用於寡核苷酸合成的中間體的製作方法

2023-05-18 05:59:56

專利名稱：用於寡核苷酸合成的中間體的製作方法
技術領域：
本發明涉及寡核苷酸中間體化合物和該化合物在寡核苷酸製備中的用途。
因此，本發明一方面提供了一種下式化合物
其中B1是一種核苷鹼的殘基，R1是氫或一種羥基保護基團，R2是氫、羥基或一種2』核苷修飾性原子或基團，R3是一個未發生取代或已發生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，Z是滷素或一個下式基團
其中R4與R5均獨立為一個未發生取代或已發生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，或者R4為所述基團且R5為氫，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個五元至十三元雜環；或者Z是一個下式基團Nuc-O-Ⅲ其中Nuc是一種天然或合成的核苷或寡核苷酸在除去通過5』亞甲基與所示氧原子連接的5』羥基後的殘基。
若R3、R4或R5表示一個取代的烷基、鏈烯基、環烷基烷基、芳基或芳烷基，該基團優選被滷素、羥基、C1-C4烷氧基、氰基、硝基或三(C1-C15烴基)甲矽烷基取代，或者在R3的情況下，優選被C1-C4烷基磺醯基或C6-C10芳基磺醯基取代。
若式Ⅰ化合物中含有一個三(C1-C15烴基)甲矽烷基，該基團例如可以是三烷基甲矽烷基，如三甲基甲矽烷基、三乙基甲矽烷基、三正丙基甲矽烷基、三異丙基甲矽烷基、三正丁基甲矽烷基、三異丁基甲矽烷基、異丙基二甲基甲矽烷基、叔丁基二甲基甲矽烷基或1,1,2,2-四甲基乙基二甲基甲矽烷基(thexyldimethylsilyl)；三芳基甲矽烷基，如三苯基甲矽烷基；三芳烷基甲矽烷基，如三苄基甲矽烷基；芳二烷基甲矽烷基，如苯基二甲基甲矽烷基、苯基二乙基甲矽烷基、苯基二異丙基甲矽烷基或苯基二叔丁基甲矽烷基；或烷基二芳基甲矽烷基，如甲基二苯基甲矽烷基、異丙基二苯基甲矽烷基或叔丁基二苯基甲矽烷基。如果R3、R4或R5具有一個三(C1-C15烴基)甲矽烷基取代基，該取代基優選為三(C1-C4烴基)甲矽烷基，尤其是三甲基甲矽烷基。R1作為三(C1-C15烴基)甲矽烷基，優選為C1-C6烷基二(C6-C8芳基)甲矽烷基，尤其是叔丁基二苯基甲矽烷基；或者支鏈C2-C10烷基二(C1-C4烷基)甲矽烷基，尤其是1,1,2,2-四甲基乙基二甲基甲矽烷基。
R1可以是任意羥基保護基團，能夠保護5』羥基不發生所不需要的反應。這樣的基團是為人所熟知的，包括C1至C10脂族基團，例如烷基；C3至C8環脂族基團，例如環烷基；C6至C10芳族基團，例如芳基；C7至C40芳脂族基團，例如芳烷基或C1至C4烷氧基取代的芳烷基；式-COR或-SO2R基團，其中R是一個C1至C10脂族基團、C3至C8環脂族基團、C6至C10芳族基團或C7至C40芳脂族基團；和三(C1-C15烴基)甲矽烷基。R1優選為氫或一個常用於寡核苷酸合成的5』保護基團，更優選為氫、一個C7至C40芳脂族基團或一個三(C1-C15烴基)甲矽烷基，尤其是一個未發生取代或已發生取代的三苯甲基，如甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基或三叔丁基三苯甲基，或一個C1-C6烷基二(C6-C8芳基)甲矽烷基，如叔丁基二苯基甲矽烷基，特別是二甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲矽烷基。
R2是2』核苷修飾性原子或基團，也就是可以代替氫原子或羥基連接在核苷2』位上並使其修飾的原子或基團，它可以是一個滷素原子，如氟、氯或溴原子；C1至C10未取代的烷基，如甲基、三氟甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基或癸基；C6至C10芳基，如苯基、甲苯基或二甲苯基；C7至C13芳烷基，如苄基；氨基；C1至C10烷基氨基，如甲氨基、乙氨基或辛氨基；C1至C10烷基硫基，如甲硫基、乙硫基或辛硫基；疊氮化物；硝酸鹽；亞硝酸鹽；氰化物；氰酸鹽；甲磺酸鹽；C1至C10氨基烷基氨基；式-OR6或-OCOR6基團，其中R6是一個C1至C30有機基團；取代的甲矽烷基；一個RNA切割基團；一個膽甾烯基；共軛連接；一個報導基團；一個嵌入基；一個可提高寡核苷酸藥物動力學性質的基團；或一個可提高寡核苷酸藥物效力學性質的基團。
R2優選為氫、滷素、羥基或一個式-OR6或-OCOR6基團，其中R6是一個C1至C10烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基或正癸基；C2至C10鏈烯基，如乙烯基、烯丙基、甲代烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基；一個C3至C8環烷基，如環丙基、環丁基、環戊基、甲基環戊基、環己基、甲基環己基、環庚基或環辛基；一個C4至C10環烷基烷基，如環丙基甲基、環丁基甲基、環己基甲基、甲基環己基甲基、環己基乙基或二甲基環己基乙基；一個C6至C10芳基，如苯基，鄰、間或對甲苯基，鄰、間或對二甲苯基或萘基；或一個C7至C25芳烷基，如苄基、苯乙基、二苯甲基或三苯甲基，任意這些基團可以是未取代的或被滷素、羥基、C1至C4烷氧基或氰基取代，或者，如果R2為式-OR6基團，則R6是一個三(C1-C15烴基)甲矽烷基。
