一種t2多肽合成產物及其應用的製作方法

2023-05-17 21:58:56 2

專利名稱：一種t2多肽合成產物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物醫藥領域中的多肽藥物的開發，具體涉及到設計和製備一種 2拷貝分支肽在臨床上可抑制腫瘤生長和免疫增強劑上的應用。
背景技術：
生物體的遺傳基因被存儲在多聚核苷酸鏈上，遺傳基因編碼著執行生物學功能的 蛋白質。生物體內的蛋白質多種多樣，它們行使著各種生物學功能維持生命活動。蛋白質 的種類雖然多不勝舉，但它們基本上都是由20個自然界存在的天然胺基酸組成。由於氨基 酸的組成和排列順序的差異導致了蛋白質的千差萬別。一般來說，含有50個以上胺基酸的 分子被稱為蛋白質，般超過10個胺基酸的肽鏈被稱為多肽，少於10個胺基酸的肽鏈被稱做 寡肽。目前發現最小的功能小肽只有2個胺基酸，通常較為常見的是4個以上的功能小肽。由於人類基因組計劃的完成和人類蛋白組計劃的開展，將會有越來越多的蛋白質 功能片段被發現並被作為藥物應用到生物醫藥領域中來。蛋白質的功能片段通常是指被發 現具備某種特定生物學功能的直鏈多肽片段，它們通常是幾十個至兩個胺基酸組成的肽類 片段，被鑑定和發現的蛋白質功能片段可通過人工合成的途徑製備。現已開發並在臨床上 得到應用的多肽藥物有「催產素」、「胸腺肽α 1」、「胸腺五肽」等，有在天然肽鏈的基礎上進 行人工改構製備成為用於治療消化道出血和肢端肥大症的多肽藥物「奧曲肽」和抗凝血作 用的「水蛭肽」等。蛋白質中的功能片段常常能篩選到含有幾十個或小到只有二個胺基酸 組成的多肽片段，它們為人工合成多肽功能片段並將它們投入應用奠定了基礎。在蛋白質、多肽或寡肽中，單一胺基酸的缺失、增加或被替換；氨基端(N端)或羧 基端(C端)被封閉；序列中或游離端被化學基團修飾都會使得蛋白質、多肽或寡肽原有的 生物活性發生不可預知的改變。設計、篩選和發現具有新的功能肽段或尋找高效肽段是藥 物開發的一個重要環節。Tuftsin是美國科學家發現的一種來源於脾臟的活性4肽Thr-Lys-Pro-Arg或 TKPR(Life Science, 1981, 26 (10) 1081-1091)。實驗證明 Tuftsin 能使脾內脾小體增多， 生發中心生長活躍，增強粒細胞、單核細胞、巨噬細胞，自然殺傷細胞的趨化、游離、吞噬和 產生細胞毒等作用，提高淋巴系統的細胞免疫功能。Tuftsin不僅促進單核吞噬細胞的MHC 非限制性功能，還促進其限制性的抗原遞呈功能，提高細胞毒作用。本發明涉及設計和製備一種含有2拷貝TIffR片段的肽類分子用以高效提高其免 疫功能及抗腫瘤活性，開發一種可在臨床應用的抗腫瘤藥物和免疫增強劑。

發明內容
本發明的目的在於提供一種2拷貝分支肽及其在抑制腫瘤生長的藥物和免疫增 強劑上的應用，所要解決的技術問題是使該2拷貝分支肽不僅保留功能寡肽的生物學活性 而且顯著提高其生物學活性。本發明的目的及解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的。本發明提出一種2拷貝分支肽，是將具有該胺基酸序列特徵組成的寡肽片段通過具有2個活化氨基可供進 行胺基酸加成縮合反應的賴氨酸(Lys，用>K-表示)連接的橋梁鏈製備成4拷貝分支分 子，其結構通式為=(Xa-Xb-Xc-Xd-X1)2S K-X2,其中，Xa和X。