串聯連接的色譜裝置(AEX和HIC)在單一操作步驟中使用。在第一離子交換色譜步驟之前，通常對在生物反應器中生產的細胞漿液進行澄清(即除去所有細胞材料，諸如全細胞和細胞碎片)。而且，在第一離子交換色譜步驟之前，可以添加調節溶液(添加到細胞漿液中或已經與細胞材料分離的含抗體溶液中)從而確保用於這個第一離子交換步驟的最佳的PH和傳導性條件。「流過級份」在本文中是指，被加載的含抗體級份的至少一部分，其以基本上沒有被結合的方式離開色譜柱，並且/或者以與洗脫流體基本上相同的速度離開色譜柱。優選地，這個級份在洗脫期間基本上未保留在柱上。因此，選擇條件，結果使得雜質而非抗體被結合到陰離子交換材料上並且結合到疏水作用材料上。W02006/020622已經公開了採用陰離子交換色譜和疏水作用色譜順序處理蛋白質混合物來分離蛋白質。但是，在這篇專利申請中，(AEX和HIC)色譜柱二者都以「結合-洗脫」模式使用。此外，這個處理被描述為在通過2D電泳分析蛋白質混合物之前的預純化。因此，其是(非常)小規模的分離。我們已經發現，為了大規模生產的目的，本發明的方法(採用流過模式)與採用結合併洗脫所需抗體的現有公開方法相比提供遠遠更快的分離。有利地,在HIC處理之前,用適當量的易溶鹽/親液(kosmotropic)鹽補充含有抗體的分離混合物。該鹽的陰離子可以優選選自由磷酸根離子、硫酸根離子、乙酸根離子、氯離子、溴離子、硝酸根離子、氯酸根離子、碘離子和硫代氰酸根離子組成的組。該鹽的陽離子可以優選選自由銨離子、銣離子、鉀離子、鈉離子、鋰離子、鎂離子、鈣離子和鋇離子組成的組。優選的鹽是硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、磷酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鉀和氯化鈉。優選地，用適當量的易溶鹽補充分離混合物是單一單元操作的一部分，例如在HIC步驟之前在工藝流中(例如在混合室中)在線混合該鹽。「適當量的易溶鹽」在本文中是指，足以使大部分的相關雜質吸附到疏水作用材料上的易溶鹽，但該用量足夠低不會導致產物的結合或沉澱。對於每個純化工藝來說，需要確定鹽的最佳用量和優選類型。在使用硫酸銨的情況下，在線混合之後的濃度最可能介於0. I和I. OM之間。根據本發明的AEX處理可以在AEX單元中進行，這可以通過經典的含有樹脂的填充床柱子、含有整體材料的柱子、含有適當色譜介質的徑向柱子、吸附膜單元、或者本領域已知的具有起陰離子交換劑作用的適當介質和配體的任何其他色譜裝置來實現。在AEX柱中，色譜材料可以是其上附有或強或弱的陽離子配體的顆粒支撐材料形式。膜形式的陰離 子交換劑由其上附有或強或弱的陽離子配體的一個或多個片材形式的支撐材料組成。支撐材料可以包括有機材料、或無極材料、或有機和無機材料的混合物。適當的有機材料是瓊脂糖基介質和甲基丙烯酸酯。適當的無極材料是矽石、陶瓷和金屬。膜形式陰離子交換劑可由含有陽離子配體的親水聚醚碸構成。適當的強陽離子配體例如基於季胺基團。適當的弱陽離子配體例如基於伯、仲或叔胺基團或本領域已知的任意其他適當配體。根據本發明的HIC處理可以在HIC單元中進行，這可以通過經典的含有樹脂的柱子、基於整體材料的柱子、含有適當色譜介質的徑向柱子、吸附膜單元、或者本領域已知的具有適當起疏水作用材料作用的配體的任何其他色譜裝置來實現。在HIC柱中，色譜材料可以是其上附有疏水配體的顆粒支撐材料形式。膜狀色譜裝置由其上附有疏水配體的一個或多個片材形式的支撐材料組成。支撐材料可以包括有機材料、或無極材料、或有機和無機材料的混合物。