在更為優選的實施方案中，R2為氫、羥基、氟、一個式-OR6基團，其中R6是一個C1至C4烷基、一個C2至C4鏈烯基、一個C7至C13芳烷基；或者是一個式-(R7-O)N-R8基團，其中R7為C1至C4亞烷基，R8為C1至C4烷基，n為1至8；或者R2是一個式-OCOR6，其中R6為C1至C4烷基或C6至C8芳基。在尤其優選的實施方案中，R2為氫、羥基、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、苄氧基、甲氧基乙氧基、-O-(CH2-CH2-O-)3-CH3、乙酸基或苯甲酸基。
R3、R4或R5作為C1至C10烷基，例如可以是一種直鏈或支鏈基團，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基或正癸基。R3、R4或R5作為C2至C10鏈烯基，例如可以是乙烯基、烯丙基、甲代烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基。R3、R4或R5作為C4至C10環烷基烷基，例如可以是環丙基甲基、環丁基甲基、環戊基甲基、環戊基乙基、甲基環戊基甲基、環己基甲基、環己基乙基、甲基環己基甲基、甲基環己基乙基、二甲基環己基甲基或二甲基環己基乙基。R3、R4或R5作為C6至C10芳基，例如可以是苯基、鄰甲苯基、間甲苯基、對甲苯基、鄰二甲苯基、間二甲苯基或對二甲苯基。R3、R4或R5作為C7至C13芳烷基，例如可以是苄基、苯乙基或二苯甲基。作為R3、R4或R5的任意上述基團可以是未取代的或已發生如前文所述的取代。
若R4與R5以及所連接的氮原子共同表示一個雜環，該環例如可以是一個五元環，如吡咯烷環；一個六元環，如哌啶、2,6-二甲基哌啶、N-甲基哌嗪、嗎啉或硫代嗎啉環；一個七元環，如全氫化吖庚因環；一個八元環，如全氫化吖辛因環；一個九元環，如全氫化偶氮寧環；一個十元環，如全氫化吖癸因環；一個十一元環，如氮雜環十一烷環；一個十二元環，如氮雜環十二烷環；或一個十三元環，如氮雜環十三烷環。
R3優選為未發生取代或已發生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環烷基烷基或C7至C9芳烷基，尤其是甲基、乙基、2-氰乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基、苄基或2-(三甲基甲矽烷基)乙基。
若式Ⅰ中的Z為式Ⅱ基團，在優選的實施方案中，R4與R5獨立為未發生取代或已發生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環烷基烷基或C7至C9芳烷基；或R4為C1至C4烷基，優選為分支的C1至C4烷基，如異丙基或叔丁基，或C7至C9芳烷基，如苄基，且R5為氫；或R4與R5以及所連接的氮原子共同表示一個五元或六元雜環，環中具有一或兩個雜原子。在尤其優選的實施方案中，R4與R5獨立為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、烯丙基或苄基，或R4與R5以及所連接的氮原子共同表示一個吡咯烷、哌啶或嗎啉環。
若式Ⅰ中的Z為式Ⅲ基團，Nuc殘基可以是任意天然或合成核苷在除去5』羥基後的殘基，例如腺苷、胞苷、鳥苷、胸苷、尿苷、2-氨基腺苷、6-N-苄基腺苷、5-N-甲基胞苷、4-N-苯甲醯基胞苷、5-丙炔基胞苷、2-N-異丁醯基鳥苷、N-苄氧甲基胸苷或5-氟尿嘧啶；或從其中派生的寡核苷酸，可以是二核苷酸、三核苷酸或更高級的寡聚物，並且具有天然的即磷酸二酯核苷間鍵或其合成的類似鍵，如硫代磷酸酯鍵或甲基膦酸酯鍵，或這樣的核苷間鍵的P(Ⅲ)前體。
式Ⅰ中的B1可以是一種見於天然來源的核苷鹼的殘基，它可以是未發生取代或已發生取代的，例如在一個氮原子上被一個保護基團如一種醯基取代，該醯基可以是脂族的如乙醯基，或芳族的如苯甲醯基或硝基苯甲醯基；或被一個芳烷氧基烷基保護基團取代，如苄氧甲基；或者是這種鹼的合成的類似物。常用於核苷酸化學的其他類型保護基團可以存在於B1中的氮原子上，包括脒基，如N,N-二甲基甲脒、N,N-二甲基乙脒和N-甲基吡咯烷脒基，和烷氧基羰基，如叔丁氧基羰基，它可將氨基轉化為氨基甲酸酯基。
因此B1可以是嘌呤或嘧啶鹼的殘基，如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶，或這些鹼的類似物，如2-氨基腺嘌呤、6-羥基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶或二氫尿嘧啶，或者在這種殘基的一個氮原子上被例如上述的保護基團取代的殘基。
在Z是一個式Ⅲ基團的某些優選實施方案中，Nuc是一個上述核苷或寡核苷酸殘基，該殘基的末端3』位通過諸如琥珀醯基等一種連接基團附著在固相載體如固相寡核苷酸合成中所使用的載體上，載體例如一種含有長鏈烷氨基的基於二氧化矽的惰性載體，如受控制的多孔玻璃(controlled pore glass,CPG)。該固體載體還可含有對將在載體上合成的寡核苷酸來說起到3』末端修飾性基團作用的基團。
本發明化合物可以是可能的異構體形式之一，例如非對映異構體、旋光異構體、外消旋物或其混合物。式Ⅰ化合物優選的異構體為下式
其中B1、R1、R2和R3如上文定義。
尤其優選的式Ⅰ化合物具體如下文實施例所述。
使其中Z為滷素的式Ⅰ化合物、即下式化合物
其中B1、R1、R2和R3如上文定義，Y為滷素，與下式化合物反應，
其中R4和R5如上文定義，可製得其中Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ化合物。可以在有機溶劑例如滷代烴(如氯仿)中，在叔氮鹼如吡啶的存在下，在-78℃至50℃、優選為-30℃至25℃的溫度下進行該反應。
通過下式化合物的非氧化性滷化反應可製得式Ⅴ化合物，