代表極性不荷電胺基酸，包括絲 氨酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，Τ)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、穀氨醯胺(Gln，Q)、天 門冬醯胺(Asn，N) ；Xb和Xd代表鹼性胺基酸包括組氨酸(His，H)、賴氨酸(Lys，K)、精氨酸 (Arg,R) ；K為具有2個活化氨基可供進行胺基酸加成縮合反應的賴氨酸A1和X2分別代表 由0-10個任意胺基酸所構成的胺基酸序列，X1和X2可以是相同胺基酸序列也可以是由不 同的胺基酸組成的序列，其中X1和X2可以不存在，為零。 根據發明提出的2拷貝分支肽(Xa-Xb-Xc-Xd-X1)2 > K-X2所製備出來的TKPR分支 肽(TKPR)2 > K在動物實驗中顯示具明顯的免疫增強抑制腫瘤生長的作用。根據本發明提出的2拷貝分支肽設計通式製備出來的(TKPR)2 > K在動物實驗中 具顯著的免疫增強作用。按照本發明設計通式製備出來的2拷貝分支肽(TKPR)2 > K克服了直鏈寡肽TKPR 進入體內易被降解的缺點，不僅保持了 TIffR片段的免疫增強活性和抗腫瘤作用，而且與 TIffR寡肽相比顯著提高了其生物學活性。按照此方式製備的活性多肽開發成為藥物在體內 的最終降解產物為游離胺基酸，可被機體直接吸收，沒有明顯的藥物殘留和毒副作用，作為 藥物具有良好的安全性，在臨床應用上具有開發潛力。
具體實施例方式本發明給出一個2拷貝分支肽的結構通式(Xa-Xb-Xc-Xd-X1) 2 > K-X2，如 具體給出一個2拷貝分支肽的結構為(TKPR)4 > K2 > K，經過試驗證明該多肽具
有提升免疫力和抗腫瘤的作用，其結構如 為更進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段及功效，以下結合實施例對依據本發明提出的2拷貝分支肽(TKPR)2 > K的設計方式、具體應用、實施方式、 特徵及其功效做以下說明。1963年美國科學家R. B. Merrifield發明創立了將目的肽的羧基端胺基酸的羧基端(C端)固定在不溶性樹脂上，樹脂上結合的胺基酸的氨基端(N端)與有待連接的氨基 酸的羧基端進行縮合反應達到延長肽鏈的固相合成法。多肽合成的順序是從多肽的羧基端 (C端)開始逐個胺基酸縮合連接向肽段的氨基端(N端)方向不斷延伸。當進行胺基酸的 羧基接合反應時要將其氨基和側鏈基團保護起來避免發生反應，目前常用的有叔丁氧羰基 (Boc)保護法和芴甲氧羰基(Fmoc)保護法，因此每連接上一個胺基酸就要經歷一次以結合 在固相載體上的胺基酸作為氨基的脫保護基並同過量的下一個有待連接的胺基酸的活化 羧基發生縮合反應延長肽鏈。通過這樣的步驟反覆地多次地進行下去，即達到縮合_ >洗 滌_ >去保護_ >中和和洗滌_ >下一輪縮合(再接上一個胺基酸)，直至達到所需要合成 的肽鏈長度。多肽合成反應完成後採用TFA法將多肽從固相樹脂上裂解下來，經過高效液相色 譜(HPLC)ClS反相色譜層析分離柱分離純化後最終得到合成產物。基於以上的原理，多肽 合成可以是手工操作合成，也可以採用多肽合成儀經過輸入合成序列和程序自動化合成取 得。如今固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術。本發明所述的多肽合成方式 可採用但並不局限於固相合成方式。這裡需要說明的是4拷貝TKPR分支肽片段的合成方式是通過在賴氨酸上的2個 活化氨基上同時進行胺基酸的縮合反應，並在以後的胺基酸加成縮合反應中同時得到延伸 達到同時合成多拷貝分支肽的目的。在合成直鏈多肽的過程中使用的是只有一個活化氨基 的賴氨酸，其另一個氨基被保護起來所以不能發生縮合反應。當我們需要合成2拷貝分支 肽時，選用兩個氨基均被活化可進行縮合反應的賴氨酸可以縮合連接上2個胺基酸，本文 中用> K-表示。多肽分子是一類具有生物活性的分子，它們的胺基酸序列和結構決定了它們的生 物學作用。