含有用於調節血管發育的egfl7拮抗劑的組合物及方法

2023-05-18 00:49:16

專利名稱：含有用於調節血管發育的egfl7拮抗劑的組合物及方法
技術領域：
本發明通常涉及用於調節血管發育的組合物和方法。具體而言，本發明涉及EGF-樣結構域7 (EGFL7)，一種新型內皮細胞-衍生的分泌因子。本發明還涉及與血管生成有關的病症及疾病的診斷和治療。
背景技術：
血管供給的發育是許多生理和病理過程的基本需要。活躍的生長組織例如胚胎和腫瘤需要足夠的血液供給。它們通過生成促血管生成因子滿足這種需要，該因子通過一種稱為血管生成的過程促進新血管形成。血管形成是一個複雜但有順序的生物學事件，包括所有或多種下列步驟a)內皮細胞(EC)從現有EC增殖或從祖細胞分化而來；b)EC遷移並聚結(coalesce)成索(cord)-樣結構；c)然後血管索經過血管生成(tubulogenesis)形成具有中央腔的管；d)現存的血管索或血管出芽(sprout)形成次級管；e)初級(primitive) 血管叢經過進一步重塑和整形(reshaping);以及f)募集(recruited)內皮周細胞(peri-endothelial cell)包裹內皮管，為該管提供保護和調節作用；這類細胞包括小毛細血管的外膜細胞、較大血管的平滑肌細胞、以及心臟中的心肌細胞。Hanahan，D. Science277:48-50 (1997);Hogan, B. L. Kolodziej, P. A. Nature Reviews Genetics. 3:513-23(2002);Lubarsky, B. & Krasnow, M. A. Cell. 112:19-28(2003)。現在已經很清楚血管生成與多種病症的發病機理有關。這些病症包括實體腫瘤和轉移、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生(retrolental fibroplasias)、血管瘤、慢性炎症、眼內新生血管性疾病例如增生性視網膜疾病，例如糖尿病性視網膜疾病、年齡-有關的黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、移植角膜及其他組織的免疫排斥、類風溼性關節炎和牛皮癬。Folkman et al. , J. Biol. Chem. , 267:10931-10934(1992);Klagsbrunet al. , Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991);和 Garner A.，"Vasculardiseases", In:Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach.GarnerA. , Klintworth GK, eds. , 2nd Edition(Marcel Dekker, NY, 1994)，ppl625_1710。就腫瘤生長而言，血管生成對於從增生到腫瘤形成的轉變起著決定性作用，並為腫瘤的生長和轉移提供營養。Folkman et al. , Nature 339:58(1989)。新血管形成能使腫瘤細胞與正常細胞相比獲得生長優勢及增殖自主性。腫瘤通常由單個異常細胞開始，其與可利用的毛細血管床的距離決定該細胞只能增殖至幾立方毫米大小，並且其能保持「休眠」，而長時間不再生長和擴散。然後一些腫瘤細胞轉變成血管生成表型來活化內皮細胞，所述內皮細胞增殖並成熟為新的毛細血管。這些新生成血管不僅可以使原發腫瘤繼續生長，而且還可使轉移性腫瘤細胞擴散和重建群(recolonization)。因此，現已發現腫瘤切面中的微血管密度與乳腺癌及其他幾種腫瘤的患者的存活率相關。Weidner et al.，N.Engl. J. Med 324:1-6(1991);Horak et al. , Lancet340:1120-1124(1992);Macchiarini etal.，Lancet 340:145-146 (1992)。控制血管生成開關的精確機制還沒有研究透徹，但是人們認為腫瘤團塊(mass)的新生血管形成源自大量血管生成激活劑和抑制劑的淨差平衡(net balance)(Folkman, 1995, Nat Medl(I):27-31)。血管發育過程受到嚴密調節。迄今為止已發現許多分子，其中主要是周圍細胞產生的分泌因子，參與調節EC分化、增殖、遷移 和聚結成為索-樣結構。例如，已經認定血管內皮生長因子(VEGF)是參與刺激血管生成和誘導血管通透性的關鍵因子。Ferraraet al·，Endocr. Rev. 18:4-25(1997)。甚至單個VEGF等位基因的損失都會引發胚胎死亡，這一發現表明該因子在血管系統的發育和分化過程中發揮著不可替代的作用。另外還發現VEGF是腫瘤及眼內病症有關的新血管生成的關鍵介質。Ferrara et al. , Endocr.Rev.同上文。VEGF mRNA在大多數被檢查的人腫瘤中過表達。Berkman et al. , J.Clin. Invest. 91:153-159 (1993);Brown et al. , Human Pathol. 26:86-91 (1995);Brownet al. , Cancer Res. 53:4727-4735(1993) ;Mattern et a I. , Brit. J.Cancer73:931-934(1996);Dvorak et al. , Am. J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)。另外，VEGF在房水中的濃度與在患糖尿病和其它缺血-相關性視網膜疾病的患者中存在的血管活性增生是高度相關的。Aiello et al.，N. Engl.J. Med. 331:1480-1487(1994)。另外，研究證明VEGF在患AMD的患者中脈絡叢新血管形成膜中的定位。Lopez et al. , Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:855-868 (1996) 抗-VEGF中和抗體可抑制裸鼠體內各種人腫瘤細胞系的生長(Kimet al, Nature362:841-844(1993) ; Warrenet aL, J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995) ; Borgstrom etal. , Cancer Res. 56:4032-4039(1996);Melnyk et al. , Cancer Res. 56:921-924 (1996))，還能抑制缺血性視網膜病症模型中的眼內血管生成。Adamis et al. , Arch.Ophthalmol. 114:66-71(1996)。因此，抗-VEGF單克隆抗體或其他VEGF作用的抑制物是治療腫瘤及各種眼內新生血管性病症的有效候選物。這類抗體的描述見，例如，1998年I月14 日公開的 EP 817, 648;以及 1998 年 10 月 15 日公開的 W098/45331 和 W098/45332。一種抗-VEGF抗體bevacizumab已經被FDA批准與化療方案聯合用於治療轉移性結腸直腸癌(CRC)。許多進行中的臨床試驗中正在研究用bevacizumab治療各種癌症適應症。大家都知道細胞外基質(ECM)在血管生成過程中起著重要作用。Madri，Transpl.Immunol. 5:179-83 (1997)。在其遷移過程中ECs被臨時的ECM包圍，並在生成腔管後吸附至新合成的血管基質膜。除了在毛細血管形態發生中充當骨架之外，ECM還對ECs功能發揮複雜的局部控制作用。例如，ECM能調節ECs對可溶性血管生成介質的獲取，並將與整聯蛋白和細胞粘附分子的相互作用的特性及類型特化。另外還發現通過生長因子受體與整聯蛋白之間的協作調節EC存活，反過來它們受局部ECM的組成所調控。Stupack andCheresh, Oncogene 22:9022-29(2003)。儘管血管生成領域取得了很多進展，但是脈管形成過程中的一些步驟還知之甚少。具體而言，對下列事件幾乎一無所知如何調節血管生成(tubulogenesis),血管索如何發展成為血管，以及什麼因子調節這種轉換。鑑於血管生成在許多疾病和病症中的作用，因此期望有一種方法可減少或抑制導致這些過程的一種或多種生物學作用。另外還期望有一種方法來測定正常和患病尤其是癌症情況下致病性多肽是否存在。另外還需要鑑定靶標從而開發出能提高現有抗-血管生成療法效力的方法。發明概述本發明是基於對一種新的EC-衍生的分泌因子(EGFL7)的鑑定和表徵。EGFL7在與組織增殖相關的脈管系統中以高水平表達，在正常成熟組織的大部分成熟血管中表達下調。EGFL7功能的喪失導致動物胚胎明顯的血管缺乏並抑制腫瘤生長。EGFL7根據其結構、表達和活性被認為是一種新的ECM分子。此外，還發現EGFL7支持EC粘附和遷移，對腫瘤血管生成中的血管生成因子起配合作用。另一方面，發現EGFL7拮抗劑能有效阻斷EGFL7-相關的EC粘附和遷移。因此，本發明提供了新的組合物及其用於調節(例如，促進或抑制)與血管生成有關的過程的用途。在一個實施方案中，本發明提供了一種組合物，其中含有與可藥用載體混合的EGFL7拮抗劑。一方面，該組合物含有治療有效量的所述拮抗劑。另一方面，該組合物還含·有另一種活性成分，例如，抗-血管生成藥劑。優選地，該組合物是無菌的。所述EGFL7拮抗劑可以用液體藥物配製劑的形式施用，以此形式保存可具有更高的儲藏穩定性。保存型液體藥物配製劑可以包含多劑量的EGFL7拮抗劑，因此適於重複使用。在一個優選實施方案中，所述組合物含有一種抗體，該抗體是單克隆抗體、抗體片段、人源化抗體、或單-鏈抗體。在另一個實施方案中，本發明提供了一種製備用於治療血管生成相關性病症的組合物的方法，該方法包括將可藥用載體與治療有效量的EGFL7拮抗劑混合。另一方面，本發明提供了一種製品，其中含有(a)含EGFL7拮抗劑的組合物；(b)容納所述組合物的容器；和(C)附著於所述容器的標籤，或所述容器內包括的包裝插頁，其表明所述EGFL7拮抗劑在治療血管生成相關的病症中的用途，所述拮抗劑可以是結合EGFL7並阻斷其活性的抗體。所述組合物可以包含治療有效量的所述EGFL7拮抗劑。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用於鑑定可抑制EGFL7多肽活性的化合物的方法，該方法包括讓待測化合物與EGFL7多肽接觸，在一定條件作用足夠長的時間，來使所述測試化合物與多肽相互作用，然後測定所述EGFL7多肽的活性是否受到抑制。在一個具體優選的方面，所述被測化合物或所述EGFL7多肽固定於固相支持物上。在另一個優選的方面，所述非-固定成分帶有可檢測標記物。在一個優選的方面，這種方法包括下列步驟(a)在有EGFL7多肽存在並適於誘導通常由EGFL7多肽誘導的細胞應答的條件下，讓細胞和待篩選的待測化合物接觸；以及(b)通過測定所述細胞應答的誘導情況從而確定所述待測化合物是否是一種有效拮抗劑。另一個優選方面，該方法還包括下列步驟(a)在有EGFL7多肽存在並適於EGFL7多肽刺激細胞增殖的條件下，讓細胞和待篩選的被測化合物接觸；以及(b)通過測量細胞增殖情況從而確定所述待測化合物是否是一種有效拮抗劑。能抑制EGFL7 —種或多種功能或活性的EGFL7多肽拮抗劑的一種類型是抗體。因此，另一方面，本發明還提供了一種結合EGFL7多肽的分離的抗體。一個優選的方面，所述抗體是單克隆抗體，優選具有非-人互補決定區(CDR)殘基和人骨架區(FR)殘基。所述抗體可以是經過標記的，並且可以被固定在固相支持物上。另一方面，所述抗體是抗體片段、單鏈抗體、人源化抗體、或人抗體。優選地，所述抗體特異性地結合所述多肽。另一方面，本發明提供了一種診斷哺乳動物的心血管、內皮或血管生成病症的方法，該方法包括，分析在(a)獲自所述哺乳動物的組織細胞待測樣本和(b)已知同種細胞類型的正常組織細胞的對照樣本中的EGFL7多肽編碼基因的表達水平，其中與對照樣本相比待測樣本中表達水平較高或較低表明所述哺乳動物患有心血管、內皮或血管生成病症。可選擇地，可以任選通過測量與對照樣本相比待測樣本中的mRNA或多肽水平來測定EGFL7多肽編碼基因的表達。另一方面，本發明還提供了一種診斷哺乳動物的心血管、內皮或血管生成病症的方法，其中包括檢測獲自所述哺乳動物的組織細胞待測樣本中是否存在EGFL7多肽，其中所述待測樣本中EGFL7多肽是否存在表明所述哺乳動物患有心血管、內皮或血管生成病 症。在另一實施方案中，本發明提供了一種診斷哺乳動物的心血管、內皮或血管生成病症的方法，該方法包括(a)讓抗-EGFL7抗體與獲自所述哺乳動物的組織細胞待測樣本接觸，和(b)檢測所述抗體與待測樣本中EGFL7多肽之間的複合體形成，其中所述複合體的形成表明所述哺乳動物患有心血管、內皮或血管生成病症。所述檢測可以是定性的或定量的，通過與細胞類型相同的巳知正常組織細胞對照樣本中複合體形成監測情況進行對比來進行。待測樣本中複合體形成數量的較多或較少表明獲取所述組織細胞的哺乳動物患有心血管、內皮或血管生成機能障礙。所述抗體優選帶有可檢測的標記物。複合物形成的監測，例如，可以通過光學顯微鏡，流式細胞術，螢光測定法，或者其他本領域已知技術。待測樣本通常獲自懷疑患有心血管、內皮或血管生成病症的個體。另一個實施方案中，本發明提供了一種測定樣本中EGFL7多肽存在的方法,該方法包括將懷疑含有EGFL7多肽的樣本暴露於抗-EGFL7抗體，然後測定所述抗體與所述樣本成分間的結合。在一具體方面，所述樣本含有疑似含有EGFL7多肽的細胞，且所述抗體結合所述細胞。所述抗體優選是可檢測標記的和/或結合於固相支持物。另一方面，本發明提供了一種心血管、內皮或血管生成病症的診斷試劑盒，其中包括合適包裝的抗-EGFL7抗體和載體。優選地，這類試劑盒還包含使用所述抗體檢測EGFL7多肽存在的說明書。優選地，所述載體諸如為緩衝液。優選地，所述心血管、內皮或血管生成病症是癌症。另一實施方案中，本發明提供了一種減少或抑制具有血管生成相關性病理狀況的受試者的血管生成的方法，該方法包括向所述受試者施用能干擾EGFL7-誘導的內皮細胞遷移的EGFL7拮抗劑，從而減少或抑制所述受試者的血管生成。優選地所述EGFL7拮抗劑是抗-EGFL7抗體。所述拮抗劑的幹擾EGFL7-誘導的EC遷移的能力可以通過例如體外細胞遷移試驗進行檢測。在一個優選的實施方案中，所述血管生成相關性病理狀況是癌症。在另一個優選的實施方案中，所述血管生成相關性病理狀況是眼內新生血管性疾病。在另一優選的實施方案中，所述EGFL7拮抗劑與另一抗-血管生成藥劑如抗-VEGF抗體(包括bevacizumab)共同施用。另外，本發明還提供了一種增強抗-血管生成藥劑治療對具有血管生成相關性病理狀況的受試者的效力的方法，該方法包括向所述受試者聯合施用EGFL7拮抗劑和抗-血管生成藥劑。所述方法可用於治療癌症或眼內新生血管性疾病，特別是那些對單用抗-血管生成藥劑治療反應不佳的疾病或疾病階段。所述抗-血管生成藥劑可以是能夠減少或抑制血管生成的任一藥劑，包括VEGF拮抗劑例如抗-VEGF抗體。在治療腫瘤時，單獨使用或與抗-血管生成藥劑聯用的EGFL7拮抗劑可以進一步與包括一種或多種化療劑的化療方案聯合。另外還可聯合放射性治療以增強效力。另一實施方案中，本發明提供了一種用於促進哺乳動物血管形成的方法，該方法包括向哺乳動物施用EGFL7多肽或EGFL7多肽激動劑，其中所述哺乳動物中血管形成受到激發。優選地，所述哺乳動物是人。另一實施方案中，本發明提供了一種用於刺激哺乳動物血管生成的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的EGFL7多肽或其激動劑。優選地，所述哺乳動物是人，並且更優選血管生成能有效促進組織再生或傷口癒合。 另一實施方案中，本發明提供了一種用於調控(例如，抑制或刺激)哺乳動物血管形成的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用含有EGFL7多肽、其激動劑或其拮抗劑的組合物。另一實施方案中，本發明提供了一種通過調控(例如，誘導或減少)內皮細胞遷移從而調控(例如，誘導或減少)哺乳動物血管生成的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用EGFL7多肽、其激動劑或其拮抗劑，其中所述哺乳動物的內皮細胞遷移受到調控。