適當的有機材料包括例如親水性碳水化合物(例如交聯的瓊脂糖、纖維素或右旋糖苷)或合成共聚物材料(諸如聚(烷基天冬醯胺)、甲基丙烯酸2-羥基乙酯和亞乙基二甲基丙烯酸酯的共聚物、或醯基化聚胺)。適當的無機支撐材料例如為矽石、矽石、陶瓷、和金屬。膜形式HIC可由含有疏水配體的親水聚醚碸構成。疏水配體的適當離子是直鏈或支鏈烷烴(諸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基)，芳族基團(諸如苯基)，醚或聚醚諸如聚丙二醇。可以根據本發明的方法純化的抗體是等電pH為6. 0或更高、優選7. 0或更高、更有選7.5或更高的抗體。這些抗體可以是G類、A類或M類的免疫球蛋白。所述抗體可以是人類的或非人類的(諸如齧齒動物)或嵌合(例如人類化的)抗體，或者可以是上述免疫球蛋白的亞基，或者可以是由免疫球蛋白部分和衍生自或等同於另一蛋白質(非免疫球蛋白)的部分組成的雜交蛋白質。令人驚訝地，由組合的AEX和HIC處理得到的抗體材料通常具有至少98%、優選至少99%、更有選至少99. 9%、甚至更有選至少99. 99%的非常高的純度(指蛋白質含量)。根據本發明的陰離子交換色譜步驟優選在中性或弱鹼性pH下實施。其將去除帶負電荷的雜質，如DNA、宿主細胞蛋白質、蛋白質A(如果存在)、病毒(如果存在)、蛋白質類培養基組分諸如胰島素和胰島素類生長因子(如果存在)。在隨後的疏水作用色譜步驟中，將去除大部分剩餘的大分子雜質(大部分產物聚集體)，該步驟利用大分子雜質比單體型產物更疏水的性質並且設定條件使得它們結合到色譜裝置上，與此同時產物流過。隨後，該高度純化的材料通常不得不通過超濾和滲濾(diafiltration)進行處理，從而除去所有殘餘的低分子量雜質，用最終的製劑緩衝液替代該緩衝液，並且調節所需要的最終產物濃度。這個步驟也確保了所添加的易溶鹽的去除。此外，該高度純化的材料通常還不得不進行處理以確保可能存在的感染性試劑(諸如病毒和/或朊病毒)的完全去除。本發明還涉及含有陰離子交換色譜部分(AEX)和疏水作用色譜部分(HIC) 二者的單一操作單元，這兩個部分串聯連接。這個單一操作單元還包括在陰離子交換色譜部分的 上遊端的入口和在疏水作用色譜部分的下遊端的出口。這個單一操作單元還包括位於陰離子交換色譜部分和疏水作用色譜部分之間的連接部，該連接部進一步包括用於將易溶鹽溶液供應到後一部分、從而供應到分離混合物的入口。在根據本發明的工藝過程中，液體流可以通過任何商用雙泵色譜系統例如AKTA explorer (GE)、BI0PR0CESS (GE)、任意雙泵HPLC系統、或者任何符合圖I的定製的裝置(符合圖I)來確定。這些色譜裝置中的大部分被設計成操作單一色譜單元(即柱或膜)。採用簡單適配，可以進行額外連接以將陰離子交換器放置在泵A之後、混合室之前。圖I表示基本結構。以圖I所標明的位置進行的兩個色譜裝置加上可選預過濾器的串聯順次連接可能導致不希望的壓力累積。因此，在一些條件下，額外的技術適配(例如在AEX單元之後的額外的泵和在AEX單元之前的減壓裝置)可能必須包含在該圖中。
圖I :包含陰離子交換色譜部分和疏水作用色譜部分二者的單一操作單元。緩衝液A是適用於AEX步驟的最佳操作的調節和衝洗緩衝液。緩衝液B包含易溶鹽，並且以為了獲得操作HIC步驟的最佳條件所必需的比率與負載/緩衝液A混合。該混合比可以利用固定的體積混合流來實現或者可以基於例如傳導率輸出結果通過物料反饋迴路自動控制。MC是可選的混合室，其可以包含任何類型的靜態混合器。L =負載PA =M APB =M BAEX=陰離子交換單元HIC =疏水作用色譜單元pH = pH 傳感器O =傳導率傳感器PF =可選的預過濾器
實施例材料和方法