其中B1、R1、R2和R3如上文定義。可以在一種鹼、優選為一種叔氮鹼如吡啶的存在下，在可以是吡啶但優選為一種滷代烴如氯仿的有機溶劑中，在-20℃至60℃、優選為0℃至50℃的溫度下，使式Ⅶ化合物與一種非氧化性滷化劑、例如一種滷代正膦、如三苯基二氯正膦或二氯三(2,4,6-三溴苯氧基)正膦反應，進行非氧化性滷化反應。
式Ⅵ化合物是商業上可得到的或可按已知方法製備的胺類。
WO 96/08503描述了式Ⅶ化合物及其製備。
使其中R1為羥基保護基團且Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ化合物與具有一個游離5』羥基的天然或合成核苷或寡核苷酸(包括具有一或多個P(Ⅲ)前體核苷間鍵的寡核苷酸)反應，可以製得其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物。該反應可以在溶液中進行，或者與附著在如前文所述的載體上的核苷或寡核苷酸反應。現已發現，該反應可以採用常規寡核苷酸合成中具有一個3』亞磷醯胺基的核苷與具有一個游離5』羥基的核苷或寡核苷酸之間的偶合反應所已知的反應條件和方法，例如參見《寡核苷酸與類似物一種實用的方法》F.Eckstein編著，IRL出版社1991。
因此，在一種胺-質子化偶合催化劑(活化劑)如四唑或5-(4-硝基苯)四唑的存在下，其中Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ化合物可以與核苷或寡核苷酸反應，得到其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物。該反應可以在-20至50℃、優選在室溫下進行。
若其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物與一種附著在固相載體上的核苷或寡核苷酸反應，其產物為一種式Ⅰ化合物，其中Z為式Ⅲ基團且Nuc是附著在固相載體上的核苷或寡核苷酸殘基。
其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物是用於寡核苷酸製備的中間體，該寡核苷酸具有比Nuc中的寡核苷酸殘基更多的核苷殘基。因此，本發明也提供了一種下式寡核苷酸的製備方法
其中B1、R1、R3和Nuc如上文定義，X為氧或硫，該方法包括使其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物進行氧化反應，以生成其中X為氧的式Ⅷ寡核苷酸，或者進行硫化反應，以得到其中X為硫的式Ⅷ寡核苷酸。
現已發現，其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物的氧化反應或硫化反應可以分別使用亞磷酸鹽核苷間鍵的氧化反應或硫化反應所用的方法。因此例如使用已知的寡核苷酸合成中亞磷酸鹽核苷間鍵的氧化反應條件和方法，通過用碘與水，或用一種過氧化氫化物、如過氧化氫叔丁酯處理其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物，可以使其進行氧化反應。例如使用已知的亞磷酸鹽核苷間鍵的硫化反應方法，在一種有機溶劑、通常為二硫化碳中，在一種叔胺的存在下通過用硫處理，通過用[3H]1,2-苯並二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage試劑)處理，或用四乙基秋蘭姆處理其中Z為式Ⅲ基團的式Ⅰ化合物，可以使其進行硫化反應。氧化反應與硫化反應一般都是在室溫下進行的。
因此，本發明在另一方面提供了寡核苷酸的製備方法，該方法包括使具有一個被保護的5』羥基和一個3』位下式基團的核苷與一種具有一個游離5』羥基的天然或合成的核苷或寡核苷酸進行核苷偶合反應
其中R3、R4和R5如前文定義，反應生成一種具有一個下式核苷間鍵的寡核苷酸前體
其中R3如前文定義，再使該前體轉化為一種具有一個下式核苷間鍵的寡核苷酸
其中R3如前文定義，X為氧或硫，該轉化作用是通過氧化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵(其中X為氧)的寡核苷酸或硫化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵(其中X為硫)的寡核苷酸而實現的。
在3』位具有式Ⅸ基團的核苷、具有一個游離5』羥基的核苷或寡核苷酸以及進行這些反應的方法可以如上文所述。
可以對其中Nuc是附著在固相載體上的核苷或寡核苷酸的殘基的式Ⅷ寡核苷酸進行處理，以除去5』保護基團R1，再使所得具有末端5』羥基的寡核苷酸與一種天然或合成的具有被保護的5』羥基與反應性的或可被激活而具有反應活性的3』位基團的核苷或寡核苷酸進行連續的偶合反應，將去保護的式Ⅷ寡核苷酸上的游離5』羥基附著在載體上，直至得到所需長度的寡核苷酸。因此，式Ⅷ寡核苷酸可以與具有3』亞磷醯胺基、H-膦酸酯基或磷酸二酯基和被保護的5』羥基的核苷或寡核苷酸偶合，或者可以與其中Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ化合物偶合，以得到一種鏈被延長的寡核苷酸，進一步進行這兩種反應之一可依次進一步延長鏈，直至得到所需長度的寡核苷酸。在使用具有3』亞磷醯胺基、H-膦酸酯基或磷酸二酯基的核苷或寡核苷酸的情況下，可以使用寡核苷酸合成中的已知方法進行這些偶合反應。在使用其中Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ化合物的情況下，偶合反應可如前文所述進行。因此，在使用3』亞磷醯胺或其中Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ化合物的情況下，一個偶合周期涉及一個氧化或硫化步驟，而如果所用的是3』H-膦酸酯，則氧化反應或硫化反應是在鏈延長完成後進行的，如果所用的是3』磷酸二酯，則不需要氧化反應。