圖Ia和b顯示EGFL7在脊椎動物進化過程中是保守的。a:人、小鼠、爪蟾(Xenopus)和斑馬魚EGFL7s的胺基酸比對。所述EGFL7基因編碼一種推定的 30kD的分泌型蛋白質。人(人(Homo sapiens))與小鼠(小鼠(Mus musculus))、娃(非洲蟾蜍(XenopusIaevis))、斑馬魚(斑馬劍· (Danio rerio))的胺基酸序列的同源性分別為77. 45%、47. 14%和42. 96%。使用多種算法作結構分析預測EGFL7蛋白質含有下列結構域(在閱讀框內從N'-末端開始)信號序列、EMI結構域a、位於中部的兩個EGF-樣結構域，後接富含亮氨酸和纈氨酸的C-末端區域。b:斑馬魚EGFL7cDNA，胺基酸，和內含子序列。標有箭頭的線條指示的為兩個反義寡聚物AS_47(SEQ ID NO 6) AS195(SEQ ID NO 7),以及用於檢測內含子保留的PCR引物。圖2a_n圖示的是EGFL7表達圖譜。小鼠(a_b)和斑馬魚(j_n)胚胎的EGFL7整裝(whole mount)原位雜交。b:用核堅牢紅(nuclear-fast-red)染色的橫切片。RBC=紅細胞。jn:亮箭狀物=側板(lateral plate)中胚層，暗箭狀物=背主動脈,暗箭頭=ISVs。嵌入圖(inset):軀幹的特寫。n:cloche突變體。so=體節。c:對EGFL7和PECAM染色的懷孕小鼠子宮。方框(bracket) =脫膜。d_i :人肺切片的放射性原位雜交(g_i)和H&E(d_f)。標尺O. 45mm (a, m, η), O. 07mm (b), O. 38mm (c_i), 0. 25mm (j, I), 0. 15mm (k), 0. 26mm (m 嵌入圖)，和0. 04mm (c嵌入圖)。圖3a_d顯示EGFL7基因敲除導致斑馬魚胚胎的血管生成缺陷。用對照(Con_47或Con195)或EGFL7反義(AS_47或AS195)寡聚物注射斑馬魚胚胎。a:48hpf時的整體形態學。箭狀物標明心包水腫，箭頭標明出血。b_d: flil在23hpf (b)和30hpf (c_d)時的表達。d:c的方框中中段軀幹脈管系統的特寫圖。白色箭頭背主動脈的管腔，黑色箭頭後主靜脈的管腔，黑色箭狀物節間血管。標尺:0. 6mm(a), O. 23mm(d)和0.5mm(b，c)。圖4a_h顯示EGFL7KDs中EC數目未改變。在22-體節(a_d)或30hpf (e_h)時，對注射了對照(a, C，e, g)或反義(b，d，f，h)寡聚物的flkl: GFP轉基因魚進行分析。a，b:背視圖。e，f :側視圖。c，d，g，h:是在a-b中白線標明的水平上製作的橫向切片，e-f用鬼筆毒環肽和DAPI復染。PD:原腎管，So:體節，N:脊索，白色箭狀物動脈ECs，白色箭頭=靜脈 ECs, DA=背主動脈，PCV=後主靜脈。標尺:0. 33mm(a, b), O. 03mm(c, d, g, h), 0. 47mm(e, f) ο圖5a_g顯示EGFL7促進EC的粘附。人臍帶血管內皮細胞(HUVEC)的粘著斑蛋白染色顯示纖連蛋白(b)、I型膠原蛋白(c)和EGFL7(d)上形成粘著斑，而BSA(a)上沒有。對EGFL7的粘附強度弱於對膠原蛋白或纖連蛋白的粘附強度，因為於46g離心後粘附在EGFL7基質上的細胞較少(e)。抗-EGFL7抗體以劑量-依賴性方式封閉HUVEC對EGFL7 的粘附，而不是對纖連蛋白的粘附，這驗證了基質的特異性。對照抗體(抗-B7x)對任一基質都沒有影響(f)。g:在不同基質上HUVEC粘附的動力學。標尺0.03mm(a-d)。圖6圖示的是EGFL7+純合(n=ll)和EGFL7+/_雜合(n=ll)敲除小鼠中B16黑素瘤腫瘤的生長速率比較。圖7A-7B圖示的是對EGFL7+純合敲除小鼠(η=I O)與其野生型同窩動物(Iittermate) (η=13)中Β16黑素瘤腫瘤的發病率和生長速率的比較。圖7Β中不包括無腫
瘤小鼠。發明詳述定義除另有說明外，本申請中的科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。參見，例如，Singleton et al. , Dictionary of MicrobioloRYand Molecular BioloRY 2nd ed. , J. ffiley&Sons(New York,NY1994);Sambrook etal.,Molecular CloninR, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (ColdSprings Harbor, NY 1989)。為了本發明，下列術語定義如下。在本文中，術語「EGFL7」和「EGFL7多肽」交互使用，是指天然序列EGFL7、EGFL7變體和嵌合EGFL7，這些術語在本申請中都有定義。任選地，所述EGFL7與天然糖基化無關。「天然糖基化」是指當EGFL7在哺乳動物細胞中生成，特別是在自然生成EGFL7的細胞中時，糖部分共價連接於EGFL7。因此，用非-人細胞製備的人EGFL7可以是「與天然糖基化無關」的EGFL7的實例。有時所述EGFL7可以完全未糖基化，例如當在原核細胞例如大腸桿菌中生成時。EGFL7核酸是編碼上述EGFL7多肽的RNA或DNA，或者能與所述DNA或RNA雜交且在嚴謹雜交條件下穩定結合的的RNA或DNA，其長度大於約10個核苷酸。嚴謹條件是指⑴使用低離子強度和高溫洗滌，例如，0. 15M NaCl/0. 015M檸檬酸鈉/0. l%NaDodS04,50° C，或(2)在雜交過程中使用變性劑例如甲醯胺，例如50%(vol/vol)甲醯胺與0. 1%牛血清白蛋白/0. l%Ficoll/0. 1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6. 5)，和750mM似(1，751111檸檬酸鈉，42° C0
當與另一核酸序列發生功能關聯時，核酸與其可操作地連接。EGFL7核酸可以在載體中與另一核酸序列可操作地連接，從而可以表達於具體宿主生物體中。這些都可以使用本領域熟知方法實現。例如，如果表達為參與多肽分泌的前蛋白，前序列或分泌性前導序列的DNA會可操作地連接該多肽的DNA;如果影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子會可操作地連接該序列；或如果位於利於翻譯的位置，那麼核糖體結合位點會可操作地連接編碼序列。通常，「可操作地連接」意指被連接的DNA序列是毗鄰的，並且如果是分泌性前導序列，應是相鄰的並且處於閱讀框中。然而，增強子不一定是毗鄰的。通過在方便的限制位點接合可實現連接。如果此種位點不存在，那麼按照常規作法使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。「天然序列EGFL7」包括具有與自然界衍生的EGFL7相同胺基酸序列的多肽，與其製備方式或來源物種無關。因此，天然序列EGFL7可以具有天然出現的下列種類EGFL7的胺基酸序列:人EGFL7、鼠EGFL7、爪蟾EGFL7、斑馬魚EGFL7或來自任一其他物種的EGFL7。例如，優選的全長天然序列人EGFL7胺基酸序列如圖Ia所示 (SEQ ID N0:1)。例如，天然序列小鼠EGFL7胺基酸序列如圖Ia所示(SEQ ID N0:2)。所述天然序列EGFL7可以從自然界分離或者可以通過重組或和/或合成手段製備。該術語「天然序列EGFL7」具體包括天然出現的EGFL7的前原、原和成熟形式以及截短的形式，天然出現的變體形式以及天然出現的等位變體。「EGFL7變體」是生物學活性的EGFL7多肽，具有不同於EGFL7多肽天然序列的胺基酸序列，例如圖Ia分別列出的人、鼠、爪蟾和斑馬魚EGFL7(SEQID NO: 1-4)，由於在所述天然序列中插入、缺失、修飾和/或取代一個或多個胺基酸殘基。EGFL7變體與EGFL7天然序列例如SEQ ID NO: I所示的人EGFL7之間通常具有小於100%的序列同一性。但是，通常，一種生物學活性的EGFL7變體與天然出現的EGFL7的胺基酸序列例如SEQ ID NO: I之間具有至少約70%的胺基酸序列同一性，優選至少約75%，更優選至少約80%，更優選至少約85%，甚至更優選至少約90%，以1%遞增優選從至少約95%至至少約99%的胺基酸序列同一性。所述EGFL7變體包括至少約5個胺基酸且仍保留相應天然序列EGFL7多肽生物活性的肽片段。EGFL7變體另外還包括在天然EGFL7序列N-或C-末端或者內部添加了一個或多個胺基酸殘基的EGFL7多肽。EGFL7變體另外還包括其中有多個胺基酸殘基缺失，以及任選被一個或多個胺基酸殘基取代的EGFL7多肽。EGFL7變體還可以是經過共價修飾的，例如用除天然出現的胺基酸之外的部分取代，或者修飾胺基酸殘基得到一種非天然出現的胺基酸。EGFL7變體可以包含肝素結合結構域。在本文申請中就EGFL7序列而言的「胺基酸序列同一性百分比」是指，在經過序列比對後，與EGFL7序列中的殘基相同的胺基酸殘基在候選序列中的百分比，如有必要的話，引入缺口來實現最大百分比序列同一性，而不將任一保守取代當作序列同一性的一部分。候選EGFL7序列的N-末端、C-末端或內部的延伸，缺失或插入都不被認為會影響序列同一性或同源性。用於比對的方法和電腦程式已為本領域所熟知。一種這樣的電腦程式是Genentech編制的「ALIGN-2」，該程序和用戶文件已經提交地處Washington, D. C. 20559的美國版權局，其美國版權登記號為TXU510087。「嵌合的EGFL7」分子是一種多肽，其中含有融合於或鍵合於異源多肽的全長EGFL7或其一或多個結構域。所述嵌合的EGFL7分子通常具有至少一種與天然出現的EGFL7共同的生物學特性。嵌合的EGFL7分子的實例是為純化而加了標籤的表位。另一種嵌合的EGFL7分子是免疫粘合素。「分離的EGFL7」是指已經從EGFL7來源純化的或者通過重組或合成方法製備然後再純化的EGFL7。純化的EGFL7基本上不含其他多肽或肽。本申請中的「基本上不含」是指汙染的其他來源蛋白質的量少於約5%，優選少於約2%，更優選少於約1%，更優選少於約O. 5%，最優選少於約O. 1%。「基本上純的」蛋白質是指，根據組合物總重量計組合物中含有至少約90%重量百分比,優選至少約95%重量百分比，更優選至少約90%重量百分比，更優選至少約95%重量百分比的所述蛋白質。「基本上同質的」蛋白質是指以組合物總重量計，組合物中含有至少約99%重量百分比的蛋白質。所述術語「拮抗劑」取其廣義使用，包括能部分地或完全地封閉、抑制或中和天然EGFL7多肽生物活性的任一分子。合適的拮抗劑分子具體地包括拮抗劑抗體或抗體片段，天 然的EGFL7多肽的片段或胺基酸序列變體，肽，EGFL7受體的可溶性片段，有機小分子，等。用於鑑定EGFL7多肽的激動劑或拮抗劑的方法包括讓EGFL7多肽與候選的激動劑或拮抗劑分子接觸，測量通常與所述EGFL7多肽相關的一種或多種生物學活性的可檢測變化。「活性的」或「活性」在本文中是指EGFL7的形式，其保留了天然的或天然出現的EGFL7的生物學和/或免疫學活性，其中「生物學」活性是指，除誘導產生針對天然的或天然出現的EGFL7所具有的抗原表位的抗體之外，天然的或天然出現的EGFL7所帶來的生物學功能(抑制或刺激)，「免疫學」活性是指誘導產生針對天然的或天然出現的EGFL7所具有的抗原表位的抗體。因此，「生物學活性」當與「EGFL7」或「分離的EGFL7」或EGFL7激動劑連用時，意指具有或部分具有天然序列EGFL7的效應功能的EGFL7多肽。EGFL7的首要效應功能是其促進血管形成的能力。更優選地，所述生物活性是調控血管生成的能力。「EGFL7受體」是能與EGFL7結合併能介導EGFL7生物學特性的分子。本文中的術語「抗體」使用取其廣義，具體包括人的、非-人(例如鼠)的和人源化的單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、以及抗體片段，只要它們體現了理想的生物活性。「抗體」 (Ab)和「免疫球蛋白」(Ig)是具有相同結構特性的糖蛋白。儘管抗體體現了針對具體抗原的結合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體及其他無抗原特異性的抗體-樣分子。後一種類型的多肽是，例如，由淋巴系統低水平製備的以及由骨髓瘤高水平製備的。「天然的抗體」和「天然的免疫球蛋白」通常是約150，000道爾頓的雜合四聚糖蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成。每一輕鏈通過一個共價的二硫鍵連接於一個重鏈，但不同的同種型免疫球蛋白重鏈中二硫鍵數目各不相同。每條重鏈和輕鏈都具有間隔規律的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端具有一個可變區(Vh)，後接多個恆定區。每條輕鏈的一端具有一個可變區(')，另一端具有一個恆定區；輕鏈的恆定區和重鏈的第一恆定區連接在一起，輕鏈可變區與重鏈可變區排列在一起。認為特定的胺基酸殘基在輕鏈可變區和重鏈可變區之間形成一個界面。術語「可變」是指下述事實在抗體序列的可變區的某些部分有很大差異，且它們在每一具體抗體針對其具體抗原的結合和特異性方面發揮作用。然而，所述可變性並非均勻分布於抗體的整個可變區。而是集中於輕鏈和重鏈的可變區中被稱為高變區的3個節段內。可變區中高度保守的區域稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區各包括4個FR(分別為FR1、FR2、FR3和FR4)，大都採取β -摺疊構型，被3個形成連接環的高變區連接在一起，在一些情況下形成所述β-摺疊結構的一部分。