採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法

2023-05-18 10:58:26 2

專利名稱：採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的方法，具體是一種採用微不定芽技術快速繁殖轉
基因半夏的方法。
背景技術：
半夏CP/"e〃z'a tem加e(T/ww^5enY(^raceae力是天南星科半夏屬多年生植物，主要分布於中國華東、華北以及長江流域。塊莖含揮髮油、少量脂肪(其脂肪酸約34%為固體酸、66%為液體酸)、澱粉、菸鹼、粘液質、天門冬氨酸、穀氨酸、精氨酸、(3-氨基丁酸等胺基酸、(3-谷甾醇、膽鹼、P-谷甾醇-P-D-葡萄糖甙、3， 4-二羥基苯甲醛，又含藥理作用與毒芹鹼及菸鹼相似的生物鹼、類似原白頭翁素刺激皮膚的物質。嫩芽含尿黑酸及其甙。半夏以塊莖入藥，具有燥熱化痰，降逆止嘔，消痞散節的功效，為中國傳統常用藥材。近年來又發現其具有抗腫瘤，抗早孕、護肝、降血脂的作用。半夏在傳統中藥196個處方中出現頻率居於第22位，應用十分廣泛，具有重要藥用價值，社會需求量也很大。
半夏喜生長溪水旁、田間、灌木叢等陰溼的環境下，分塊莖繁殖、珠芽繁殖、種子繁殖，但主要靠珠芽、塊莖行無性繁殖，繁殖係數較低，繁殖周期較長。
近年來由於對半夏需求的不斷增長，人們大量採挖，其野生資源急劇減少；另一方面由於種源缺乏、種質退化及病蟲害等原因制約其種植的規模化，導致半夏資源的嚴重匱乏，成為以半夏為原料的醫藥產品發展的瓶頸。隨著生物技術的發展，植物組織培養技術曰臻成熟，目前已在多種園林、園藝及藥用植物上取得應用。由於半夏本身較高的市場價值，科研人員針對其快速繁殖與培養體系的建立方面展開了大量研究，並取得一系列成果。
現有文獻中目前已有多種植物通過微不定芽技術快速繁殖成完整再生植株的報導。如果能通過微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏，將對保持轉基因半夏的遺傳穩定性，對轉基因半夏的大面積推廣、保障充足優質的半夏種苗、提高產量、縮短繁殖周期具有重要意義。但是現有有報導的植物的微不定芽快速繁殖技術中，它們所選取的生芽培養基、微不定芽誘導培養基、不定芽生根培養基和移栽基質均不適合於轉基因半夏的快速繁殖，目前也尚未發現與本發明主題所提及的採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的相關報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法。本發明中涉及半夏生芽培養基、微不定芽誘導培養基、不定芽生根培養基和移栽基質用於本發明微不定芽組織培養的方法，建立了用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，能夠在短時間內繁殖出大量的轉基因半夏苗，為轉基因半夏的大面積推廣、保障充足優質的半夏種苗、提高半夏產量、縮短繁殖周期奠定了堅實的基礎。
發明是通過以下技術方案實現的本發明將轉基因半夏外植體經過消毒後，置於生芽培養基上，光照培養，生成葉片和葉柄；待頂芽長到4cm-6cm時，切下葉片和葉柄，置於微不定芽誘導培養基上，光照培養，在外植體周圍長出大量微不定芽；待外植體長到3cm-4cm時，將外植體轉移到不定芽生根培養基上，使生成不定根；將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基質的花盆中，通過馴化獲得生長正常的轉基因半夏植株；
所述轉基因半夏外植體的消毒，是指從轉基因半夏植株上剝取外植體，用75%酒精消毒10分鐘，無菌水清洗3遍，0.P/。HgCl2消毒20分鐘，無菌水清洗8遍。
所述外植體為含有頂芽的塊莖，切去表皮部分，切成體積為3cmS-6ci^的小塊。
所述生芽培養基是在MS培養基中添加1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤、1.0 mg/L萘乙酸、30g/L庶糖和8.5g/L瓊脂粉。其中MS培養基為Murashige and Skoog於1962公布。
所述經光照培養，生成葉片葉柄，是指培養溫度為25'C士rC，每天光照16小時，1.0天後外植體長出4cm-6cm的頂芽。
所述待頂芽長到4cm-6cm時，切下葉片和葉柄是指切下幼嫩的葉片和葉柄，葉柄長lcm-2cm、葉片面積為2 cm2 -4 cm2 。