多肽合成目前成為常用技術並已有商業化的服務公司可根據客戶的需求提供合 成產物。關於多肽合成及純化的具體細節和原理我們在此不再累敘，請參見由盛樹力主編， 科學技術文獻出版社(1998年)出版的「多肽激素的當代理論和應用」一書。本發明合成 製備分支肽的方式可參照以上固相合成方式但並不局限於此方式。實施例一Tuftsin是脾臟產生的具有免疫增強活性，並顯示出具有抗腫瘤活性的4肽 Thr-Lys-Pro-Arg(TKPR)，為達到製備出高效免疫增強活性和抗腫瘤活性的多肽產物設計 和製備出一種含有TKPR片段的2拷貝分支肽(TKPR)2 > K。按照本發明所述，採用有機化學Fmoc保護的胺基酸固相合成法在多肽自動合成 儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成，反應完成後得到的肽樹脂採用 TFA法將多肽從樹脂上裂解下來。採用Waters高效液相色譜C18反相色譜分離柱分離純 化，收集流出峰溶液，經過冷凍乾燥得到白色絮狀多肽產物。本實施例通過人工固相合成的方式得到多肽TIffR和2拷貝分支肽(TKPR)2 > K， 合成肽產物經高效液相色譜(HPLC)ClS柱以流動相三氟乙酸/乙晴系統分離純化可得到純 度>95.0%的合成產物。實驗目的觀察比較合成產物2拷貝分支肽(TKPR)2 > K與單拷貝寡肽TKPR的對小鼠黑色 素細胞瘤(B16株)移植瘤的抑瘤效果。
藥物合成產物(TKPR)2 > K和TIffR為白色凍乾粉劑，在-20°C避光保存。使用時用生 理鹽水溶解並稀釋至所需濃度。實驗動物C57小鼠30隻，雌雄各半隨機分組，體重18-22克。飼養在有層流系統及屏蔽設 備的層流櫃中，室溫20 士 2°C，相對溼度40-60 %。自由飲水攝食，給予實驗動物標準配方料 塊，飲用蒸餾水。方法每隻小鼠右前肢肩胛部位皮下接種2x106/0. 2ml瘤細胞。給藥方式於接種後的次日開始每3天皮下注射給藥一次，連續4次。末次給藥後第3天採 用頸椎脫白處死小鼠，剝取腫瘤稱重，稱量體重。表1 合成產物對小鼠移植性黑色素細胞瘤(B16)的抑瘤作用 結果評價實驗過程中小鼠無死亡，體重均有增長，各組動物活動正常，藥物注射部位無潰瘍 及紅腫現象發生，提示受試藥物無明顯急性毒性作用。實驗顯示2拷貝分支肽(TKPR)2 >K不僅保留了單拷貝寡肽TIffR的生物活性，而 且顯示出更高的抑瘤活性。實施例二根據本發明提出的2拷貝分支肽設計通式(Xa-Xb-Xc-Xd-X1)2 >K-X2製備出(TKPR)2 > K，其結構如 按照本發明所述，採用有機化學Fmoc保護的胺基酸固相合成法在多肽自動合成 儀(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成，反應完成後得到的肽樹脂採用 三氟乙酸TFA法將多肽從樹脂上裂解下來。採用Waters高效液相色譜儀C18反相色譜柱 以流動相TFA/乙晴系統分離純化，可得到純度> 95. 0%的合成產物，經過冷凍乾燥得到白 色絮狀固體多肽產物。本實施例通過人工固相合成的方式分別得到TIffR和2拷貝分支肽(TKPR)2 > K， 純度> 95.0%的合成產物。實驗方法新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)能夠與雞紅細胞發生凝集現象，這 是一種特異性的抗體中和反應，其原理是根據病毒的血凝素可凝集紅細胞，但若先用特異 性抗體與病毒作用，再加入紅細胞，則不出現紅細胞凝集，稱為血凝抑制試驗(Hl)，檢測所 用的抗血清稀釋的最高倍數即是抗體的滴度。待測抗體的滴度越高說明免疫的效果越好。 