在合成了具有所需數量核苷的寡核苷酸以後，可用常規方法對其進行處理以除去羥基保護基團如二甲氧基三苯甲基，例如用一種含水有機酸處理，如三氟乙酸。若寡核苷酸是在固相載體上合成的，則這種處理措施例如可以使用諸如濃氨水處理等常規方法在寡核苷酸從載體上脫離下來之前或之後進行，該處理方法也除去了用於寡核苷酸合成的一個或多個核苷的環外氮原子上的保護基團。由去保護作用產生的末端5』羥基通過反應能引入一個5』末端修飾性基團，如磷酸酯基或其他5』修飾性基團，反應方法例如Beaucage and lyer，四面體，49:1925-63(1993)所述。
本發明通過下列實施例進行舉例說明。
在實施例化合物及其前體的結構式中，Et為乙基，Me為甲基，T為l-胸腺嘧啶基，t-Bu為叔丁基，Ph為苯基，DMTr為二甲氧基三苯甲基。
如下製備實施例中所用的化合物及其前體化合物A
這是WO 96/08503的化合物87，按照WO 96/08503的實施例84所述製得。
化合物B
向化合物A(0.85g,1.22mmol)的無水甲醇(10ml)溶液中加入甲氧基鈉(1.5ml 4.4N的甲醇溶液)。在室溫下攪拌16小時後，濃縮並用閃蒸矽膠柱色譜法精製(梯度洗脫-氯仿、甲醇、三乙胺100∶20∶1-100∶35∶1)，然後使產物的含水0.5％三乙胺溶液通過Dowex 50W-X2離子交換柱(三乙胺型)進行進一步精製，濃縮後得到化合物B。
31P nmr1H去耦(CD3OD,162MHz)δ23.7ppm化合物C
這是WO 96/08503的化合物84，按照WO 96/08503的實施例81所述製得。
化合物D
在氬氣、室溫下，向化合物B(500mg,0.71mmol)與二環己基碳二亞胺(189mg,0.92mmol)的無水THF(5.4ml)溶液中加入3-羥基丙腈(58μl,0.85mmol)。所得溶液在55℃下加熱2小時。冷卻後，將混合物過濾，用乙酸乙酯(20ml)稀釋，並用水與鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。將所得產物溶於二氯甲烷(5ml)，過濾並濃縮，根據需要重複該步驟以除去二環己基脲，得到化合物D，分離為關於磷的非對映異構體混合物。
可供選擇的方法在氬氣下，向化合物B(12.3g,17.4mmol)與二環己基碳二亞胺(3.94g,19.1mmol)的無水THF(120ml)溶液中加入3-羥基丙腈(1.42ml,20.8mmol)，所得混合物在60℃下加熱4小時。濃縮至大約一半體積後，用等體積的乙酸乙酯稀釋，過濾除去所得沉澱。濾液用乙酸乙酯洗滌後，有機相約為200ml，用水(4×80ml)與飽和鹽水(6×80ml)洗滌，經硫酸鈉乾燥並濃縮。將所得固體再次溶於乙腈(200ml)，用己烷(6×50ml)萃取。然後將乙腈相濃縮並在高真空下乾燥，得到化合物D。
實測C 62.2％；H 5.9％；N 6.5％C35H38N3O8P·H2O計算值C 62.05％；H 5.95％；N 6.2％31P nmr1H去耦(162MHz,CDCl3)δ37.5,37.3ppm化合物E
這是WO 96/08503的化合物100，按照WO 96/08503的實施例98所述製得。
化合物F
在氬氣下，向化合物E(0.47g,0.60mmol)、二環己基碳二亞胺(DCC)(0.148g,0.72mmol)和鹽酸三乙胺(0.24g,1.8mmol)的無水氯仿(3ml)溶液中加入3-羥基丙腈(81μl,1.2mmol)。所得溶液在60℃下加熱四小時。然後將混合物在真空下濃縮，溶於乙酸乙酯(50ml)並過濾。所得澄清溶液用水(3×20ml)和飽和鹽水(8×20ml)萃取。經硫酸鈉乾燥後，過濾並在減壓下濃縮，得到含有DCC的粗產物。將該粗產物溶於乙腈，並反覆用己烷萃取，可除去DCC。
實測C 63.35％；H 6.50％；N 8.80％C40H46N5O7P·H2O計算值C 63.40％；H 6.40％；N 9.25％31P nmr1H去耦(162MHz,CDCl3)δ38.1,37.4ppm化合物G
在氬氣、5℃下，向化合物B(1.0g,1.41mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入三乙胺(98μl,0.71mmol)，然後滴加氯甲酸甲酯(142μl,1.84mmol)。5分鐘後，使溶液溫度升至室溫，攪拌45分鐘。混合物用二氯甲烷稀釋，用水洗滌，乾燥(硫酸鈉)並濃縮。閃蒸矽膠柱色譜法精製(洗脫液乙酸乙酯∶甲醇10∶1)，得到化合物G，為一關於磷的非對映體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ37.3,37.0ppm.1H nmr(CDCl3,500MHz)δ8.10(1H,brs,NH),7.55(1H,s,H6),7.35(2H,d,ArH),7.25(6H,m,ArH),7.15(1H,m,ArH),7.00(1H,d,PH,J530Hz),6.80(4H,d,ArH),3.75(1H,m,H4』),3.70(6H,s,ArOCH3),3.55(1H,dd,H5』),3.25(1H,dd,H5』),2.70(1H,m,H3』),2.45(1H,m,H2』),2.20(1H,m,H2』),1.75(1H,m,H6』),1.60(1H,m,H6』),1.45(3H,brs,TCH3)ppm.