每條鏈的高變區通過FR緊密相靠，並且與另一條鏈的高變區一起形成抗體的抗原結合位點(參見Kabat et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesdaj MD. (1991)，pages647_669)。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出各種效應功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用。本文中術語「高變區」是指負責結合抗原的抗體的胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」的胺基酸殘基(即，輕鏈可變區中的第24-34(Ll)、50-56(L2)及89-97 (L3)位殘基和重鏈可變區中的第31-35 (Hl)，50-65 (H2)及95-102 (H3)位殘基；Kabat et al. . Sequences of Proteins of Tmmunological Interest. 5th Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)),和 / 或來自「高變環」的胺基酸殘基(即，輕鏈可變區中的第26-32 (LI)，50-52 (L2)及91-96 (L3)位殘基和重鏈可變區中的第 26-32 (Hl), 53-55 (H2)及 96-101 (H3)位殘基;Chothia and Lesk, J. Mol.Biol. 196:901-917(1987))。在本申請中「骨架」或「FR」殘基是指可變區中除高變區殘基之外的殘基。木瓜蛋白酶消化抗體得到兩個相同的抗原結合片段，各帶一個抗原結合位點，稱為「Fab」片段，和剩餘的「Fe」片段，該名稱反映了其易於結晶的能力。胃蛋白酶處理得到F(ab' )2片段，該片段具有兩個抗原-結合位點，仍能交聯抗原。「Fv」是最小的含有完整抗原-識別和-結合位點的抗體片段。該區域是由一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區緊密、非一共價結合的二聚體組成。該結構中每一可變區中的3個高變區相互作用形成Vh-' 二聚體表面上的抗原結合位點。總之，所述6個高變區賦予抗體抗原-結合特異性。但是，即使是單個可變區(或僅含有3個抗原特異性高變區的Fv的一半)也具有識別和結合抗原的能力，但與完整的結合位點相比其親和力較低。Fab片段還含有輕鏈恆定區和重鏈的第一恆定區(CHl)。Fab'片段不同於Fab片段，因為在重鏈CHl區羧基末端添加了數個殘基，包括來自抗體絞鏈區的一個或多個半胱氨酸。本申請中的Fab' -SH為其恆定區的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab' DFfeb' )2抗體片段最初由之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段製備而成。其他抗體片段的化學偶聯也已知。根據其恆定區胺基酸序列，任一脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白)的「輕鏈」都可以被劃分為兩種不同的型，稱為kappa( K )和lambda( λ )。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分為亞類(同種型)，例如，IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgA2。免疫球蛋白不同類的重鏈恆定區分別稱為α, δ, ε, Y和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結構和三維構象已經熟知。「抗體片段」包括全長抗體的一部分，通常包括其抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab, Fab'，F(ab' )2，和Fv片段；二價抗體(diabody);線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多-特異性抗體。本文所用術語「單克隆抗體」指來自基本均一的抗體群的抗體，S卩，除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度特異性，僅針對單個抗原位點。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(多克隆)抗體製劑相反，每種單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。修飾語「單克隆」表示來自基本均一的抗體群的抗體的性質,它不是為了要求通過任何具體方法來產生該抗體。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可用Kohler et al. , Nature 256:495(1975)首先描述的雜交瘤方法來產生，或用重組DNA方法(見例如美國專利4，816，567)來產生。「單克隆抗體」也可用例如 Clackson et al. , Nature 352:624-628 (1991)和 Marks et al. , J. Mol.Biol. 222:581-597(1991)描述的技術從噬菌體抗體文庫分離。本文的單克隆抗體具體包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自具體物種或屬於具體的抗體分類或亞類的抗體的對應序列相同或同源，而該鏈的其它部分與源自另一物種或屬於另一抗體分類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學活性)的對應序列相同或同源(美國專利4，816，567 ;和Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自受者高變區的殘基被來自非人物種(如具有理想的特異性，親合力和能力的小鼠，大鼠，兔子，或非人靈長類動物)(供者抗體)的高變區的殘基取代。在有些情況，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基被相應的非人殘基取代。而且，人源化抗體可包含在受者抗體或供者抗體中未發現的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本包含至少一個(通常包含兩個)可變區的全部，其中所有或基本上所有的高變區對應於非人免疫球蛋白的相應部分，並且所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白序列的相應部分。人源化抗體也可選包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白。更多細節見Jones etal. Nature 321:522-525 (1986);Reichmann et al. Nature332:323-329(1988);和 PrestaCurr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)。「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段包含抗體的V1^P \結構域，其中這些結構域存在於單條多肽鏈中。通常，Fv多肽還包含％和'結構域之間的多肽接頭，該接頭使sFv形成結合抗原的理想結構。對sFv的綜述見Pluckthun in The PharmacoloRY ofMonoclonal Antibodies,vol. 113，Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlagj NewYork, pp. 269-315(1994)。術語「二價抗體」指帶兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含在相同的多肽鏈(Vh — VJ中相連的重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(\)。通過使用太短從而不能在相同鏈的兩個結構域間配對的接頭，結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。對二價抗體的描述更多見例如EP 404, 097 ；W0 93/11161 ;和Hollinger etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993)。本申請中使用的表述「線性抗體」是指Zapata et al. ProteinEng. 8 (10) : 1057-1062 (1995)描述的抗體。簡而言之，這些抗體包含形成成對的抗原結合區的成對串聯Fd節段(Vh-ChI-Vh-ChI)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。
術語「表位」是指蛋白質抗原上結合(單克隆或多克隆)抗體的位點。「激動劑抗體」指一種抗體，其為EGFL7激動劑因此具有天然序列EGFL7的一種或多種生物學特性。術語「EGFL7免疫粘附素」與術語「EGFL7-免疫球蛋白嵌合體」交互使用，是指一種由至少一部分EGFL7分子(天然的或變體)與免疫球蛋白序列組合而成的嵌合分子。所述免疫球蛋白序列優選地，但非必需，是免疫球蛋白恆定區。免疫粘附素可以具有人抗體的多種有價值的化學及生物學特性。由於免疫粘附素可以通過將具有理想特異性的人蛋白質序列連接於合適的人免疫球蛋白鉸鏈及恆定區(Fe)序列構建而成，所以目的結合特異性可以使用完整的人源成分實現。所述免疫粘附素對於所述患者而言具有最低的免疫原性，可以安全地長期或重複使用。已經公開了治療用途的同源多聚免疫粘附素實例包括用於阻斷HIV與細胞-表 面CD4結合的CD4-IgG免疫粘附素。向臨產孕婦施用CD4-IgG的I期臨床試驗獲得的數據表明該免疫粘附素可用於預防HIV的母親-胎兒傳播(Ashkenazi et al.，Intern. Rev.Immunol. 10:219-227 (1993)) 0能結合腫瘤壞死因子(TNF)的免疫粘附素也已開發。TNF是已證明為膿毒性休克的主要介質的促炎症反應細胞因子。基於膿毒性休克的小鼠模型顯示，TNF受體免疫粘附素是治療膿毒性休克的臨床應用的可靠侯選物(Ashkenazi, A. etal. PNASUSA 88:10535-10539(1991)) ο ENBREL (依那西普(etanerc印t))，一種含融合於IgG Fe區的TNF受體序列的免疫粘附素，已於1998年11月2日被美國食品和藥物管理局(FDA)批准用於類風溼性關節炎的治療。FDA於2000年6月6日批准丫ENBREL 在治療類風溼性關節炎方面的新的擴展用途。TNF阻斷劑的最新資料，包括ENBREL3
見 Lovell et al. , N. Engl. J. Med. 342:763-169 (2000),和 p810_811 上的編輯評論;以及Weinblatt et al. , N. Engl. J. Med. 340:253-259 (1999);綜述見 Maini and Taylor, Annu.Rev. Med. 51:207-229 (2000)。如果免疫粘附素結構的雙臂具有不同的特異性，由雙特異性抗體類推，那麼所述免疫粘附素被稱作「雙特異性免疫粘附素」。Dietsch et al. , J. Immunol. Methods162:123(1993)描述了組合了粘附分子胞外結構域、E-選擇蛋白和P-選擇蛋白的雙特異性免疫粘附素，在自然界中這些選擇蛋白表達於不同的細胞類型。結合試驗顯示與其起源的單特異性免疫粘附素相比，這樣形成的雙特異性免疫球蛋白融合蛋白與髓樣細胞繫結合力增強。術語「雜合粘附素」與「嵌合雜合多聚粘附素」交互使用是指嵌合分子(胺基酸序列)的複合體，其中每個嵌合分子將生物學活性部分，例如每個雜合多聚受體單體的胞外結構域與多聚化結構域組合。所述「多聚化結構域」能促進雜合多聚複合體內嵌合分子的穩定的相互作用。所述多聚化結構域可通過免疫球蛋白序列、亮氨酸拉鏈、疏水區、親水區或者游離的硫醇在所述嵌合雜合多聚體的嵌合分子之間形成分子間二硫鍵來相互作用。所述多聚化結構域可以包含免疫球蛋白恆定區。此外，可以構建多聚化區域，從而使空間相互作用不僅能促進穩定的相互作用，而且還能促進單體混合物形成異源二聚體超過同源二聚體。「突起」可以通過下述方式構建用較大側鏈(例如，酪氨酸或色氨酸)取代第一多肽界面的較小的胺基酸側鏈。通過用較小側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)取代較大的胺基酸側鏈，可任選地在第二多肽的界面上構建與所述突起大小相同或近似的互補「腔」。所述免疫球蛋白序列優選地，但非必需，是免疫球蛋白恆定區。本發明嵌合體中的免疫球蛋白部分可獲自 IgG1, IgG2, IgG3 或 IgG4 亞型，IgA, IgE, IgD 或 IgM,但優選 IgG1 或 IgG3。在本申請中，「治療」是為獲得有益或期望的臨床結果而採取的措施。對於本發明而言，有益的或期望的臨床結果包括，但不限於，症狀減輕，疾病範圍減小，疾病狀態穩定(即，未惡化)，病程延緩或減慢，病情改善或緩，以及症狀減退(部分或全部)，不論是可檢測的還是不可檢測的。「治療」還可用於指與不接受治療時預期存活相比存活的延長。「治療」是為了預防病症發展或改變病症病理而實行的幹預手段。因此，「治療」既可以是治療性治療也可以是預防性治療。需要治療的對象包括已經患病的以及預防發病的對象。特異性地，所述治療可以直接預防、減慢或減少細胞變性或損傷的病理，例如癌症治療中腫瘤細胞的病理，或者使得所述細胞對其他治療劑的治療更敏感。「長期」施用是指以與短期模式不同的連續方式施用藥劑，從而使初始療效(活性)保持更長的時間。「間歇」施用是不中斷的非連續治療，其實質是周期性的。