HI方法具有以下優點①敏感性強，可以檢測到微量的抗體，結果也較為準確，是較敏感的 血清學反應之一；②特異性強，病毒凝集紅細胞只能被特異的抗體所抑制；③檢測速度快， 1次HI試驗只需2h左右，即可判定結果；④HI試驗對環境要求不高，操作簡單，1次還可檢 測大量的樣品。因此細胞凝集抑制試驗(HI)已經成為一種常用於檢測禽類動物血清抗體 的檢測方法，具體細節請參見由郭鑫主編，中國農業大學出版社2007年出版的「動物免疫 學實驗教程」。試驗目的應用雞新城疫滅活疫苗與2拷貝分支肽(TKPR)2 > K聯合使用並與TKPR做對照， 接種SPF雛雞檢測HI抗體，觀察二者是否具有免疫增強作用及差異。材料與方法選取1月齡左右的SPF雞分為5組，每組10隻。在雞的胸部肌肉接種雞新城疫滅 活疫苗(La Sota 株)0. 3ml。試驗組空白組每隻雞胸部肌肉注射0. 3ml生理鹽水。正常組每隻雞胸部肌肉接種疫苗0. 3ml。試驗組1 每隻雞胸部肌肉接種疫苗0. 3ml，含有合成產物TKPR lug。試驗組2 每隻雞胸部肌肉接種疫苗0. 3ml，含有合成產物(TKPR)2 > K lug。飼養方式各組同時飼養在隔離器內。採血接種後第28天採血，分離血清進行HI試驗。結果檢測結果表明疫苗中添加了 合成產物TKPR或(TKPR)2 > K試驗組的HI抗體滴度 比(TKPR)2 > K組有明顯提高，具體結果見下表表2 免疫後第28日HI結果 正常組 23 43414343 3.1 試驗組 1 4526542435 4.0 試驗組 23434646456 4.5結果評價以上試驗結果顯示合成產物2拷貝分支肽(TKPR)2 > K和TKPR與疫苗聯用均可 提高疫苗的抗體平均滴度，但相比之下(TKPR)2 > K抗體滴度比TKPR明顯提高，試驗動物 未見異常和毒副作用，提示合成產物2拷貝分支肽(TKPR)2 > K具有顯著的免疫增強作用。總結以上2個實施例證明，按照本發明設計通式製備出的(TKPR)2 > K分支肽不僅沒 有消除單拷貝寡肽TKPR的作用，而且更加提高了它的生物活性作用。由此證明按照此通式 (Xa-Xb-Xc-Xd-X1)2 > K-X2設計製備的肽類分子具有免疫增強活性和抗腫瘤活性，其可單獨 成為藥物原料或通過加入製劑輔料製備成為臨床用抑制腫瘤生長的藥物、臨床用免疫增強 齊U，或動物用免疫增強劑。按照本發明設計通式產生的2拷貝分支肽採用如下的化學修飾產生的衍生物用 於抗腫瘤和免疫增強領域的應用1.所述的2拷貝分支肽所帶有的羥基可形成但不限於所形成的醚、酯、苷或甙等 的化合物。2.所述的2拷貝分支肽所帶有的巰基可形成但並不限於所形成的硫醚、硫苷，或 與半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含二硫鍵的化合物。3.所述的2拷貝分支肽所帶有的氨基可形成但不限於所形成的醯化物，烴化物、 與糖類物質所形成的苷類物質等。4.所述的2拷貝分支肽所帶有的羧基可形成但不限於所形成的酯、醯胺類化合物寸。5.所述的2拷貝分支肽所帶有的亞氨基可形成但不限於所形成的苷、醯化物、烴 化物等。6.所述的2拷貝分支肽所帶有的酚羥基可形成但不限於所形成的酯、醚、苷、甙類 化合物，以及與有機鹼或無機鹼所形成的鹽類化合物。7.所述的2拷貝分支肽與有機酸或無機酸所形成的鹽類化合物。8.所述的2拷貝分支肽與金屬離子所形成的配合物、絡合物或螯合物。9.所述的2拷貝分支肽所形成的水合物或溶劑。本發明所述的2拷貝分支肽，例如(TKPR)2 > K經過以上任意一種，或同時含有多 種化學修飾所產生的化學衍生物可作為一種臨床用抑制腫瘤生長的藥物或一種免疫增強 劑。
權利要求