所有試驗都利用通過人細胞系PER. C6的克隆P419生產的IgGl進行。利用化學上確定的培養基以分批補料形式進行培養，此後通過三步深層過濾用過濾器序列 ZetaPlus 10M02P、ZetaPlus 60ZA05 和 SterAssure PSA020 (都來自 Cuno (3M))除去細胞。這樣澄清後的收穫物包含7. 5g/L IgG並被儲存在2_8°C。首先,通過標準蛋白質A色譜的初步純化利用MabSelect (GE)採用標準過程(加載經澄清的收穫物、用20mM Tris+150mM NaCl的頭次衝洗、用pH5. 5的緩衝液的二次衝洗、以及用緩衝液PH3.0洗脫)進行。為了找到用於隨後純化的最佳緩衝條件，二次衝洗和洗脫採用IOOmM乙酸緩衝液或採用IOOmM檸檬酸緩衝液進行。 在MabSelect洗脫之後，收集被洗脫的峰，並將其保持在pH 3. 5下I小時。此後，用2M Tris pH 9. 0將樣品中和至pH 7. 4，並用去礦物水對其進行稀釋，以將傳導率設定為5. OmS,然後將樣品通過0. 22 ii m過濾。由此可得到的材料是在乙酸Tris緩衝液中的或者在檸檬酸Tris緩衝液中的經預純化的IgG。採用這個材料，進行3個系列的實驗1.確定流過模式的AEX色譜的最佳條件(實驗I) ；2.確定流過模式的HI-色譜的最佳條件(實驗2) ；3.在一個單一單元操作實驗中組合最佳的AEX和HIC條件(實驗I)。HCP通過ELIZA採用多克隆抗-PER. C6HCP進行測量。單體型IgG和聚集體濃度通過尺寸排斥色譜(HP-SEC)根據標準過程測定。實驗I.確定流過模式的陰離子交換色譜的最佳條件流過模式的AEX色譜分離利用上述在乙酸Tris緩衝液中的或者在檸檬酸Tris緩衝液中的預純化的IgG進行。測試如下AEX介質Mustang Q coins (0. 35ml) (Pall)、Sartobind Q capsule (Iml)、ChromaSorb capsule (0. 08ml) (Millipore)(均為膜吸附器)，和採用利用Poros 50HQ樹脂的填充床柱(applied Biosystems) (lml填充床)。所有AEX介質利用人KTA explorer以40床體積/hr的流過方式運行。調節和洗滌緩衝液是IOOmM乙酸Tris pH 7. 4 (對於在乙酸緩衝液中的產物運行)或者是IOOmM檸檬酸Tris pH 7. 4 (對於在檸檬酸緩衝液中的產物運行)。每個AEX介質中加載的產物量為I. 5g/ml膜或柱床體積。在色譜分離步驟之前和之後測量HCP。對於AEX色譜分離性能來說，HCP去除被認為是最重要的。對於前述陰離子交換劑來說(均為單一實驗)，HCP的log下降分別為1.9、I. 7、I. 8和2. I。利用朽1檬酸媒介,所有AEX介質進行得相當糟糕，Mustang Q、Chromasorb和Poros 50HQ的HCP log下降分別為I. 2,0. 2和I. 3。這些結果表明，所有被測AEX色譜介質都適於利用乙酸緩衝液進行HCP的大體去除，並且表明在這些條件下HCP log下降幾乎是相當的。實驗2確定流過模式的疏水作用色譜的最佳條件對於HIC 步驟，測試 4 種樹脂Phenyl Sepharose FF Iowsub (GE), Toyopearl PPG600(Tosoh), Toyopearl phenyl 600(Tosoh), Toyopearl butyl 600 (Tosoh)。對於這些實驗，經預純化的IgG處於pH為7. 4、傳導率為5. OmS的IOOmM乙酸Tris緩衝液中。此外，為了使聚集體的量增加至約20%，將經MabSelect預純化的含IgG的材料在pH4和50°C下培養40min。為了調節和洗滌，使用pH7. 