為了治療目的的「哺乳動物」是指分類為哺乳動物的任何動物，包括人，其他高等靈長類，家畜及農畜，觀賞動物，競技動物或寵物，例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔，等。優選地，所述哺乳動物是人。本文中「腫瘤」是指所有贅生性細胞生長及增殖，不管是惡性的還是良性的，以及所有的原癌及癌的細胞和組織。術語「癌症」和「癌性」是指或者描述哺乳動物中通常特徵在於不受調控的細胞生長的生理狀態。癌症的例子包括但不限於，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤和白血病。癌症的更具體的例子包括鱗狀細胞癌，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌以及肺鱗狀癌)、腹膜癌，肝細胞癌，胃或腸的癌症(包括胃腸癌)、胰腺癌，惡性膠質瘤(glioblastoma)，宮頸癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結腸癌，結腸直腸癌，子宮內膜癌(endometrial carcinoma)或子宮癌，唾液腺癌，腎或腎的癌，肝癌，前列腺癌，夕卜陰癌，甲狀腺癌，肝的癌以及各種類型的頭頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL);小淋巴細胞(SL)NHL ;中級/濾泡性NHL ;中級擴散性NHL ;高級成免疫細胞NHL ;高級成淋巴細胞NHL ;高級小無裂細胞(small non-cleaved cell)NHL;巨塊病(bulky disease) NHL ;套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma) ;AIDS_ 相關性淋巴瘤;以及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom’s Macroglobulinemia));慢性淋巴細胞白血病(CLL);急性成淋巴細胞白血病(ALL);毛細胞白血病；慢性成髓細胞白血病；以及移植後淋巴組織增生性疾病(PTLD)，以及與斑痣性錯構瘤病(phakomatoses)有關的異常血管增殖，水腫(例如與腦瘤有關的)，以及梅熱症候群(Meigs』 ssyndrome)。「化療劑」是在癌症治療中使用的化學化合物。化療劑實例包括烷化劑，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN"環膦醯胺(cyclosphamide);燒基磺酸酯如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙唳類(aziridines)如節替哌(benzodopa),卡波醌(carboquone),美妥替哌(meturedopa)和尿燒亞胺(uredopa);乙烯亞胺(ethylenimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine),三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine),三亞乙基磷醯胺，三亞乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine);多聚乙酸(acetogenins)(具體是 bullatacin 和 bullatacinone);喜樹喊(camptothecin)(包括合成類似物託泊替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin) ;callystatin ;CC_1065 (包括它的阿多來新(adozelesin)，卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物);cryptophycins (具體是 cryptophycin I 和 cryptophycin 8);多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189 和 CB1-TM1) ；eleutherobin ；pancratistatin ；sarcodictyin ；spongistatin ；氣芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，膽磷醯胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，異環磷醯胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；美法侖(melphalan)，新氮芥(novembichin)，膽留醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龍苯芥(prednimustine)，曲憐胺(trofosfamide)，尿啼唳氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(Iomustine)，尼莫司汀(nimustine)，和雷莫司汀(ranimustine);抗生素諸如enediyne抗生素(例如calicheamicin，具體是 calicheamicin gamma 11 和 calicheamicin omegal I (見，例如，Agnew，Chem Intl. Ed. Engl.，33:183-186 (1994)) ；dynemicin,包括 dynemicin A;二膦酸鹽(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate) ；esperamic in ;以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色團和相關色素蛋白enediyne抗生素生色團)，aclacinomysins，放身寸菌素(actinomycin)，authramycin，氮絲氨酸(azaserine)，博萊黴素(bleomycin)，放線菌素C (cactinomycin)，carabicin，去甲柔紅黴素(carminomycin)，嗜癌黴素(carzinophilin)，chromomycinis，更生黴素(dactinomycin)，柔紅黴素(daunorubicin)，地託比星(detorubicin)，6_重氮_5_氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN 多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代-多柔比星，氰基嗎啉代-多柔比星，2-卩比咯啉(pyrrolino)-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿黴素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin)，發波黴素(marcelIomycin)，絲裂黴素諸如絲裂黴素C，黴酷酸，諾加黴素(nogalamycin)，橄欖黴素(olivomycin)，培洛黴素(peplomycin)，potfiromycin，卩票呤黴素，三鐵阿黴素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑菌素(streptonigrin);鏈脲黴素(streptozocin)，殺結核菌素(tubercidin)，烏苯美司(ubenimex)，淨司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿啼唳(5-FU);葉酸類似物如二甲葉酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate);卩票呤類似物氟達拉濱(fIudarabine)，6_巰基卩票呤，硫咪卩票呤，硫鳥卩票呤；啼卩定類似物如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6_氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，雙脫氧尿苷，doxifluridine，依諾他濱(enocitabine)，氟尿苷；雄激素類如卡普睪酮(calusterone)，丙酸甲雄焼酮(dromostanolone propionate)，環硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睪內酯(testolactone);抗腎上腺類如氨魯米特(aminoglutethimide)，鄰氯苯對氯苯二氯乙焼(mitotane)，曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑如frolinicacid ;醋葡內酯(aceglatone);醒磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿啼 P定(eniIuraciI)；安 R丫 P定(amsacrine)；bestrabucil ;比生群(biasntrene);依達曲沙(edatraxate) ；defofamine ;秋水仙胺；地卩丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ;醋酸輕嗶咔唑(elliptinium acetate)；epothilone ;依託格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕基脲；香燕多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine);美登素類(maytansinoids)諸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins);米託胍腙(mitoguazone);米託蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol) ； 二胺硝口丫 P定(nitraerine);噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(Iosoxantrone);鬼臼樹酸(podophyllinic acid) ;2_ 乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine) ;PSK 多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根黴素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌；2，2'，2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);單端抱黴烯(trichothecene)(具體是 T-2 毒素，verracurin A，杆抱菌素(roridin) A 和 anguidine);烏拉坦(urethan);長春鹼醯胺；達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol) ;二溴衛矛醇(mitolactol);溴丙哌嗪(pipobroman) ；gacytosine ;阿拉伯糖苷(「Ara_C」)；環磷醯胺；三胺硫磷(thiotepa);紫杉焼(taxoid)，如TAXOL⑧紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton, NJ)，ABRAXANE 無克列莫佛(Cremophor-free)，紫杉醇的白蛋白改造的納米顆粒配製齊Li (albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和 TAXOTERE 多 西紫杉醇(Rh0ne -Poulenc Rorer, Antony, France) ；chloranbucil; GEMZAR 吉西他濱(gemcitabine) ; 6_硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉬配位複合物(platinumcoordinate complex)如順鉬、奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡鉬(carboplatin)；長春花鹼；鉬；鬼曰乙叉式(etoposide) (VP-16);異環磷醯胺；米託蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼；NAVELBINE 長春瑞賓(Vinorelbine) ; 二輕蒽二酮(novantrone);替尼泊式(teniposide);依達曲沙(edatrexate);柔紅黴素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);卡培他濱(xeloda);伊拜勝酸鹽(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(例如CPT-11)(包括伊立替康與5-FU和甲醯四氫葉酸(leucovorin)的治療方案)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥氨酸(difluorometlhylornithine, DMF0);維甲酸類(retinoids)諸如維甲酸；希羅達(capecitabine);以及上述任何物質的可藥用鹽,酸或衍生物。 此定義還包括能調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素製劑，如抗雌激素製劑和選擇性雌激素受體調節物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括'NOLVADEX 他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬(droloxifene) ,4-輕基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene), keoxifene, LY117018,奧那司麗(onapristone),和 FAREST0N ·託瑞米芬(FAREST0N · toremifene);芳香酶抑制物(aromataseinhibitor)，其抑制芳香酶，該酶調節腎上腺中的雌激素生成，諸如，例如4(5)-咪唑，氨魯米特(aminoglutethimide), ME.GASE. 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate),AROM.AS丨N 依西美坦(exemestane),福美司坦(formestanie),法倔唑(fadrozole),RIVISOR 伏氯唑(vorozole)，FEMARA 來曲唑(letrozole)，和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole);和抗雄激素製劑如氟他氨(f Iutamide),尼魯米特(nilutamide),比卡魯胺(bicalutamide),亮丙瑞林(Ieuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine) (1，3-二氧戍燒核苷胞喃唳類似物)；反義寡核苷酸,具體是抑制異常細胞增生所涉及的信號途徑中的基因表達的那些反義寡核苷酸，諸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras ;核糖酶諸如VEGF表達抑制劑(例如，ANGIOZYME 核酶)和HER2表達抑制劑；疫苗諸如基因治療疫苗，例如，ALLOVECTIN 疫m,LEUVECTIN 疫苗，和 VAX1D 疫苗；PROLEUK1N rIL-2 ;LURTOTECAN 拓撲異構酶 I 抑制物；ABARELIX rmRH,和上述任何物質的可藥用鹽，酸或衍生物。