所述微不定芽誘導培養基是在MS培養基中添加2.0mg/L6-苄基腺嘌呤、0.1 (葉片)/0.25 (葉柄)mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉；
所述經光照培養，在外植體周圍長出大量微不定芽，是指培養溫度為25°c±rc，每天光照16小時，每14天-20天繼代培養一次，經過1次繼代培養後在外植體周圍長出大量微不定芽。
所述不定芽生根培養基是在1/2 MS培養基中添加激動素1.0 mg/L、萘乙酸2.0mg/L、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉；
所述經光照培養，使生成不定根，是指培養溫度為25'C土rC ，每天光照16小時，經過20天使不定芽生根，從而形成完整的半夏植株。
所述將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基質的花盆中，是指選取生長健壯的植株，移栽到裝有移栽基質的穴盤中。
所述移栽基質為蛭石泥土，蛭石和泥土的體積比為l: 2。本發明採用微不定芽組織培養的方法，篩選出適合轉基因半夏微不定芽誘導和生根的培養基，轉基因半夏外植體微不定芽誘導率達到90%以上，不定芽生根率為90%，再生植株移栽存活率為90%，繁殖係數達到80%以上，轉基因半夏微不定芽快速繁殖技術的建立，為快速繁殖出大量的轉基因半夏苗，對轉基因半夏的大面積推廣、保障充足優質的半夏種
苗、提高半夏產量、縮短繁殖周期具有重要意義。
具體實施例方式
下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。實施例1 :
轉基因半夏外植體的消毒和微不定芽的誘導
從轉基因半夏植株上剝取含有頂芽的塊莖作為外植體。從轉基因半夏植株上剝取外植
體，用75%酒精消毒10分鐘，無菌水清洗3遍，0.1% HgCh消毒20分鐘，無菌水清洗8遍。將消毒好的帶有頂芽的塊莖，切去表皮部分，切成體積為3ci^-6cmS的小塊。轉移到生芽培養基上，所述生芽培養基是在MS培養基中添加1.0mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)、1.0mg/L萘乙酸(NAA)、 30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得到。光照培養，培養溫度為25°C±1°C，每天光照16小時，10天後外植體長出4cm-6cm的頂芽。待頂芽長到4cm-6cm時，切下幼嫩葉柄和葉片，葉柄長lcm、葉片面積為2cm2。轉移到微不定芽誘導培養基，所述微不定芽誘導培養基是在MS培養基中添加2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)、 0.1/0.25mg/L萘乙酸(NAA)(若從葉片誘導微不定芽要添加0.1mg/L萘乙酸，若從葉柄誘導微不定芽要添加0.25 mg/L萘乙酸)、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得到；光照培養，培養溫度為25。C士rC，每天光照16小時，每20天繼代培養一次，經過1次繼代培養後在外植體周圍長出大量微不定芽。微不定芽誘導率達到93%。轉基因半夏不定芽的生根
待不定芽長到3cm-4cm時，將大量不定芽轉移到不定芽生根培養基上，所述不定芽生根培養基是在1/2MS培養基中添加激動素1.0mg/L(KT)、萘乙酸2.0mg/L(NAA)、 30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉，經光照培養，培養溫度為25°C±1°C ，每天光照16小時，經過20天使不定芽生根，從而形成完整的半夏植株。
轉基因半夏再生植株的移栽
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養基，移栽到裝有移栽基質的穴盤中，所述移栽
基質為蛭石泥土，蛭石和泥土的體積比為l: 2。通過馴化1周，可獲得大量生長正常的轉基因半夏植株，移栽存活率為90%，繁殖係數達到84% 。實施例2 :
轉基因半夏外植體的消毒和微不定芽的誘導