4、傳導率5. OmS的IOOmM乙酸Tris緩衝液(緩衝液A)，其與一定體積百分比的緩衝液B在線混合。緩衝液B包含在pH7. 4的IOOmM乙酸Tris緩衝液中的2M硫酸銨。所有樹脂在產品加載期間利用與緩衝液B在線混合(以體積基礎)進行測試。對於每種樹脂，測試負載/緩衝液A和緩衝液B的若干百分率比。所有的柱體積為1ml，流速為100ml/hr，負載中的IgG量為0. 29g/l，加載100ml。對負載和流過物二者進行取樣和分析。在0*%B 時，Toyopearl phenyl 600, Toyopearl butyl 600 二者都已經結合了IgG以及聚集體的大部分。因此，得出這樣的結論這些樹脂不適於在所應用的條件下利用P419IgG以流過模式進行聚集體的去除。Phenyl Sepharose FF Iowsub (未不出)，Toyopearl PPG 600(參見表 I) 二者在一定比率下利用在線混合含硫酸銨的緩衝液B以流過方式獲得了良好的聚集體淨化。表I.使用Toyopearl PPG 600以不同體積比在線混合含硫酸銨的緩衝液B的聚集體淨化。
權利要求
1.一種從生物反應器中生產的蛋白質混合物中純化抗體的方法，該方法至少包含中間純化步驟和精提純步驟，其中所述中間純化步驟和精提純步驟包括串聯順次連接的陰離子交換色譜(AEX)和疏水作用色譜(HIC)，所述陰離子交換色譜產生流過級份形式的分離混合物，所述疏水作用色譜產生流過級份形式的經純化的抗體製劑，並且其中所述經純化的抗體製劑進行至少一個進一步的純化步驟。
2.如權利要求I所述的方法，其中陰離子交換色譜和疏水作用色譜在兩個串聯連接的分離裝置中進行。
3.如權利要求I所述的方法，其中所述串聯順次連接的AEX和HIC以單一單元操作方式進行。
4.如權利要求I至3中任意一項所述的方法，其中，所述分離混合物在HIC之前被適當量的易溶鹽補充。
5.如權利要求I至4中任意一項所述的方法，其中，所述分離混合物在HIC之前被適當量的硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、磷酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鉀和氯化鈉補充。
6.一種可用在權利要求I至5中任意一項的方法中的單一操作單元，其包括串聯連接的陰離子交換色譜部分和疏水作用色譜部分二者，其中，所述陰離子交換色譜部分的出口與所述疏水作用色譜部分的入口相連，其中所述單元包括在所述陰離子交換色譜部分的上遊端的入口和在所述疏水作用色譜部分的下遊端的出口，並且其中所述單元還包括位於所述陰離子交換色譜部分和所述疏水作用色譜部分之間的入口。
全文摘要
本發明涉及一種從生物反應器中生產的蛋白質混合物中純化抗體的方法，該方法至少包含中間純化步驟和精提純步驟，其中所述中間純化步驟和精提純步驟包括流過模式的順次連接的陰離子交換色譜(AEX)處理和疏水作用色譜(HIC)處理。本發明還涉及一種單一操作單元，其包括串聯連接的陰離子交換色譜部分和疏水作用色譜部分二者，其中所述單元包括在所述陰離子交換色譜部分的上遊端的入口和在所述疏水作用色譜部分的下遊端的出口，並且其中所述單元還包括位於所述陰離子交換色譜部分和所述疏水作用色譜部分之間的入口。
文檔編號C07K1/20GK102762585SQ201180009420
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月10日 優先權日2010年2月12日
發明者蘭德爾·威廉姆·瑪爾勒韋德, 迪德裡克·瑞恩德·克裡瑪 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司