化合物H
通過與無水吡啶進行共蒸發(4×50ml)，小心地將三唑(20.7g,0.3mol)乾燥，然後在氬氣下溶於吡啶(80ml)並冷卻至0℃。加入三乙胺(41.8ml,0.3mol)，在加入磷醯氯(6.87ml,75mmol)的過程中攪拌混合物。所得溶液在0℃下攪拌15分鐘。滴加如WO 96/08503實施例80所述製備的WO 96/08503化合物83(20.6g,30mmol)經小心乾燥(與3×50ml吡啶共蒸發)後的吡啶(50ml)溶液。使所得深色溶液溫度升至室溫。18小時後，將混合物濃縮並溶於THF(300ml)。加入濃氨(90ml)，混合物在室溫下攪拌18小時。濃縮並用閃蒸矽膠柱色譜法精製(乙酸乙酯加甲醇梯度洗脫10％-25％)，得到化合物H，為一關於磷的非對映異構體混合物。
31P nmr1H去耦(CD3OD,162MHz)δ50.0,49.5ppm
化合物J
在氬氣下，向化合物H(7.87g,11.5mmol)的無水THF(110ml)溶液中加入三乙胺(6.4ml,45.9mmol)，並在加入苯甲醯氯(2.00ml,17.21mmol)的過程中將所得溶液冷卻至-70℃。然後使溶液溫度升至室溫，並攪拌過夜。將所得混合物部分濃縮，溶於乙酸乙酯，並用水洗滌兩次，然後用鹽水洗滌一次。溶液經硫酸鈉乾燥，濃縮並用閃蒸矽膠柱色譜法精製(己烷∶乙酸乙酯1∶5-純乙酸乙酯梯度洗脫)，得到化合物J，為一關於磷的兩種非對映異構體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ47.0,46.8ppm實測C 61.85％；H 7.25％；N 5.10％C42H56O8N3PSi.3/2H2O計算值C 61.75％；H 7.30％；N 5.15％化合物K
向化合物J(14.5g,18.34mmol)的無水THF(160ml)溶液中緩慢加入氟化四丁銨的THF溶液(20.2ml,20.2mmol)。所得溶液在室溫下攪拌6小時，蒸發得到一黃色油狀物，然後用閃蒸矽膠柱色譜法精製(乙酸乙酯-乙酸乙酯∶乙醇7∶1梯度洗脫)，得到化合物K，為一關於磷的兩種非對映異構體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ48.9,48.8ppm實測C 55.65％；H 7.00％；N 7.35％C26H38O8N3P·1/2H2O計算值C 55.70％；H 7.00％；N 7.50％化合物L
從無水甲苯(3×20ml)中通過共蒸發，小心地將化合物K(2.48g,4.50mmol)乾燥。在氬氣、室溫下，加入二氯甲烷(45ml)，再加入乙醇(2.62ml,45mmol)。在加入三甲基甲矽烷基氯(5.69ml,45.0mmol)的過程中將所得溶液攪拌並冷卻至-15℃。將所得化合物完全脫去氬氣，並緩慢升至室溫。在室溫下攪拌6小時後，混合物用二氯甲烷稀釋，用碳酸氫鈉溶液洗滌兩次，經硫酸鈉乾燥並濃縮，得到化合物L，為一關於磷的兩種非對映異構體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ35.5,34.2ppm實測C 55.5％；H 6.10％；N 9.70％C20H26N3O6P計算值C 55.15％；H 6.00％；N 9.65％
化合物M
通過與無水吡啶共蒸發(6×50ml)，小心地將化合物L(4.79g,11.0mmol)乾燥，然後在氬氣、室溫下溶於吡啶(80ml)，再加入三乙胺(3.1ml,22mmol)，然後加入二甲氧基三苯甲基氯(4.10g,12.1mmol)。在室溫下16小時後，將混合物濃縮並在-20℃下貯藏過夜。將所得固體溶於THF(50ml)、三乙胺(15ml)和水(10ml)中，並在室溫下攪拌7小時。將所得混合物濃縮並用閃蒸矽膠柱色譜法精製(乙酸乙酯、三乙胺50∶1-乙酸乙酯、甲醇、三乙胺55∶45∶2梯度洗脫)，得到化合物M。
31P nmr1H去耦(CDCl3,202MHz)δ22.4ppm實測C 64.5％；H 6.65％；N 6.4％C45H55N4O8P·3/2H2O計算值C 64.5％；H 6.95％；N 6.7％化合物N
按照化合物D所述的可供選擇的方法製備化合物N，不過用化合物M代替化合物B作為原料，並省略乙腈-己烷分配步驟。31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ37.2,36.8ppmMS(FAB)M/Z 763(MH+)實施例1
向小心乾燥後的化合物C(40mg,70μmol)的含有吡啶(80μl,1mmol)的氘代氯仿(0.5ml)溶液中加入二氯三苯基正膦(113mg,350μmol)。振搖所得混合物以溶解正膦，然後保持在環境溫度下。用31P nmr監控反應進程。產物即化合物1在201ppm下共振。16小時後，另加入二氯三苯基正膦(45mg,140μmol)。再過24小時後，31P nmr顯示反應已完成了95％。在-30℃下，向粗反應混合物中分次加入二異丙胺(150μl,1.07mmol)，每次30μl。使所得混合物溫度升至室溫，然後用二氯甲烷(20ml)稀釋，用去離子水(2×10ml)洗滌兩次，乾燥(硫酸鈉)並濃縮。用閃蒸矽膠柱色譜法精製(4∶1-2∶1己烷-乙酸乙酯梯度洗脫)，得到化合物2，為一兩種非對映異構體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ123.0,122.3實施例2