從轉基因半夏植株上剝取含有頂芽的塊莖作為外植體。從轉基因半夏植株上剝取外植體，用75%酒精消毒10分鐘，無菌水清洗3遍，0.1% HgCl2消毒20分鐘，無菌水清洗8遍。將消毒好的帶有頂芽的塊莖，切去表皮部分，切成體積為3cmS-6cri^的小塊。轉移到生芽培養基上，所述生芽培養基是在MS培養基中添加1.0mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)、1.0mg/L萘乙酸(NAA)、 30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得。光照培養，培養溫度為25。C士TC，每天光照16小時，10天後外植體長出4cm-6cm的頂芽。待頂芽長到4cm-6cm時，切下幼嫩葉柄和葉片，葉柄長1.5cm、葉片面積為3 cm2 。轉移到微不定芽誘導培養基，所述微不定芽誘導培養基是在MS培養基中添加2.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA) 、 0.1/0.25mg/L萘乙酸(NAA)(若從葉片誘導微不定芽要添加0.1mg/L萘乙酸，若從葉柄誘導微不定芽要添加0.25 mg/L萘乙酸)、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得；光照培養，培養溫度為25°C±1°C，每天光照16小時，每20天繼代培養一次，經過l次繼代培養後在外植體周圍長出大量微不定芽。微不定芽誘導率達到96%。
轉基因半夏不定芽的生根
待不定芽長到3cm-4cm時，將大量不定芽轉移到不定芽生根培養基上，所述不定芽生根培養基是在1/2MS培養基中添加激動素1.0 mg/L(KT)、萘乙酸(NAA)2.0mg/L、 30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得，經光照培養，培養溫度為25。C土rC ，每天光照16小時，經過20天使不定芽生根，從而形成完整的半夏植株。
轉基因半夏再生植株的移栽
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養基，移栽到裝有移栽基質的穴盤中，所述移栽
基質為蛭石泥土，蛭石和泥土的體積比為l: 2。通過馴化1周，可獲得大量生長正常的
轉基因半夏植株，移栽存活率為90%，繁殖係數達到86% 。
實施例3:
轉基因半夏外植體的消毒和微不定芽的誘導
從轉基因半夏植株上剝取含有頂芽的塊莖作為外植體。從轉基因半夏植株上剝取外植
體，用75。/。酒精消毒10分鐘，無菌水清洗3遍，0.1% HgCl2消毒20分鐘，無菌水清洗8遍。將消毒好的帶有頂芽的塊莖，切去表皮部分，切成體積為3cm、6cmS的小塊。轉移到生芽培養基上，所述生芽培養基是在MS培養基中添加1.0mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)、1.0mg/L萘乙酸(NAA)、 30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得。光照培養，培養溫度為25。C士rC，每天光照16小時，IO天后外植體長出4cm-6cm的頂芽。待頂芽長到4cm-6cm時，切下幼嫩葉柄和葉片，葉柄長2cm、葉片面積為4cm2。轉移到微不定芽誘導培養基，所述微不定芽誘導培養基是在MS培養基中添加2.0 mg/L 6-節基腺嘌呤(6-BA) 、0.1/0.25 mg/L萘乙酸(NAA)(若從葉片誘導微不定芽要添加O.lmg/L萘乙酸，若從葉柄誘導微不定芽要添加0.25mg/L萘乙酸)、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得；光照培養，培養溫度為25°C±rC，每天光照16小時，每20天繼代培養一次，經過l次繼代培養後在外植體周圍長出大量微不定芽。微不定芽誘導率達到100%。轉基因半夏不定芽的生根
待不定芽長到3cm-4cm時，將大量不定芽轉移到不定芽生根培養基上，所述不定芽生根培養基是在1/2MS培養基中添加激動素1.0mg/L(6-BA)、萘乙酸(NAA)2.0mg/L、 30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉而得，經光照培養，培養溫度為25。C土rC ，每天光照16小時，經過20天使不定芽生根，從而形成完整的半夏植株。
轉基因半夏再生植株的移栽；
選取生長健壯的植株，洗去根部的培養基，移栽到裝有移栽基質的穴盤中，所述移栽基質為蛭石泥土，蛭石和泥土的體積比為l: 2。通過馴化1周，可獲得大量生長正常的轉基因半夏植株，移栽存活率為90%，繁殖係數達到90% 。
上述實施例可以快速繁殖出大量的轉基因半夏植株，對於轉基因半夏的大面積推廣、保障充足優質的半夏種苗、提高半夏產量、縮短生長周期具有重要意義。
權利要求