「眼內新生血管性疾病」是一種以眼睛新生血管形成為特徵的疾病。眼內新血管疾病的實例包括，但不限於，增生性視網膜病，脈絡膜的新生血管生成(CNV)，年齡-相關的黃斑變性(AMD)，糖尿病及其他缺血-相關的視網膜病,糖尿性黃斑水腫,病理的近視,病理性近視，希林二氏病(von Hippel-Lindau disease),眼睛的組織胞眾菌病,視網膜中央靜脈閉塞(CRVO)，角膜新生血管生成，視網膜新生血管形成，等。疾病的「病理」包括損害患者健康的全部現象。對於癌症而言，這些包括，但不限於，異常的或無法控制的細胞生長，轉移，幹擾鄰近細胞的正常功能，細胞因子或其他分泌產物的異常水平釋放，炎性或免疫學反應的抑制或加重，等。 與一種或多種其他治療劑「聯合」施用包括同時(一起)以及按任何順序連續施用。本申請中使用的「載體」包括可藥用載體、賦形劑或穩定劑，它們以使用劑量和濃度施用時對所接觸的細胞或哺乳動物是無毒的。通常可生理接受的載體是一種含水的PH緩衝溶液。可生理接受的載體包括緩衝液例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；蛋白質，例如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸例如甘氨酸，穀氨醯胺，天冬醯胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑例如EDTA ;糖醇例如甘露醇或山梨醇；成鹽平衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如 TWEEN ，聚乙二醇(PEG)，和 PLUR0NICS 。「脂質體」是一種由各種脂類、磷脂和/或表面活性劑組成的小囊泡，可用於遞送藥物(例如EGFL7多肽或其抗體)至哺乳動物。脂質體的組分通常以類似於生物膜脂質排列的雙層結構來排列。本文所述的「小分子」是指分子量小於約500道爾頓。本文中的術語「血管內皮生長因子」、「VEGF」、「VEGF多肽」和「VEGF蛋白質」包括了天然序列VEGF和VEGF變體(本文將進一步定義)。所述VEGF多肽可以分離自多種來源，例如來自人組織類型或來自其他來源，或者通過重組和/或合成方法製備。「天然序列VEGF」包括具有與自然界衍生的VEGF相同胺基酸序列的多肽。所述天然序列VEGF可以從自然界分離或者可以通過重組或和/或合成手段製備。術語「天然序列VEGF」具體包括VEGF的天然出現的截短型或分泌型的形式(例如，胞外結構域序列)，天然出現的變體形式(例如，可選剪接形式)以及天然出現的等位變體。本發明的一個實施方案中，所述天然序列VEGF是5種已知同工型其中之一，這5種同工型分別由121、145、165、189和206個胺基酸殘基組成，描述見例如，美國專利5，332，671和5，240，848;PCT公開號 WO 98/10071 的專利文獻；Leung et al. , Science 246:1306-1309 (1989);和 Keck etal.,Science 246:1309-1312(1989)。「VEGF變體多肽」是指下文定義的活性VEGF多肽，其與天然序列VEGF的胺基酸序列具有至少約80%，優選至少約85%，更優選至少約90%，甚至更優選至少約95%，最優選至少約98%的胺基酸序列同一性。所述VEGF變體多肽包括，例如，在天然序列的N-和/或C-末端以及一個或多個內部結構域中添加或缺失一個或多個胺基酸殘基得到的VEGF多肽。VEGF的序列同一性(胺基酸或核酸)是用與針對EGFL7具體描述的方法相同的方法測定的。類似地，EGFL7的激動劑和拮抗劑的定義，包括但不限於抗體，同樣適合於VEGF激動劑和拮抗劑。本發明的實施方式EGFL7所述EGFL7基因編碼一種分泌型、進化上保守的、 30kD的ECM相關蛋白。人胺基酸序列(SEQ ID NO: I)與小鼠(小鼠;SEQ ID NO:2)、娃(非洲蟾蜍；SEQ ID NO:3)和斑馬魚(斑馬顧;SEQ ID NO:4)之間分別具有約77%、47%和43%的同源性。所述EGFL7蛋白在N-末端含有信號序列EMI結構域(EMI結構域存在於許多參與調節細胞粘附的胞外基質相關蛋白中)，後接兩個EGF-樣結構域和一個富含亮氨酸和纈氨酸的C-末端區。 核酸和多肽分子在本發明中使用。所述人、小鼠、爪蟾和斑馬魚EGFL7胺基酸序列分別如SEQ ID NOs: 1-4所示(參見圖la)。斑馬魚cDNA(含部分基因組內含子序列)如SEQ ID NO: 5所示(參見圖lb)。用於本發明的多核苷酸可以使用本領域技術人員熟知的標準技術，例如雜交篩選和PCR方法獲得。EGFL7 的登錄號為NM_016215(人 EGFL7/VE-抑制素)，NM_178444(小鼠EGFL7)，AF184973 (小鼠 Notch4_ 樣)，P_AAZ37135 (小鼠 TANG0125)，BC044267 (非洲蟾蜍NEUI)。AY542170(斑馬顧"EGFL7)。Egf 18 登錄號是NM_030652 (人)，NM_152922 (小鼠)。EGFL7活性調節因子的製備和鑑定本發明還提供了篩選化合物來鑑定那些模擬或增強EGFL7的一種或多種生物活性(激動劑)或者抑制或減少EGFL7的效力(拮抗劑)的化合物的方法。EGFL7激動劑和拮抗劑又稱EGFL7調節因子。設計篩選拮抗劑藥物侯選物的試驗來鑑定與EGFL7多肽結合或複合、或者幹擾EGFL7與其它細胞蛋白質相互作用的化合物。小分子篩誅小分子可以具有EGFL7激動劑或拮抗劑的能力，因此具有治療用途。所述小分子可以包括天然出現的小分子，合成的有機或無機化合物和肽。但是，本發明中的小分子不局限於這些形式。小分子的大規模文庫(Extensive libraries)可從市場上買到，並且本領域熟知篩選具有理想活性的這些分子的多種試驗。侯選的EGFL7激動劑或拮抗劑小分子優選首先在能快速鑑定潛在的EGFL7活性調節因子的試驗中鑑定。這類試驗的一個實例是蛋白質-蛋白結合測定試驗，其中對候選分子與EGFL7受體結合的能力進行測量。另一實例中，測量候選分子幹擾EGFL7與EGFL7受體結合的能力。一個優選實施方案中，小分子EGFL7激動劑通過它們模擬一種或多種EGFL7生物學活性的能力來鑑定。例如，篩選小分子如下的能力誘導內皮細胞增殖，促進內皮細胞存活，如下文實施例2和3中所述，或者誘導血管生成，如下文實施例4中所述。另一個實施方案中，小分子EGFL7拮抗劑通過它們抑制一種或多種EGFL7生物學活性的能力來鑑定。因此，讓候選化合物與EGFL7接觸。然後測定EGFL7的生物活性。一個實施方案中，測定EGFL7刺激內皮細胞增殖的能力，例如，如實施例2所述。另一個實施方案中，測定EGFL7促進內皮細胞存活的能力，例如，如實施例3中所述。當EGFL7的生物活性受抑制，一種化合物被鑑定為拮抗劑。鑑定為EGFL7激動劑或拮抗劑的化合物可以用於本發明所述方法。例如，EGFL7拮抗劑可用於治療癌症。篩選與EGFL7相互作用的蛋白質的試驗適合檢測蛋白質-蛋白質相互作用的任何方法可用於鑑定可與EGFL7相互作用的蛋白質或其他分子，包括但不限於跨膜或胞內的蛋白質。可以使用的常規方法有共免疫沉澱法、交聯及通過梯度或層析柱共純化，來鑑定與EGFL7相互作用的蛋白質。就所述試驗而言，所述EGFL7成分可以是全長的蛋白質，其可溶性衍生物，對應於目的結構域的肽，或者含EGFL7 —些區域的融合蛋白。可以使用能同時鑑定編碼與EGFL7相互作用的蛋白質的基因的方法。這些方法包括，例如，使用經過標記的EGFL7或其變體，以與熟知的抗體探測8gtll文庫技術類似的方 式探測表達文庫。體內檢測蛋白質相互作用的方法，雙雜交系統，其詳細描述僅供說明之用決不應構成限制。該系統的一個版本已被描述(Chien et al. , Proc. Natl. Acad Sci. USA88:9578-9582(1991))並可購自 Clontech (Palo Alto, CA)。簡而言之，使用所述系統，構建編碼兩種雜合蛋白的質粒其中一種質粒由編碼轉錄活化蛋白的DNA-結合結構域的核苷酸和編碼EGFL7、或其多肽、肽或融合蛋白的核苷酸序列融合組成，另一質粒由編碼轉錄活化蛋白的活化結構域的核苷酸和與編碼未知蛋白且已作為cDNA文庫一部分重組入該質粒的cDNA融合組成。將DNA-結合結構域融合質粒和cDNA文庫轉化入含報導基因(例如，HBS或IacZ)的釀酒酵母菌株，其調控區中含有轉錄活化子的結合位點。兩種雜合蛋白中的任何一種都不能單獨活化報導基因的轉錄=DNA-結合結構域雜合體不能活化是由於其無法提供活化功能，而活化結構域雜合體不能活化則是由於其無法定位至活化子的結合位點。兩種雜合蛋白的相互作用重構了功能活化蛋白質，因而導致報導基因的表達，這一點可以通過報導基因產物的試驗來檢測。所述雙雜交系統或相關方法可用於篩選活化結構域文庫，篩出能與「餌」基因產物相互作用的蛋白質。例如，但不限於，可以使用EGFL7作為餌基因產物。可以將整個基因組或cDNA序列融合於活化結構域的編碼DNA。將此文庫和編碼餌EGFL7基因產物與DNA-結合結構域融合的雜合體的質粒共轉化入酵母報導菌株，從所得轉化子中篩選出那些能表達報導基因的轉化子。例如，但不限於，可以將餌EGFL7基因序列例如基因開放閱讀框克隆入載體，從而使其可翻譯地與編碼GAL4蛋白的DNA-結合結構域的DNA融合。純化這些菌落，分離出負責報導基因表達的文庫質粒。然後用DNA測序鑑定出所述文庫質粒編碼的蛋白質。可檢測出與餌EGFL7基因產物相互作用的蛋白質的細胞系的cDNA文庫，可使用本領域常規方法製備。根據本文所述的具體系統，例如，可以將cDNA片段插入載體，從而使其可翻譯地與GAL4的轉錄因活化結構域融合。可以將該文庫與所述餌EGFL7基因-GAL4融合質粒共一轉化入含有由啟動子驅動的IacZ基因的酵母菌株，所述啟動子中含有GAL4活化序列。與GAL4轉錄活化結構域融合的cDNA編碼蛋白質與所述餌EGFL7基因產物相互作用可重構成活性GAL4蛋白質，從而驅動表達。驅動表達的菌落可以通過本領域常規方法檢測。然後使用本領域常規技術，從這些菌株純化出cDNA，用於製備和分離所述餌EGFL7基因-相互作用蛋白。針對調控EGFL 7表達或活性的化合物的試驗設計下列試驗鑑定與EGFL7相互作用(例如，結合)的化合物，幹擾EGFL7與其結合配偶體、關聯物(cognate)或受體相互作用的化合物，以及調節EGFL7基因表達活性(SP，調節EGFL7基因表達水平)或調節體內EGFL7水平的化合物。此外還可以用試驗鑑定結合EGFL7基因調控序列(例如，啟動子序列)從而可調節EGFL7基因表達的化合物。參見，例如，Platt, K. A.，J. Biol. Chem. 269:28558-28562 (1994)，在此全文引入作為參考。可根據本發明篩選的化合物包括但不限於肽、抗體及其片段、及其他有機化合物(例如，肽模擬物)，所述有機化合物與EGFL7或EGFL7受體結合，且能模擬由天然配體觸發的活性(即，激動劑)或抑制由天然配體觸發的活性(即，拮抗劑)。所述化合物包括，但不限於，肽，例如可溶性的肽，包括但不限於隨機肽文庫的成 員；(參見，例如，Lam, K. S. et al. , Nature 354:82-84(1991) ;Houghten, R. et al. , Nature354:84-86(1991)),和組合化學-衍生的由D-和/或L-構型胺基酸構成的分子文庫，磷酸肽(包括但不限於隨機或部分簡併的、指導的磷酸肽文庫的成員；參見，例如，Songyang，Z.et al.，Cell72:767-778 (1993))，抗體(包括但不限於，多克隆、單克隆、人源化、抗-獨特型嵌合的或單鏈的抗體，和FAb，F(ab』)2及FAb表達文庫片段，及其表位-結合片段)，以及有機或無機小分子。可以根據本發明篩選的其他化合物包括，但不限於，能進入合適細胞(例如內皮細胞)並影響EGFL7基因或其他參與EGFL7介導途徑的基因表達的有機小分子(例如通過與參與基因表達的調控區或轉錄因子相互作用)；或者是能影響或代替EGFL7活性或一些其他參與EGFL7信號傳導、分解代謝、或新陳代謝途徑的胞內因子的活性的化合物。計算機模擬及搜索技術能夠鑑定可調控EGFL7表達或活性的化合物，或者對已經鑑定的這類化合物作改良。如果已經鑑定出這類化合物或組合物，那麼就可以鑑定活性部位或區域。所述活性部位通常可以是配體結合位點。可以使用本領域巳知的方法，例如，從肽的胺基酸序列，從核酸的核苷酸序列，或者在有關化合物或組合物與其天然配體的複合體的試驗中鑑定活性部位。後一種情況，可以使用化學或X射線結晶方法通過從因子上找到複合後配體所處的位置來發現所述活性部位。其次，測定所述活性部位的三維幾何結構。這可以用巳知方法，包括能測定完整分子結構的X-射線晶體衍射得到。另一方面，可使用固相或液相NMR測定某些分子內距離。任何其他測定結構的實驗法都可用於獲得部分或完全的幾何結構。所述幾何結構可以用天然或人工複合的配體進行測量，其可提高所測活性部位結構的準確度。如果測得了不完全或不足夠精確的結構，那麼可以使用計算機的數值模擬方法來使結構完全或提高其準確度。任何公認的建模方法都可以使用，包括對具體生物多聚合物例如蛋白質或核酸特異的參數化模型，在計算分子運動基礎上的分子動力學模型，在熱集團(thermal ensembles)基礎上的統計力學模型,或者聯合模型。對於大多數的模型類型來說，表示構成原子及基團之間力的標準分子力場是必需的，可以從物理化學已知的力場中篩選出來。所述不完全的或準確度較低的試驗結構可以作為對用這些建模方法計算出的完全的且更準確的結構的約束。
最後，通過試驗、建模或二者結合測定了活性部位(或結合位點)的結構後，就可以通過搜索含化合物及其分子結構信息的資料庫鑑定出候選的調控化合物。所述搜索尋找具有與所測活性部位結構匹配的且與限定活性部位的基團相互作用的結構的化合物。所述搜索可以是人工的，但優選是計算機輔助的。經上述搜索發現的化合物是潛在的EGFL7活性調節因子。可選地，可以使用這些方法從已知的調控化合物或配體中鑑定出具有更強調控作用的化合物。可以對已知化合物的組合物進行修飾，修飾的結構效果可以使用上述應用於新組合物的試驗及計算機建模方法來測定。然後，將改變後的結構與化合物的活性部位結構進行對比，從而測定適合度或相互作用結果是否提高。用這樣的方式，可以很快地評價例如由於側基變化而導致的組合物的系統誤差，以獲得經修飾的特異性或活性提高的調控化合物或配體。以鑑定EGFL7的活性部位(或結合位點)及相關的轉導及轉錄因子為基礎的、用於鑑定調控化合物的更多試驗及計算機建模方法，對本領域技術人員來說是顯而易見的。