使用實施例1的方法，先將化合物D(30mg,44μmol)轉化為化合物3，然後用吡咯烷(56μl,0.67mmol)代替實施例1所用的二異丙胺，將其轉化為化合物4。
實施例3除了在合成過程的適當步驟中用化合物4代替常用的3』-亞磷醯胺取代的核苷以外，按照如《寡核苷酸與類似物一種實用的方法》(F.Eckstein編著，IRL出版社，1991)所述的標準固相亞磷醯胺寡核苷酸合成法，製備具有5』-TTT tTC TCT CTC TCT-3』序列(其中t代表一個來自化合物4的核苷單元)的寡核苷酸1，以生成其中Z為式Ⅲ基團(其中Nuc為核苷酸TC TCT CTC TCT殘基)的式Ⅰ化合物，然後在標準氧化步驟中將其氧化為其中X為氧的式Ⅷ寡核苷酸，該寡核苷酸進一步被偶合得到寡核苷酸1。
實施例4
在氬氣、5℃下，向攪拌的雙(三氯甲基)碳酸酯(1.01g,3.40mmol)的無水二氯甲烷(10ml)溶液中加入三苯膦(2.68g,10.21mmol)的無水二氯甲烷(8ml+7ml洗液)溶液。立即將混合物溫度在5分鐘內升至室溫，然後加入吡啶(1.24ml)，混合物充分混合併再次冷卻至5℃。向所得淡棕色溶液中加入化合物D(3.45g,5.11mmol)的含有吡啶(1.24ml)的無水二氯甲烷(10ml+5ml洗液)溶液。加完溶液後，使溶液溫度升至室溫。在室溫下攪拌1小時後，混合物含有化合物3(31P nmrδ206.7ppm)。將混合物冷卻至-30℃，歷時5分鐘加入二並丙胺(3.57ml,27mmol)。歷時10分鐘將混合物的溫度升至室溫，然後在真空下濃縮至一半體積。將該溶液立即轉移至閃蒸矽膠色譜柱(300g，矽膠)頂部，用己烷∶四氫呋喃∶三乙胺25∶25∶1洗脫。得到一些純產物部分。不純的部分進一步進行閃蒸矽膠色譜，用己烷∶四氫呋喃∶二氯甲烷∶三乙胺25∶25∶10∶1洗脫。匯集所有的產物部分，濃縮得到化合物5，這是一種白色泡沫，為關於磷的非對映異構體混合物。
實測C 66.2％；H 7.25％；N 7.5％C41H51O7N4P計算值C 66.3％；H 6.9％；N 7.55％31P nmr1H去耦(162MHz,CDCl3)δ128.3,127.8ppmM/Z(ES+)743(M+H)+(ES-)741(M-H)-實施例5
按照實施例4的方法製備化合物6和7，但是用化合物F代替化合物D。用相同摩爾數、但是一半濃度的試劑進行該反應。在製備的最初階段，反應進行2小時而不是1小時，得到化合物6(31P nmrδ205.7ppm)。最終步驟涉及用水洗滌粗產物兩次，濃縮並用閃蒸矽膠柱色譜法精製(洗脫液為乙酸乙酯/甲醇10∶1+2％Et3N)，得到化合物7，為兩種對映異構體的混合物。
實測C 63.85％；H 7.05％；N 9.55％C46H59N6O6P·2H2O計算值C 64.25％；H 7.35％；N 9.80％31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ128.6,128.1ppmM/Z(ES+)823(MH+)實施例6
按照實施例4的方法製備化合物8和9，但是用化合物G代替化合物D。反應的最初階段得到化合物8(31P nmrδ207.7ppm)。反覆用閃蒸矽膠柱色譜法進行最終的精製，其中先用己烷/乙酸乙酯2∶1+2％Et3N洗脫，隨後用己烷/二乙醚1∶3+2％Et3N洗脫，得到化合物9，其為兩種對映異構體的混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,202MHz)δ128.8,127.8ppmMZ(ES+)(704,705,706,MH+)(ES-)(702,703,704,M-H-)實施例7
按照實施例6的方法製備化合物10，但是用二甲胺代替實施例6所用的二異丙胺，使中間體化合物8與2.0摩爾二甲胺的THF溶液反應。最終用閃蒸矽膠柱色譜法精製(洗脫液為乙酸乙酯/己烷3∶1+2％Et3N)，得到化合物10，為兩種非對映異構體混合物。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ144.3,144.2ppm實施例8
按照實施例10的方法製備化合物11和12，但是用化合物N代替化合物D。在這種情況下，終產物化合物12用閃蒸矽膠柱色譜法精製(己烷-THF-三乙胺50∶50∶1)。
31P nmr1H去耦(CDCl3,162MHz)δ128.1,127.6ppmMZ(ES+)846,847,848,(MH)+(ES-)844,845,846,(M-H)-實施例9-15按照標準DNA合成技術，使用亞磷醯胺策略，製備下列被修飾的寡核苷酸。所有偶合反應為雙重偶合，也就是說使結合於載體上的寡核苷酸暴露於亞磷醯胺溶液或修飾性溶液若干秒鐘後，將該溶液用一批新製得的單體溶液置換。在與亞磷醯胺偶合的情況下，在氧化或硫雜化(硫化)前洗滌載體。在與其中Z為式Ⅱ基團的式Ⅰ的被修飾單體(已知也是亞磷醯胺)偶合的情況下，載體不經洗滌階段立即暴露於氧化溶液或硫雜化溶液。該方法最大程度地減少結合於載體上的PⅢ中間體可能發生的水解反應。
在如下給出的被修飾的寡核苷酸的核苷酸序列中，T、C、A和G具有它們通常的意義，且來自常見的亞磷醯胺單體，t表示來自化合物5的核苷酸單元，c表示來自化合物7的核苷酸單元，化合物5與化合物7被用於合成法的適當步驟中。硫化了的核苷酸間鍵由s表示；所有其他的核苷酸間鍵均被氧化。