1.一種採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵在於，將轉基因半夏外植體經過消毒後，置於生芽培養基上，光照培養，生成葉片和葉柄；待頂芽長到4cm-6cm時，切下葉片和葉柄，置於微不定芽誘導培養基上，光照培養，在外植體周圍長出大量微不定芽；待外植體長到3cm-4cm高時，將外植體轉移到不定芽生根培養基上，使生成不定根；將生長健壯的完整植株再移栽到盛有移栽基質的盆中，通過馴化獲得生長正常的轉基因半夏植株；所述生芽培養基為在MS培養基中添加1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、1.0mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉；所述微不定芽誘導培養基為在MS培養基中添加2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉、若從葉片誘導微不定芽要添加0.1mg/L萘乙酸，若從葉柄誘導微不定芽要添加0.25mg/L萘乙酸；所述不定芽生根培養基為在1/2MS培養基中添加激動素1.0mg/L、萘乙酸2.0mg/L、30g/L蔗糖和8.5g/L瓊脂粉。
2. 根據權利要求1所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是，所述轉基因半夏外植體的消毒，是指從轉基因半夏植株上剝取外植體，用酒精消毒，無菌水清洗，再HgCl2消毒，無菌水清洗。
3. 根據權利要求2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是，先ffl體積濃度75%酒精消毒10分鐘，無菌水清洗3遍，再用質量濃度0.1% HgCl2消毒20分鐘，無菌水清洗8遍。
4. 根據權利要求1或2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是，所述外植體為含有頂芽的地下塊莖，切去表皮部分，切成體積為3cn^-6cmS的小塊。
5. 根據權利要求1或2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法,其特徵是，所述待頂芽長到4cm-6cm時，切下葉片和葉柄是指切下幼嫩葉片和葉柄，葉柄長lcm-2cm、葉片面積為2cm2-4cm2 。
6. 根據權利要求1或2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是，所述經光照培養，生成葉片和葉柄，是指培養溫度為25i:士rc，每天光照16小時，10天後外植體長出4cm-6cm的頂芽。
7. 根據權利要求1或2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是,所述經光照培養，在外植體周圍長出大量微不定芽，是指培養溫度為25'c士rc，每天光照16小時，每14天-20天繼代培養一次，經過l次繼代培養後在外植體周圍長出大量微不定芽。
8. 根據權利要求1或2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是， 所述經光照培養，使生成不定根，是指培養溫度為25。C士rC ，每天光照16小時，經 過20天使不定芽生根，從而形成完整的半夏植株。
9. 根據權利要求1或2所述採用微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法，其特徵是， 所述移栽基質為蛭石和泥土，兩者的體積比為l: 2。
全文摘要
本發明是一種採用生物技術領域的微不定芽技術快速繁殖轉基因半夏的方法。本發明將轉基因半夏外植體經過消毒後，置於生芽培養基上，光照培養，生成葉片和葉柄；待頂芽長到4-6cm時，切下葉片和葉柄，置於微不定芽誘導培養基上，光照培養，在外植體周圍長出大量微不定芽；待外植體長到3-4cm時，將外植體轉移到不定芽生根培養基上，使生成不定根；將生長健壯的完整植株移栽到盛有移栽基質的花盆中，通過馴化獲得生長正常的轉基因半夏植株；本發明篩選出適合轉基因半夏微不定芽誘導和生根的培養基，轉基因半夏外植體微不定芽誘導率達到90％以上，不定芽生根率為90％，再生植株移栽存活率為90％，繁殖係數達到80％以上。
文檔編號A01H4/00GK101595844SQ200910104200
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月29日 優先權日2009年6月29日
發明者敏 孫, 廖志華, 彭靜葉, 曾令江, 楊春賢, 陽義健, 敏 陳 申請人:西南大學