一種2拷貝分支肽，其特徵在於，該多肽的結構通式為(XA-XB-XC-XD-X1)2＞K-X2，其中，XA和Xc代表極性不荷電胺基酸；XB和XD代表鹼性胺基酸；K代表具有2個活化氨基可供進行胺基酸加成縮合反應的賴氨酸(Lys，用＞K-表示)X1和X2分別代表由1-10個任意胺基酸組成的胺基酸序列，X1和X2所代表的胺基酸序列可以相同，也可以不相同。
2.根據權利要求1所述的2拷貝分支肽，其特徵在於，所述的極性不荷電胺基酸是絲氨 酸(Ser，S)、蘇氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、穀氨醯胺(Asn，N)或天 門冬醯胺(Gin, Q)。
3.根據權利要求1所述的2拷貝分支肽，其特徵在於，所述的鹼性胺基酸是組氨酸 (His, H)、賴氨酸(Lys, K)或精氨酸(Arg，R)。
4.根據權利要求1所述的2拷貝分支肽，其特徵在於，蘇氨酸(Thr，T)，XB為賴氨 酸(Lys，K)，Xc為脯氨酸(Pro，P)，Xd為精氨酸(Arg，R)，X1和X2所代表的任意胺基酸數分 別為零，結構表示為(TKPR)2 > K。
5.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽所帶有的羥基可形 成但不限於所形成的醚、酯、苷或甙等的化合物。
6.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽所帶有的巰基可形 成但不限於所形成的硫醚、硫苷或與半胱氨酸或含半胱氨酸的肽所形成的含有二硫鍵的化 合物。
7.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽所帶有的氨基可形 成但不限於所形成的醯化物、烴化物、與糖類物質所形成的苷類物質等。
8.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽所帶有的羧基可形 成但不限於所形成的酯、醯胺類化合物等。
9.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽所帶有的亞氨基可 形成但不限於所形成的苷、醯化物、烴化物等。
10.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽所帶有的酚羥基可 形成但不限於所形成的酯、醚、苷、甙類化合物，與有機鹼或無機鹼所形成的鹽類化合物。
11.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽與有機酸或無機酸 所形成的鹽類化合物。
12.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於所述的多肽與金屬離子所形成 的配合物、絡合物或螯合物。
13.根據權利要求1-4所述的2拷貝分支肽，其特徵在於該多肽所形成的水合物或溶劑物。
14.一種臨床用抑制腫瘤生長的藥物，其特徵在於該藥物包括權利要求1-13任一項所 述的2拷貝分支肽及其化學衍生物。
15.一種臨床用免疫增強劑，其特徵在於該免疫增強劑包括權利要求1-13任一項所述 的2拷貝分支肽及其化學衍生物。
16.一種動物用免疫增強劑，其特徵在於該免疫增強劑包括權利要求1-13任一項所述的2拷貝分支肽及其化學衍生物 。
全文摘要
本發明涉及一種2拷貝分支肽及其應用。該分支肽的結構通式為(XA-XB-XC-XD-X1)2＞K-X2，該分支肽在動物試驗中顯示出明顯的抑制腫瘤生長和免疫增強作用，具有開發成為抗腫瘤藥物和免疫增強劑的潛力。
文檔編號A61P35/00GK101838305SQ20091008029
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月17日 優先權日2009年3月17日
發明者韓蘇 申請人:韓蘇