分子建模系統的實例有CHARMm和QUANTA程序(PolygenCorporation, Waltham, MA) CHARMm可具有能量最低化及分子動力學的功能。QUANTA能進行分子結構的構建、圖形建模及分析。QUANTA可實現分子相互間行為的相互構建(interactive construction)、修飾、可視和分析。大量文獻綜述了藥物與特異性蛋白質相互作用的計算機建模，例如Rotivinen, et al. , Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166(1988) ;Ripka, NewScientist 54-57 (June 16, 1988) ;McKinaly and Rossmann, Annu. Rev.Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122 (1989) ;Perry and Davies, OSAR:QuantitativeStructure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (AlanR. Liss, Inc. 1989) ; Lewis and Dean, Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 (1989)和141-162;有關核酸成分的模型受體的綜述參見，Askew, et al. , J. Am. Chem.Soc. 111:1082-1090(1989)。篩選及圖繪化學物質的其他電腦程式可從公司購買，例如 BioDesign, Inc. (Pasadena,CA. )，Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada),和Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario)。雖然這些程序主要設計為針對特異於具體蛋白質的藥物的應用軟體，一旦鑑定了 DNA或RNA區域，所述程序就適合於設計針對所述區域特異的藥物。儘管上文描述了設計及製備能改變結合的化合物的方法，但是但是本領域技術人員還可以從已知化合物(包括天然產物或合成的化學物質，以及生物學活性物質，包括蛋白質)的文庫中篩選用作抑制劑或活化劑的化合物。通過例如本文所述試驗鑑定的化合物，可用於例如，闡明EGFL7基因產物的生物學功能。可以治療有效劑量將所述化合物施用給患者來治療任一種生理學上所稱的病症(physiological disorder)。治療有效劑量是指足以使任何生物學症狀發生改善、延緩、預防或改變的化合物的量。針對結合EGFL7的化合物的試驗可以設計鑑定如下化合物的體系，所述化合物能與EGFL7相互作用(例如，結合)或模擬EGFL7，或者能干擾EGFL7與關連(cognate)受體、結合配偶體或基質結合。鑑定得到的化合物可用於，例如，調控野生型和/或突變體EGFL7基因產物的活性；可用於說明EGFL7的生物學功能；可用於鑑定破壞正常EGFL7相互作用的化合物的篩選；或者自身破壞或活化所述相互作用的化合物。用於鑑定能結合EGFL7或EGFL7關連受體或基質的化合物的試驗原理，涉及在足以使EGFL7與待測化合物相互作用並結合的條件和時間內，製備這兩種成分的混合反應物，從而得到能從所述反應混合物中移取和/或檢測的複合物。所使用EGFL7的種類可隨篩選試驗的目標而定。例如，當希望得到天然受體的激動劑時，可以使用全長EGFL7、或可溶性的截短的EGFL7、肽、或包含融合於能賦予試驗體系(例如，將得到的複合物標記，分離等)優勢的蛋白質或多肽的一個或多個EGFL7結構域的融合蛋白。當尋找可直接與EGFL7相互作用的化合物時，可以使用對應於EGFL7的肽以及含EGFL7的融合蛋白。所述篩選試驗可以採用多種方式。例如，實施所述試驗的一種 方法涉及將EGFL7、多肽、肽或其融合蛋白、或待測物質錨定於固相基質上，然後在反應結束時檢測錨定於所述固相基質上的EGFL7/待測化合物的複合物。在所述方法的一個實施方案中，可將EGFL7反應物錨定在固體表面上，並對未錨定的待測化合物進行直接或間接標記。實際中，可以方便地採用微量滴定板作為固體基質。所述錨定成分可以通過非共價或共價連接來固定。非共價連接可通過簡單地用蛋白質溶液包被固體表面後乾燥來完成。可選地，可以使用對待固定蛋白質特異的固定抗體，優選單克隆抗體，來將所述蛋白質錨定至固體表面。所述表面可以提前製備並保存起來。為了進行所述試驗，將非固定成分加至含有錨定成分的包被表面。在反應結束後，在使形成的任何複合物仍保持固定於所述固體表面的條件下，除去(例如，通過洗滌)未反應的成分。檢測錨定在固體表面上的複合物可以通過多種方式完成。在對之前非固定的成分作了預-標記的情況下，在表面上檢測到固定標記物表明有複合物形成。在未對之前非固定的成分作預-標記情況下，可以使用間接標記物檢測錨定於表面上的複合物；例如，使用對之前未固定的成分特異的已標記抗體(反之，可以用標記的抗-Ig抗體直接或間接地標記所述抗體)。可選地，反應可以在液相中進行，將反應產物與未反應成分及所檢測複合物分開；例如，使用特異性針對EGFL7蛋白質、多肽、肽或融合蛋白或待測化合物的固定抗體，將溶液中形成的任何複合物錨定，然後用特異性針對可能複合物的其他成分的標記抗體來檢測所錨定的複合物。針對幹擾EGFL7相互作用的化合物的試驗為便於討論，將與EGFL7相互作用的大分子稱為「結合配偶體」。這些結合配偶體可能參與EGFL7介導的生物學途徑。因此，期望鑑定出幹擾或破壞所述結合配偶體相互作用的化合物，將其用於調控或增強體內EGFL7活性和/或控制與該活性(或其不足)有關的病症。用於鑑定幹擾EGFL7與一或多個結合配偶體相互作用的化合物的試驗體系，其基本原理涉及製備含EGFL7或其一些變體與結合配偶體的反應混合物，在其中兩者相互作用並結合的條件作用足夠長的時間，從而形成複合物。為了檢測化合物的抑制活性，在有及無待測化合物存在的條件下製備反應混合物。待測化合物可以起初包含在反應混合物中，或者可以在加入EGFL7及其結合配偶體之後加入。不加待測化合物或加入安慰劑溫育對照反應混合物。然後檢測EGFL7和結合配偶體之間形成的任何複合物。在對照反應中而不在含待測化合物的反應混合物中形成複合物，這表明該待測化合物幹擾EGFL7與其可相互作用的結合配偶體間的相互作用。另外，還可以將含待測化合物和正常EGFL7蛋白質的反應混合物中的複合物形成情況與含待測化合物和突變EGFL7的反應混合物中複合物形成進行比較。此比較對於期望鑑定特異性地破壞與突變體或突變EGFL7的相互作用但不破壞與正常蛋白質的相互作用的化合物的那些情況是重要的。對於幹擾EGFL7和結合配偶體之間相互作用的化合物的試驗可以多相或同相方式實施。多相試驗(heterogeneous assay)包括將EGFL7或結合配偶體錨定在固體基質上，然後在反應結束時檢測錨定在所述固體基質上的複合物。同相試驗(homogeneous assay)中，整個反應都在液相中進行。在這兩種方法中，為了獲得與待測化合物有關的不同信息，可以改變反應物的加入順序。例如，鑑定競爭幹擾所述相互作用的待測化合物，可以通過在待測物質存在下進行反應，即，通過在EGFL7和可相互作用的結合配偶體之前或同時向反應混合物加入試驗物質。可選地，破壞已形成的複合物的待測化合物，例如具有較高結合常數、可將複合物中成分之一置換的化合物，可以通過在複合物形成後將待測化合物加入反應混合物來檢測。不同方式簡述如下。 多相試驗體系中，將EGFL7或可相互作用的結合配偶體錨定到固體表面上，而對非-錨定物質(species)進行直接或間接標記。實際上，可方便地利用微量滴定板。錨定物質可以用非共價或共價連接來固定。非共價連接通常通過簡單用EGFL7或結合配偶體的溶液包被固體表面後乾燥來完成。可選地，可以使用特異性針對待錨定物質的已固定抗體來將該物質錨定至固體表面。所述表面可以提前製備並保存起來。為了進行所述試驗，將固定物質的配偶體暴露於有無被待測化合物的包被表面。反應完成後，除去(例如，洗滌)未反應的成分，而形成的任何複合物仍保持固定於所述固體表面上。對錨定在固體表面上的複合物的檢測可以通過多種方式完成。當對非固定成分作了預-標記的情況下，在表面上檢測到固定標記物表明有複合物形成。在未對非固定成分作預-標記情況下，可以使用間接標記物檢測錨定於表面上的複合物；例如，使用特異性針對起初非固定物質的標記抗體(反之，可以用標記的抗-Ig抗體直接或間接地標記所述抗體)。根據反應成分的加入順序，可以對抑制複合物形成或破壞已形成的複合物的待測化合物進行檢測。可選地，反應可以在有無待測化合物的液相中進行，將反應產物與未反應成分及所檢測複合物分開；例如，使用特異性針對結合成分之一的固定抗體錨定溶液中形成的任何複合物，而用特異性針對另一配偶體的標記抗體檢測錨定複合物。此外，根據反應物加入所述液相的順序，可以對抑制複合物形成或破壞已形成的複合物的待測化合物進行鑑定。本發明的可選實施方案中，可以進行同相試驗。該方法中，製備EGFL7和可相互作用的結合配偶體的已形成複合物，其中所述EGFL7或其結合配偶體被標記，但是所述標記物產生的信號由於複合物的形成被淬滅(參見，例如Rubenstein的美國專利4，109, 496,其中使用了免疫測定方法)。能競爭並置換已形成複合物中一種成分的待測物質的加入可產生強於背景的信號。這樣，可以鑑定出破壞相互作用的待測物質。具體的實施方案中，可以製備用於固定的EGFL7融合物。例如，可用融合載體例如pGEX-5X-l將EGFL7或其肽片段融合於穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)基因，所用方式可使EGFL7或其肽片段的結合活性保留在所得融合蛋白中。用本領域常規方法及上述方法，可以純化可相互作用的結合配偶體並用於製備單克隆抗體。例如，通過本領域常規方法用放射性同位素125I標記該抗體。多相試驗中，可以將所述融合蛋白錨定至穀胱甘肽-瓊脂糖珠。然後在有或無待測化合物時以允許相互作用及結合發生的方式加入所述可相互作用的結合配偶體。反應結束時，可將未結合物質洗脫，向體系中加入標記的單克隆抗體並使其與複合成分結合。EGFL7與可相互作用的結合配偶體之間的相互作用可以通過測量仍與穀胱甘肽-瓊脂糖珠結合的放射量來檢測。待測化合物對所述相互作用的成功抑制可引起被測放射性的減少。可選地，可以在無固相穀胱甘肽-瓊脂糖珠的情況下，將GST融合蛋白與可相互作用的結合配偶體混合於液體中。可以在物質相互作用過程中或之後加入待測化合物。然後，將混合物加至穀胱甘肽-瓊脂糖珠，並將未結合物質洗脫。此外，抑制EGFL7與結合配偶體之間相互作用的程度可以通過添加標記抗體後測量與珠子結合的放射性來檢測。本發明的另一個實施方案中，可以使用相同技術將對應於EGFL7和/或可相互作用或結合的配偶體(此時結合配偶體是一種蛋白質)的結合結構域的肽片段取替一種或這 兩種全長蛋白質。許多本領域常規方法可用於鑑定和分離所述結合位點。這些方法包括，但不限於，編碼所述蛋白質之一的基因誘變，和在共免疫沉澱試驗中篩選結合的破壞。然後可選擇進行編碼複合物中第二種物質的基因的互補突變。對編碼各個蛋白質的基因的序列分析可發現對應於參與可相互作用結合的蛋白質區域的突變。可選地，可以使用上述方法將一種蛋白質錨定至固體表面，使其與它的標記結合伴侶相互作用並結合，所述結合伴侶已經用蛋白水解酶，例如胰蛋白酶處理。洗滌後，含有所述結合結構域的相對較短的標記肽仍然與固體材料結合，該肽可以被分離並通過胺基酸測序鑑定。另外，一旦獲得編碼胞內結合配偶體的基因，那麼就可以構建短基因節段表達所述蛋白質的肽片段，然後測試其結合活性並純化或合成。例如，但不限於，可以如上所述，通過製備GST融合蛋白並讓其與穀胱甘肽瓊脂糖珠結合，將EGFL7錨定至固體材料。所述可相互作用的結合配偶體可以用放射性同位素，例如35S標記，並用蛋白水解酶例如胰蛋白酶切割。然後，將切割產物加至錨定的融合蛋白使其結合。洗脫未結合肽後，可以將代表胞內結合配偶體結合結構域的已標記的結合物質洗脫出來，純化並用熟知方法分析胺基酸序列。如此鑑定的肽可以使用DNA重組技術合成製備或者融合至合適的易化(facilitative)蛋白。EGFL7組合物的用途針對心血管、內皮和血管牛成活件的試驗可以使用各種方法測試本申請所述多肽的心血管、內皮及血管生成活性。這類試驗包括下文實施例部分提供的試驗。組織生成活性試驗包括，但不限於WO 95/16035(骨，軟骨，肌腱)；W095/05846(神經，神經元)，和WO 91/07491 (皮膚，內皮)所述的方法。傷口-癒合活性的試驗包括，例如下文描述的試驗Winter, EpidermalWound HealinR, Maibach,HI and Rovee,DT, eds. (Year Book Medical Publishers, Inc. , Chicago), pp. 71-112,其修改參見論文 Eaglstein and Mertz, J. Invest.Dermatol. 71:382-384(1978)。