實施例95′TTTTtCTCTCTCTCT 3′TOF MS實測=計算值=4424.3實施例105′tttttCTCTCTCTCT 3′TOF MS實測=4415.3計算值=4415.9實施例115′GCGttttttttttGCG 3′TOF MS實測=4859.8計算值=4865實施例125′TTTTTTTTTTTTTTTtttT 3′TOF MS實測=5709.3計算值=5711.7
實施例135′ttctcGsCsCsCsGsCsTsCsCstcctcC 3′TOF MS實測=6086.6計算值=7001.5實施例145′tstscstscsGsCsCsCsGsCsTsCsCstscscstscsC 3′TOF MS實測=6214.5計算值=6246.1實施例155′tstscstscsGsCsTsGsGsTsGsAsGstststscsA 3′TOF MS實測=6092.9計算值=6114
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名Novartis AG(B)街道Schwarzwaldallee 215(C)城市巴塞爾(E)國家瑞士(F)郵編(ZIP)4058(G)電話+41 61 324 1111(H)電傳+41 61 322 7532(ⅱ)發明題目用於寡核苷酸合成的中間體(ⅲ)序列數6(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度15個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「寡核苷酸」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:TTTTTCTCTC TCTCT 15(2)SEQ ID NO:2的信息
(ⅰ)序列特徵(A)長度11個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「寡核苷酸」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:TCTCTCTCTC T11(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度16個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「寡核苷酸」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GCGTTTTTTT TTTGCG16(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「寡核苷酸」
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:TTTTTTTTTT TTTTTTTTT 19(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「寡核苷酸」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:TTCTCGCCCG CTCCTCCTCC20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度19個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=「寡核苷酸」(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTCTCGCTGG TGAGTTTCA 19
權利要求
1．一種下式化合物
其中B1是一種核苷鹼的殘基，R1是氫或一種羥基保護基團，R2是氫、羥基或一種2』核苷修飾性原子或基團，R3是一個未發生取代或已發生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，Z是滷素或一個下式基團
其中R4與R5均獨立為一個未發生取代或已發生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C4至C10環烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C13芳烷基，或者R4為所述基團且R5為氫，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個五元至十三元雜環；或者Z是一個下式基團Nuc-O-Ⅲ其中Nuc是一種天然或合成的核苷或寡核苷酸在除去通過5』亞甲基與所示氧原子連接的5』羥基後的殘基。
2．根據權利要求1的化合物，其中已發生取代的基團是被滷素、羥基、C1-C4烷氧基、氰基、硝基或三(C1-C15烴基)甲矽烷基取代的。
3．根據權利要求1或2的化合物，其中R1為氫、一個C7至C40芳脂族基團或一個三(C1-C15烴基)甲矽烷基。
4．根據權利要求3的化合物，其中R1為氫、一個未發生取代或已發生取代的三苯甲基或C1-C6烷基二(C6-C8芳基)甲矽烷基。
5．根據權利要求4的化合物，其中R1為二甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲矽烷基。