存在幾種心臟肥大試驗。體外試驗包括誘導成熟大鼠的心肌細胞擴散。該試驗中，基本上按照 Piper et al. , 「Adult ventricular rat heart muscle cells，，in CellCulture Techniques in Heart and Vessel Research, Η. M. Piper, ed. (Berl in:Springer-Verlag, 1990), pp. 36-60所述的改良方法,從單個(雄性Sprague-Dawley)大鼠分離心室肌細胞。這些方法可以實現成熟心室肌細胞的分離和這些細胞呈杆狀表型的長期培養。已經發現苯腎上腺素和前列腺素F2a (PGF2a)誘導這些成熟細胞的擴散反應。然後，試驗了各種潛在的心臟肥大抑制劑對PGF2a或PGF2a類似物(例如，氟前列腺烯醇(fluprostenol))和苯腎上腺素誘導的肌細胞擴散的抑制作用。對癌症而言，多種眾所周知的動物模型可用於進一步理解EGFL7在腫瘤發展和發病機理中的作用和測試候選治療劑的有效性，所述候選治療劑包括天然EGFL7多肽的抗體及其他拮抗劑，例如小分子拮抗劑。這類模型的體內特性使其可專門預示人類患者的體內反應。腫瘤和癌症的動物模型(例如，乳腺癌，結腸癌，前列腺癌，肺癌，等)包括非重組的和重組的(轉基因)動物。非重組動物模型包括，例如齧齒動物的模型，例如鼠模型。製備這類模型可以通過使用標準技術將腫瘤導入同系小鼠，所述技術例如，皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內植入、在腎小囊下植入、或常位針植入(orthopin implantation),例如將結 腸癌細胞植入結腸組織。參見，例如，1997年9月18日公開的PCT公開文獻WO 97/33551。可能腫瘤學研究中最常用的動物物種是免疫缺陷的小鼠，尤其是裸鼠。因為觀察到胸腺發育不全的(thymic hypo/aplasia)的裸鼠可成功作為人腫瘤異種移植物的宿主,所以它已經廣泛用於此目的。常染色體隱性nu基因已經被引入很多獨特的同類系(congenic)裸鼠品系，包括例如，ASff, A/He, AKR, BALB/c, B10. LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZff, P，RIII,和 SJL0 另外，除所述裸鼠外，現已飼養了多種具有遺傳免疫缺陷的其他動物並將它們用作腫瘤異種移植物的接受者。更多細節見例如，The Nude Mouse in OncoloRY Research, E. Boven and B. ffinograd, eds. (CRCPress, Inc. , 1991)。導入這類動物的細胞可以源自於已知的腫瘤/癌症細胞系，例如任何上列腫瘤系，以及，例如B104-1-1細胞系(經neu原癌基因轉染的穩定NIH-3T3細胞系)；ras-轉染的 NIH-3T3 細胞;Caco-2 (ATCC HTB-37);或者分化稍好的(moderatelywell-differentiated) II級人結腸腺癌細胞系，HT-29 (ATCC HTB-38);或者它來自腫瘤和癌症。腫瘤或癌症細胞樣本可以得自手術病人，使用常規條件在液氮中冷凍及存儲。Karmali et al. , Br. J. Cancer 48:689-696(1983)。可以通過多種方法將腫瘤細胞導入動物，例如裸鼠或EGFL7敲除小鼠。小鼠的皮下(s. c.)空間很適合腫瘤植入。腫瘤可作為固體塊、藉助於套針(tiOchar)的針狀活組織檢查物、或作為細胞懸浮液來進行皮下植入。在以固體塊或用套針植入中，將合適尺寸的腫瘤組織碎塊(fragment)引入皮下空間。細胞懸浮液是從原代腫瘤或穩定的腫瘤細胞系新鮮製備的，並且被皮下注射。也可通過注射真皮下植入物來植入腫瘤細胞。在這個位置，接種物在真皮結締組織下部和皮下組織之間沉積(deposit)。乳腺癌的動物模型可以通過如下來製備，例如，將大鼠神經母細胞瘤細胞(從其最初分離了 neu癌基因)，或neu-轉化的NIH-3T3細胞植入裸鼠，基本如Drebin etal. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9129-9133(1986)所述。
類似地，製備結腸癌的動物模型也可通過在動物(如裸鼠)中傳代結腸癌細胞，導致在這些動物中出現腫瘤。裸鼠中人結腸癌的常位(orthotopic)移植物模型已於例如，Wang et al. , Cancer Research 54:4726-4728 (1994)和 Too et al. , Cancer Research55:681-684 (1995)中描述。該模型是基於 AntiCancer, Inc.，(San Diego, California)出售的 「METAMOUSE 」。出現於動物的腫瘤可被取出並於體外培養。然後可將來自體外培養物的細胞傳代到動物。這些腫瘤可用作進一步試驗或篩選藥物的靶。或者，可分離來自傳代物的腫瘤，並分析來自預傳代的細胞和分離自一或多輪傳代物的細胞的RNA的理想基因表達差異。可在任何已知的腫瘤或癌細胞系操作這些傳代技術。例如，Meth A,CMS4,CMS5,CMS21和WEHI-164是BALB/c母鼠的化學誘導型纖維肉瘤(DeLeo et al. , J. Exp. Med. 146:720 (1977))，它們為研究多種藥劑的抗-腫瘤活性提供了一種可高度控制的制模系統。Palladino et al. , J. Immunol. 138:4023-4032 (1987)。簡而言之，讓腫瘤細胞在細胞培養物中體外增殖。在注射入動物前，在緩衝液中洗滌並懸浮所述細胞系，細胞密度達約10X IO6到10X IO7個/ml。然後用10-100 μ I細胞懸浮液感染動 物，等待1-3周來讓腫瘤出現。此外，小鼠的Lewis肺癌，用來進行實驗的最廣泛研究的腫瘤之一，可以用作被研究的腫瘤模型。該腫瘤模型的效力與治療診斷患有小細胞肺癌(SCCL)的病人的有益效果相關。把來自患病(affected)小鼠的腫瘤碎塊或保持在培養物中的細胞注射給正常小鼠，可以導入該腫瘤。Zupi et al. , Br. J. Cancer 41: suppl. 4，30 (1980)。證據表明，注射，甚至是一個細胞開始，並且有很高比例的感染腫瘤細胞存活。關於該腫瘤模型更多信息參見，Zacharski, Haemostasis 16:300-320(1986)。一種評價待測化合物在植入腫瘤的動物模型中的效力的方法是測量治療前後的腫瘤尺寸。通常，用遊標卡尺測量植入腫瘤的二維或三維尺寸。限於二維空間的測量數據不能精確地反映腫瘤的尺寸；因此，通常使用數學公式將它轉變為相應的體積。但是，這樣測量的腫瘤尺寸是非常不準確的。候選藥物的治療效果可以用治療誘導型生長延遲以及特異性生長延緩更好地描述。描述腫瘤生長的另一個重要的變量是腫瘤體積倍增時間。用於計算和描述腫瘤生長的電腦程式可見,例如Rygaard and SpanR-Thomsen, Proc. 6thlnt.Workshop on Immune-Deficient Animals，Wu and Sheng eds. (Basel, 1989)，p. 301 報導的程序。但是，應注意到治療後的壞死和炎症反應事實上導致腫瘤尺寸增加，至少在最初增力口。因此，需要聯合使用形態計量方法(morphometric method)和流式細胞分析法來小心監測這些變化。此外，重組的(轉基因)動物模型可以通過，用製備轉基因動物的標準技術將本文鑑定的EGFL7基因的編碼區引入目標動物的基因組來製造。可以作為轉基因操作的目標的動物包括，但不限於小鼠、大鼠、兔、豚鼠(guinea pig)、綿羊、山羊、豬、和非人靈長類(non-human primate),例如，狒狒(baboon),黑猩猩(chimpanzee)和猴子。本領域已知的將轉基因引入所述動物的技術包括，原核顯微注射(美國專利4，873，191));通過逆轉錄病毒介導將基因轉移到生殖系(germ line)中(例如，Van der Putten etal. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:6148-615 (1985));將基因革巴向胚胎幹細胞(Thompson etal.，Cell56:313-321 (1989));胚胎電穿孔(Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814(1983));以及精子-介導的基因轉移。Lavitrano et al. ,Cell 57:717-73(1989)。綜述，參見例如，美國專利4，736,866。為了本發明的目的，轉基因動物包括，僅在其部分細胞中攜帶轉基因的那些動物(「嵌合體動物(mosaic animal)」)。該轉基因可以作為單個轉基因或作為串聯體(concatamer),例如頭-頭或頭-尾串聯體而被整合。將轉基因選擇性引入具體細胞類型可用例如 Lasko et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:6232-636 (1992)的技術。例如，可以用Southern印跡分析或PCR擴增來驗證轉基因的整合。然後，可以利用諸如原位雜交、Northern印跡分析、PCR或免疫細胞化學等技術來分析mRNA表達的水平。還可以檢查該動 物是否有腫瘤或癌症發展的體徵。可選地，可以構建「基因敲除」動物，其具有缺陷的或已改變的、編碼本文鑑定的EGFL7的基因，該基因是編碼EGFL7的內源基因與編碼引入該動物胚細胞的相同多肽的經改變基因組DNA之間同源重組的結果。例如，可以根據已有的技術，用編碼具體EGFL7多肽的cDNA來克隆編碼該多肽的基因組DNA。可以將編碼具體EGFL7多肽的基因組DNA的一部分缺失或用另一基因取代，所述另一基因為例如可用來監測整合的選擇性標記的編碼基因。通常，未改變的側翼DNA(位於5』和3』末端)的數千鹼基都包含在載體中。見例如Thomas and Capecchi, Cell 51:503 (1987)關於同源重組載體的描述。將該載體引入胚胎幹細胞系(例如通過電穿孔)，選出一些細胞，在這些細胞中，引入的DNA與內源DNA發生同源重組。見例如，Li et al.，Cell69:915 (1992)。然後，將選出的細胞注射到動物(例如小鼠或大鼠)的囊胚中，以形成聚集嵌合體。見例如Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic StemCells:A Practical Approach,E.J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152。隨後，將嵌合胚植入適宜的假孕雌性代養動物中，植入的胚胎將產生「基因敲除」動物。那些在生殖細胞中攜帶同源重組DNA的後代可通過標準技術鑑定，並用來產生後代動物，使這些動物的所有細胞都包含同源重組DNA。基因敲除動物可以，例如，以它們抵抗一些病理疾病的能力和它們由於缺乏EGFL7而產生病理情況的特徵來表徵。也可以在治療自發產生的動物腫瘤的過程中，檢測特異性結合本文鑑定的EGFL7的抗體及其他候選藥物的效力。對適於這些研究的靶是貓口腔鱗狀細胞癌(feline oralsquamous cell carcinoma) (SCC)。貓口腔SCC是高度侵襲性的惡性腫瘤,它是對於貓最常見的口腔惡性腫瘤，佔在此物種所報導的口腔腫瘤的60%以上。該腫瘤極少轉移到遠處(distant site)，但此轉移的低發生率可能僅由於患此腫瘤的貓的存活時間短造成。這些腫瘤通常不宜手術，主要因為貓口腔解剖學。現在沒有對於此腫瘤的有效治療。在作研究之前，每隻貓均接受全身(complete)臨床檢查及活組織檢查，並用計算機化斷層顯相(CT)掃描。診斷為患有舌下口腔鱗狀細胞腫瘤的貓被排除在本研究之外。此腫瘤的結果是舌頭漸漸麻痺，即使治療能殺死腫瘤，所述動物可能仍不能自主進食。在較長時間段內重複治療每隻貓。在治療過程中的每一天，以及在隨後的每次複查中，給腫瘤拍照。治療後，給每隻貓再進行一次CT掃描。隨後每8周作一次CT掃描及胸廓的放射照相(thoracic radiograms)來評價。用所述數據來評價相對於對照組的存活率(survival)、反應性(response)和毒性上的差異。反應性陽性會需要腫瘤退化(regression)、優選生活質量改善和/或壽命延長的證據。
另外，也可檢測其他自發性動物腫瘤，如狗、貓和狒狒的纖維腺瘤、腺癌、淋巴癌、軟骨瘤、或平滑肌肉瘤。在這些腫瘤中，狗和貓的哺乳動物腺癌是優選的模型，因為其外形和表現(behavior)與在人出現的哺乳動物腺癌很類似。但是，由於此種腫瘤很少在動物出現，從而限制了此模型的應用。本領域已知的其他體外和體內的心血管、內皮和血管生成試驗也適用於本申請。鉬織分布本文所述心血管、內皮、和血管生成試驗的結果可通過進一步試驗，例如通過測定不同人組織中的mRNA表達來驗證。如上所述，測量不同組織中的基因擴增和/或基因表達可以通過常規Southern 印跡，定量 mRNA 轉錄的 Northern 印跡(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:5201-5205(1980)),斑點印跡(DNA分析)，或原位雜交，使用適當標記的探針，根據本文 提供的序列。可選地，可以使用能識別特異性雙鏈體的抗體，所述特異性雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質雙鏈體。可選地，不同組織中的基因表達可以用免疫學方法例如組織切片的免疫組織化學染色以及細胞培養物或體液的試驗來測量，直接定量基因產物的表達。可用於免疫組織化學染色和/或液體樣本試驗的抗體是單克隆或多克隆的，可用任何哺乳動物製備。方便地，可以製備抗天然序列EGFL7多肽的抗體、或抗根據本文提供的DNA序列合成的肽的抗體、或者抗融合於EGFL7DNA並編碼特異抗體表位的外源序列的抗體。下文提供了用於製備抗體的常規技術和原位雜交的具體方法。對抗體結合的研究心血管、內皮和血管生成試驗的結果可以通過對抗體結合的研究進一步驗證，其中測試了抗-EGFL7抗體的抑制能力，所述抑制是針對EGFL7對所述心血管、內皮和血管生成試驗中使用的內皮細胞或其他細胞作用的抑制。舉例的抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性及異源偶聯抗體、及下文描述的其製劑。對抗體結合的研究可用於任何已知的測定方法，如競爭性結合測定，直接和間接夾心測定，和免疫沉澱測定。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRCPress, Inc. , 1987), pp. 147-158。競爭性結合測定取決於已標記標準品與待測樣本分析物競爭結合有限量抗體的能力。待測樣本中靶蛋白的量與結合到抗體的標準物的量成反比。為了利於標準物的結合量，優選所述抗體在競爭前或後是不溶的，從而可以方便地將那些結合到抗體的標準品和分析物同仍未結合的標準品和分析物分離開來。夾心測定包括使用兩種抗體，每種能夠結合待檢測蛋白質的不同免疫原性部分或表位。夾心測定中待測樣本分析物與固定到固相支持物上的第一抗體結合，之後第二抗體與所述分析物結合，於是形成不可溶的三-部分複合物。見例如美國專利4，376，110。所述第二抗體自身可用可檢測部分標記(直接夾心測定)或可用經可檢測部分標記的抗-免疫球蛋白的抗體來測定(間接夾心測定)。例如，一種夾心測定是ELISA測定，其中可檢測部分是酶。對於免疫組織化學法，組織樣本可以是新鮮的或是冰凍的，或例如，可以包埋在石蠟中並用防腐劑如福馬林來固定。