6．根據任一項前述權利要求的化合物，其中R2為氫，滷素，羥基或一個式-OR6或-OCOR6基團，其中R6是一個未發生取代或已發生取代的C1至C10烷基、C2至C10鏈烯基、C3至C8環烷基、C4至C10環烷基烷基、C6至C10芳基或C7至C25芳烷基或一個三(C1-C15烴基)甲矽烷基。
7．根據權利要求6的化合物，其中R2為氫，羥基，氟，一個式-OR6基團，其中R6是一個C1至C4烷基、C2至C4鏈烯基、C7至C13芳烷基，或者一個式-(R7-O-)N-R8基團，其中R7為C1至C4亞烷基、R8為C1至C4烷基、n為1至8；或者R2為一個式-OCOR6基團，其中R6是C1至C4烷基或C6至C8芳基。
8．根據權利要求6的化合物，其中R2為氫、羥基、氟、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、苄氧基、甲氧基乙氧基、-O-(CH2-CH2-O-)3-CH3、乙酸基或苯甲酸基。
9．根據任一項前述權利要求的化合物，其中R3是一個未發生取代或已發生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環烷基烷基或C7至C9芳烷基。
10．根據權利要求9的化合物，其中R3為甲基、乙基、2-氰乙基、2,2,2-三氯乙基、烯丙基、苄基或2-(三甲基甲矽烷基)乙基。
11．根據任一項前述權利要求的化合物，其中Z為一個式Ⅱ基團，其中R4與R5獨立為一個未發生取代或已發生取代的C1至C4烷基、C3至C5鏈烯基、C6至C8環烷基烷基或C7至C9芳烷基，或者R4為C1至C4烷基或C7至C9芳烷基，且R5為氫，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個五元或六元雜環，該環中具有一或兩個雜原子。
12．根據權利要求11的化合物，其中R4與R5獨立為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、烯丙基或苄基，或者R4與R5以及它們所連接的氮原子共同表示一個吡咯烷、哌啶或嗎啉環。
13．根據權利要求1至10中任一項的化合物，其中Z為式Ⅲ基團，其中Nuc是附著在一種固相載體上。
14．根據權利要求1的化合物，其中Z為氯或溴。
15．根據任一項前述權利要求的化合物，其為下式化合物
其中B1、R1、R2、R3和Z如任一項前述權利要求所定義。
16．根據權利要求1或15的化合物，其中B1為胸腺嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、或者是在一個氮原子上被一種保護基團取代的胸腺嘧啶基或5-甲基胞嘧啶基；R1為二甲氧基三苯甲基或叔丁基二苯基甲矽烷基；R2為氫；R3為甲基、乙基或2-氰乙基；Z為氯，或者式Ⅱ基團，其中R4與R5均為甲基或異丙基，或者Z為式Ⅲ基團。
17．一種製備權利要求1的化合物的方法，其中Z為式Ⅱ基團，該方法包括使其中Z為滷素的式Ⅰ化合物與下式化合物反應，
其中R4與R5如權利要求1所定義。
18．根據權利要求17的方法，其中該反應是在-78℃至50℃的溫度下、存在一種叔氮鹼的情況下，在一種有機溶劑中進行的。
19．一種製備其中Z為滷素的式Ⅰ化合物的方法，該方法包括用一種非氧化性滷化劑對下式化合物進行非氧化性的滷化反應，
其中B1、R1、R2和R3如權利要求1所定義。
20．根據權利要求19的方法，其中該非氧化性滷化劑是一種滷代正膦。
21．根據權利要求19或20的方法，其中該滷化反應是在-20℃至60℃的溫度下、在一種有機溶劑中、存在一種鹼的情況下進行的。
22．一種製備權利要求1的其中Z為式Ⅲ基團的化合物的方法，該方法包括使其中R1為羥基保護基團且Z為式Ⅱ基團的權利要求1的化合物與一種天然或合成的具有一個游離5』羥基的核苷或寡核苷酸反應。
23．一種製備下式寡核苷酸的方法，
其中B1、R1、R3和Nuc如權利要求1所定義，X為氧或硫，該方法包括使其中Z為式Ⅲ基團的權利要求1的化合物進行氧化反應，得到其中X為氧的式Ⅷ寡核苷酸，或者進行硫化反應，得到其中X為硫的式Ⅷ寡核苷酸。
24．一種製備寡核苷酸的方法，該方法包括使具有一個被保護的5』羥基和一個3』位下式基團的核苷與一種具有一個游離5』羥基的天然或合成的核苷或寡核苷酸進行核苷偶合反應
其中R3、R4和R5如權利要求1所定義，反應生成一種具有一個下式核苷間鍵的寡核苷酸前體
其中R3如權利要求1所定義，再使該前體轉化為一種具有一個下式核苷間鍵的寡核苷酸
其中R3如前文定義，X為氧或硫，該轉化作用是通過氧化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵、其中X為氧的寡核苷酸或硫化該前體得到具有式Ⅺ核苷間鍵、其中X為硫的寡核苷酸而實現的。
25．根據權利要求1的化合物在寡核苷酸合成中的用途。
26．根據權利要求1的化合物，其基本上如任一個實施例所述。
27．根據權利要求17的方法，其基本上如實施例1、2或4-8中任一個所述。
28．根據權利要求19的方法，其基本上如實施例1、2、4、5、6或8中任一個所述。
29．一種根據權利要求22、23或24的方法，其基本上如實施例3與9-15中任一個所述。
全文摘要
一種式Ⅰ化合物,其中B
文檔編號C07H19/16GK1221423SQ9719545
公開日1999年6月30日 申請日期1997年6月3日 優先權日1996年6月13日
發明者S·P·科林格伍德, H·E·莫瑟, K-H·阿爾特曼, M·E·道格拉斯 申請人:諾瓦提斯公司