基於細胞的腫瘤試驗用於心血管、內皮和血管生成病症例如腫瘤的基於細胞的試驗和動物模型，可以用來檢驗本文所述心血管、內皮和血管生成試驗的結果，以及用於理解本文鑑定的基因與心血管、內皮和血管生成細胞不良生長的發育和發病機理之間的相互關係。本文鑑定的基因產物在心血管、內皮和血管生成細胞不良生長中的作用，所述細胞例如腫瘤細胞,可以通過使用已鑑定為本文所述EGFL7可刺激或抑制的細胞或細胞系來進行測試。這類細胞包括，例如下文實施例部分列出的細胞。在不同的方法中，用本文所述cDNAs轉染已知參與具體心血管、內皮和血管生成病症的細胞類型的細胞，然後分析這些cDNAs誘導過度生長或抑制生長的能力。如果所述心血管、內皮和血管生成病症是癌症，那麼合適的腫瘤細胞包括，例如，穩定的腫瘤細胞系例如B104-1-1細胞系(用neu原癌基因轉染的穩定NIH-3T3細胞系)和ras-轉染的NIH-3T3細胞，這些細胞可以用所需基因轉染，並監測腫瘤(tumorigenic)生長。然後，經轉染的細胞系可用於測試多克隆抗體或單克隆抗體或抗體組合物抑制腫瘤發生細胞生長的能力，所述抑制能力是通過向經轉化細胞的生長施加抑制細胞的活性或細胞毒性活性、或 者通過介導抗體-依賴性細胞介導的細胞毒活性(ADCC)而導致的。用本文鑑定的基因的編碼序列轉染的細胞可以進一步用於鑑定用於治療心血管、內皮和血管生成病症例如癌症的侯選藥物。此外，源自轉基因動物腫瘤的原代培養物(如上所述)可用於本申請所述的基於細胞的試驗，但仍優選穩定的細胞系。從轉基因動物得到傳代(continuous)細胞系的技術為本領域所熟知。參見，例如，Small et al.，Mol. Cell. Biol. 5:642-648 (1985)。基因的診斷用塗本發明還涉及EGFL7編碼基因的診斷用途。檢測到EGFL7的突變形式可診斷心血管、內皮和血管生成疾病或對心血管、內皮和血管生成疾病的易感度，所述疾病例如腫瘤。攜帶人EGFL7多肽的編碼基因突變的個體可以用多種技術在DNA水平上進行檢測。診斷用核酸可以獲自患者細胞，例如來自血液、尿液、唾液、活檢組織和屍檢材料。基因組DNA可以直接用於檢測或者在分析前通過PCR酶促擴增(Saiki et al. , Nature324:163-166(1986)) ο RNA或cDNA也可用於同樣用途。例如，與EGFL7編碼核酸互補的PCR引物可用於鑑定和分析EGFL7突變。例如，缺失和插入可以通過擴增產物相對於正常基因型的大小變化來檢測。可以通過讓擴增的DNA與放射標記的編碼EGFL7的RNA或者與放射標記的編碼EGFL7的反義DNA序列雜交，來鑑定點突變。可以通過RNase A消化或解鏈溫度差異，將完全匹配的(perfectly matched)序列與錯配雙鏈體區分開來。以DNA序列變化為基礎的遺傳試驗，可以通過檢測DNA片段在存在或缺無變性劑的凝膠中的電泳遷移率改變來進行。小序列的缺失和插入可以通過高解析度凝膠電泳來觀察。不同序列的DNA片段可以在變性甲脒梯度凝膠上區分開，其中由於不同DNA片段的具體解鏈溫度或局部解鏈溫度，它們的遷移(mobility)被滯留在凝膠的不同位置。參見，例如，Myers et al. , Science 230:1242(1985)。具體位置的序列改變也可用核酸酶保護試驗，如RNase和SI保護或化學斷裂方法來顯不，例如，Cotton et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:4397-4401 (1985)。因此，對具體DNA序列的檢測可以通過如下方法來實現，如雜交、RNA保護、化學切害I]、直接的DNA測序、或使用限制性內切酶，例如限制性片段長度多態性(RFLP)，和基因組DNA 的 Southern 印跡。檢測多肽表達水平的用途除較常規的凝膠-電泳和DNA測序之外，還可以通過原位分析檢測突變。EGFL7編碼核酸的表達與腫瘤形成相關性血管病或新生血管生成有關。如果EGFL7具有信號序列，並且mRNA高度表達於內皮細胞，而在平滑肌細胞中表達程度較低，那麼表明EGFL7存在於血清中。因此，抗-EGFL7多肽的抗體可用於診斷腫瘤形成相關性血管病或新生血管生成，由為這種EGFL7多肽水平的變化是所述病症的指徵。可以使用競爭試驗，其中EGFL7特異性抗體附著於固相支持物，而標記的EGFL7多肽和來自宿主的樣本通過該固相支持物，附著於所述固相支持物上的待測標記物的量與樣本中EGFL7的量相關。
染色體作圖另外，本發明的序列對於染色體鑑定很有價值。所述序列可以特異性地靶向並雜交於單個人染色體上的特定位點。此外，目前需要鑑定所述染色體上的特定位點。目前，沒有幾種以實際序列數據(重複多態性)為基礎的染色體標記試劑可用於標記染色體位點。根據本發明將DNAs定位於染色體，是將與疾病有關的基因與這些序列相關的重要第一步。簡而言之，可以通過從所述cDNA製備PCR引物(優選15_25bp)將序列定位到染色體。對3'-非翻譯區的計算機分析可用於快速篩選跨度不超過基因組DNA中一個外顯子的引物，因而使擴增過程複雜化。然後，用這些引物經PCR篩選含單個人染色體的體細胞雜合體。只有那些含與所述引物相應的人基因的雜合體才產生擴增片段。對體細胞雜合體經PCR作圖是一種用於將具體DNA定位至具體染色體的快速方法。根據本發明用相同的寡核苷酸引物，可以類似方式用來自具體染色體或較大基因組克隆庫(pool)的若干組片段實現亞定位。可類似用於定位至其染色體的其他作圖策略包括原位雜交、對已標記的流式分選的染色體作預先篩選、以及通過與構建的染色體-特異性cDNA文庫雜交預篩選。cDNA克隆與分裂中期染色體分布的螢光原位雜交(FISH)可以一步提供精確的染色體定位。該技術可使用短至500或600鹼基的cDNA ;但是大於2，OOObp的克隆比較可能以足夠的信號強度結合至獨特的染色體位點來作簡單檢測。FISH需要使用獲得編碼EGFL7基因的克隆，而且越長越好。例如，2，OOObp是好的，4，OOObp更好，4，000以上可能並不是得到好結果合理的時間百分比所必需的。該技術的綜述，參見，Verma et al. , HumanChromosomes:a Manual of Basic Techniques(PerRamon Press, New York, 1988)。一旦序列已經定位至準確的染色體位置，那麼該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數據相關。所述數據參見，例如，V. McKusick, MendelianInheritance in Man (可在線獲自 Johns Hopkins University Welch Medical Library)。然後，通過連鎖分析鑑定基因與已定位至相同染色體區域的疾病之間的關係(空間(physically)相鄰的基因的共遺傳)。其次，必須測定患病和未患病個體之間cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或全部患病個體中發現但是在任何正常個體中都未發現一種突變，那麼該突變可能是所述疾病的致病因素。
根據物理作圖和遺傳作圖技術的目前解析度，精確定位至疾病相關的染色體區域的cDNA是50-500個潛在致病基因中的一種。(這裡假定I兆鹼基的作圖分辨度，且每20kb一個基因)。候詵藥物的篩詵試齡本發明包括篩選化合物的方法，以鑑定能模擬EGFL7 (激動劑)或阻止EGFL7作用(拮抗劑)的化合物。拮抗劑 候選藥物篩選試驗設計為用於鑑定與EGFL7結合或複合、或幹擾所述編碼多肽與其他細胞蛋白質相互作用的化合物。所述篩選試驗包括適於高通量篩選化學文庫的試驗，使其特別適於鑑定小分子候選藥物。該試驗可以本領域熟知的多種方式進行，所述方式包括蛋白-蛋白結合測定、生物化學篩選試驗、免疫測定和基於細胞的試驗。拮抗劑的全部試驗都是常見的，因為它們都要求候選藥物與EGFL7接觸，在一定條件作用足夠長的時間，來使這兩種組分相互作用。結合試驗中，所述相互作用是結合，所形成的複合體可以從反應混合物中分離或檢測。一個具體的實施方案中，EGFL7或候選藥物通過共價或非共價連接固定於固相，例如，微量滴定板上。非共價連接通常通過用EGFL7溶液包被固體表面後乾燥來實現。可選地，可以使用特異性針對待固定EGFL7的固定抗體，例如單克隆抗體，將待固定EGFL7錨定至固相表面。所述試驗可以如下進行將可用可檢測標記物標記的非固定成分加至固定成分，例如含有錨定成分的包被表面。當所述反應完成時，通過例如洗滌去除未反應的成分，然後對錨定在固體表面的複合物進行檢測。當最初的非固定成分帶有可檢測標記物時，檢測到標記物固定在表面上說明發生了複合反應。當最初的非固定成分不帶標記物時，可以通過，例如使用特異性地結合固定複合體的標記抗體，來檢測複合反應。如果候選化合物與具體EGFL7多肽相互作用但不結合，那麼該化合物與該多肽的相互作用可用熟知用於檢測蛋白質-蛋白質相互作用的方法進行檢測。所述試驗包括常規方法，例如，交聯、共免疫沉澱法、以及通過梯度或層析柱共純化。此外，蛋白質-蛋白質相互作用可以通過使用Fields及同事(Fields and Song, Nature (London) 340:245-246(1989) ; Chien et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582(1991))描述的基於酵母的遺傳系統來監測，描述見Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:5789-5793(1991)。許多轉錄活化因子，例如酵母GAL4，都由兩個空間上分離(physically discrete)的模塊結構域組成,其中的一個作為DNA-結合結構域,另一個作為轉錄-活化結構域。上述出版物描述的酵母表達系統(通常稱為雙雜合系統」)利用了這一特性，使用了兩種雜合蛋白，在一種蛋白中目標蛋白融合於GAL4的DNA-結合結構域，而在另一種蛋白中侯選的活化蛋白質融合於活化結構域。在GAL4-活化啟動子調控下的GALl-IacZ報導基因的表達取決於通過蛋白質-蛋白質相互作用的GAL4活性重構。含相互作用多肽的菌落用β_半乳糖苷酶的顯色底物檢測。使用雙雜合技術鑑定兩種特定蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互作用的成套試劑盒(MATCHMAKERTM)可購自Clontech。該系統還可以擴展到對參與特定蛋白質相互作用的蛋白結構域作圖，以及精確定位(pinpoint)在這些相互作用關鍵的胺基酸殘基。幹擾EGFL7與其他胞內或胞外的成分相互作用的化合物可以用下述方法測試通常製備含EGFL7與所述胞內或胞外的成分的反應混合物，在足以保證兩種產物相互作用並結合的條件作用足夠長的時間。為了測試侯選化合物抑制結合的能力，在待測化合物缺無和存在的條件下進行反應。此外，向第三反應混合物加入安慰劑作為陽性對照。混合物中出現的待測化合物與所述胞內或胞外成分的結合(複合物形成)用上述方法來監測。在對照反應中而不在含待測化合物的反應混合物中形成複合物，這表明該待測化合物能夠幹擾待測化合物與其反應配偶體間的相互作用。EGFL7拮抗劑可以通過下述方法檢測在適當的條件下，讓EGFL7和潛在的拮抗劑與膜-結合EGFL7多肽受體或重組受體聯合，來進行競爭性抑制試驗。EGFL7可以例如通過放射性來標記，從而使得結合至受體的EGFL7多肽分子數目可用於測定潛在的拮抗劑的有效性。編碼所述受體的基因可用本領域技術人員已知的很多方法鑑定，例如配體淘選和FACS 分選。Coligan et al. , Current Protocols in Tmmun. I (2) : Chapter 5(1991)。優選地，使用表達克隆，其中從EGFL7反應性細胞製備聚腺苷醯化的RNA，然後將從該RNA製備的cDNA文庫分為多個庫，用於轉染COS細胞或其他非EGFL7反應性細胞。將培養於載玻片上的轉染細胞暴露於標記的EGFL7多肽。EGFL7可以用多種方法標記，包括碘化或包括位點特異性蛋白激酶的識別位點。在固定和溫育後，對載玻片進行放射自顯影分析。鑑定陽性庫，製備多個亞庫，用可相互作用的亞庫再次轉染並再次篩選，最終產生編碼推定受體的單 個克隆。鑑定受體的可選方法包括，可以將標記的EGFL7多肽與表達所述受體分子的細胞膜或提取物的製備物通過光親和性連接。用PAGE電泳分離交聯物質，並暴露於X射線膠片。切割含所述受體的標記物複合物，分解為肽片段，然後進行蛋白質微量測序。使用得自微量測序的胺基酸序列設計一組簡併寡核苷酸探針，以篩選cDNA文庫來鑑定編碼推定受體的基因。在另一種拮抗劑試驗中，將表達受體的哺乳動物細胞或膜製備物與標記的EGFL7多肽在侯選化合物存在的條件下溫育。從而可以測量所述化合物增強或阻斷這種相互作用的能力。可用於治療心血管、內皮和血管生成病症的組合物包括，但不限於，能抑制靶基因產物表達和/或活性的抗體、有機及無機小分子、肽、磷酸肽、反義和核糖核酸酶分子、三股螺旋分子等。潛在的拮抗劑的更多具體實例包括，能與免疫球蛋白和EGFL7的融合物結合的寡核苷酸，具體為抗體，包括但不限於，多克隆抗體及單克隆抗體和抗體片段，單鏈抗體，抗-獨特型抗體，以及所述抗體或片段的嵌合或人源化形式，以及人的抗體及抗體片段。可選地，潛在的拮抗劑可以是一種密切相關的蛋白質，例如能識別受體但不施加任何作用、從而競爭性抑制EGFL7作用的EGFL7突變形式。另一種潛在的EGFL7拮抗劑是使用反義技術製備的反義RNA或DNA的構建體，其中，例如反義RNA或DNA分子發揮直接阻斷mRNA翻譯的作用，通過與靶mRNA雜交從而阻止蛋白質翻譯。反義技術可用於通過形成三股螺旋或者反義DNA或RNA來控制基因表達，這兩種方法都以多核苷酸與DNA或RNA的結合為基礎。例如，編碼本文所述成熟EGFL7多肽的多核苷酸序列的5'編碼部分，可用於設計長度為約10-40個鹼基對的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設計成與參與轉錄的基因區域互補(三股螺旋-參見，Lee etal. , Nucl. Acids Res. 6:3073(1979);Cooney et al. , Science241:456(1988);Dervan etal. , Science 251:1360(1991)),從而阻止EGFL7的轉錄和生成。本文所述的與RNA—部分「互補的」序列是指，具有與RNA雜交形成穩定雙鏈體的足夠互補性的序列；在雙鏈反義核酸情況下，可以測試雙鏈體DNA的單鏈，或者可以測試三股螺旋的形成。雜交能力取決於互補程度以及反義核酸的長度。通常，雜交核酸越長，它含有的與RNA錯配的鹼基越多，但仍可形成穩定的雙鏈體(或者三鏈體，視情況而定)。本領域技術人員可以通過使用常規方法測定雜交複合物的解鏈溫度，來確定錯配的耐受程度。反義RNA寡核苷酸在體內可與mRNA 雜交，並阻斷所述 mRNA 分子翻譯成 EGFL7 (反義-Okano, Neurochem. 56:560 (1991) ; 01igodeoxynucIeotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press:BocaRaton, FL, 1988))。所述反義寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA、或其嵌合混合物、衍生物、或改良形式。所述寡核苷酸可以在鹼基部分、糖部分或磷酸骨架上經過修飾，例如，為了提高分子、雜交等的穩定性。所述寡核苷酸可以包括其他附加基團，例如肽(例如，為了革巴向體內宿主細胞受體)，或有助於穿過細胞膜(參見，例如，Letsinger, et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:6553-6556 (1989) ; Lemaitre, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84:648-652(1987) ; 1988 年 12 月 15 日公開的 PCT
發明者埃倫.菲爾瓦羅夫, 喬-安妮.S.杭戈, 利昂.H.帕克四世, 梅克.施米特, 葉偉蘭 申請人:健泰科生物技術公司