塵蟎過敏原Derf29和Derf30及其基因和應用的製作方法
2023-05-18 03:55:36
專利名稱：塵蟎過敏原Derf29和Derf30及其基因和應用的製作方法
技術領域：
:本發明涉及一種塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30及其基因和應用，屬於生物醫學技術領域。
背景技術：
:過敏性疾病(如哮喘、過敏性鼻炎等)是臨床上的常見病、多發病，世界各國過敏性疾病的總發病率高達10-30%，是當前世界性的重大衛生學問題，目前我國現有哮喘患者2000多萬，過敏性鼻炎患者5000多萬，並且其發病率和死亡率仍呈上升趨勢，近二十年來發病率幾乎翻了一倍。在引起過敏性疾病的眾多吸入性過敏原中，塵蟎是導致呼吸道變態反應性疾病的最重要因素。自從Voorhorst和Spieksma (1964)首次證實塵蟎及代謝產物是屋塵中的主要過敏原以來，世界各國(歐美國家、日本、中國等)變態反應學工作者通過大量調查也一致證實塵蟎是世界性的主要變應原。塵蟎在過敏性疾病患者特異性免疫診斷中陽性率約70-80%。自從Noon和Freeman( 1911)首次應用梯牧草花粉變應原浸液(allergenextract)用於治療花粉症以來，脫敏治療至今已有90多年的歷史。隨著對變態反應疾病發病機制的深入研究以及免疫治療機制的進一步了解，WHO (1997)建議將變應原浸液改稱為變應原疫苗(allergen vaccine)，並且在《WHO有關免疫治療的指導文件》(1998)指出:
(I)鼓勵應用和發展標準化的變應原疫苗；(2)成功的免疫治療取決於高質量的變應原疫苗。因此，研製出新一代高效變應原疫苗仍是國內外該領域研究熱點。由於塵蟎系醫學節肢動物，結構和成份複雜，儘管目前人們在塵蟎數百種蛋白中已初步鑑定出16種過敏原成份，研究顯示塵蟎含有的過敏原多達30餘種。就某一個塵蟎過敏病人而言，他可能僅對塵蟎 中的一類或數類過敏原蛋白產生過敏反應。而目前在臨床上用於塵蟎過敏患者診斷和脫敏治療的仍然為塵蟎粗浸液，其中含有大量對患者非特異的過敏原及其它雜質，這嚴重阻礙了塵蟎過敏原試劑標準化的制定及其在臨床上的使用。所以進一步探明塵蟎過敏原的確切組分，將會為塵蟎過敏患者帶來個體化的脫敏治療
發明內容
:本發明的目的在於提供一種塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30及其基因和應用。本發明的技術方案如下:Der f 29是我們首次從塵蟎勻漿中分離純化得到的一種新的過敏原蛋白，它屬於一類 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase 蛋白家族，分子量約 15kDa。Der f 29 由 164個胺基酸組成，其胺基酸序列如下(SEQ ID NO:1):MALPRVFFDIAADNQPLGRIVIELRSDVVPKTAENFRALCTGEKGFGFKSSSFHRIIPNF 60MIQGGDFTNHNGTGGKSIYGNKFADENFTLQHTGPGIMSMANAGPNTNGSQFFITTVKTT 120WLDGKHVVFGSVVEGMDIVKKVESYGSQSGKPSKKVTIANCGQL164塵蟎過敏原Der f 29基因克隆步驟包括:塵蟎總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法擴增編碼基因。基因測序結果表明塵蟎過敏原Der f 29的編碼基因(GenBank accession AY283280.1)由495個核苷酸組成，該基因的5』端至3』端序列為(核苷酸序列為SEQ ID NO:2):atggcacttc ctcgtgtttt tttcgatatt gctgccgata atcaaccatt gggtcgtatt 60gtcattgagc tccgtagtga tgttgtgccc aaaacagcgg aaaatttccg tgcactttgc 120actggtgaaa aaggatttgg ttttaaatca tcctcatttc atcgtatcat acccaatttt 180atgatccaag gcggtgattt cactaaccat aatggtactg gtggtaaatc catctatggt 240aacaaatttg ccgatgaaaa tttcacactt caacacaccg gacctggtat catgtccatg 300gcaaatgccg gtccaaacac caatggttca cagtttttca ttacaaccgt aaagactacc 360tggttggatg gcaaacacgt tgtttttggt tcggttgtcg aaggaatgga cattgtaaaa 420aaggtggaaa gctatggc tc acaatcgggt aaaccatcca agaaagtgac cattgctaat 480tgtggtcagc tttaa495Der f 30屬於鐵結合蛋白家族(Ferritin),分子量約15 kDa0 Der f 30由171個胺基酸組成，其胺基酸序列如下(SEQ ID N0:3): MAANPESTTKTSRVRMNIQINLEFYASYVYQQMAYHFNRDDVALPGFEKFFDVSSKEERE 60HAERFMKLQNQRGGRIVLDDIHKPQQQDWSSGLEAMRAALELEKTVNQALLDLHAVATKH 120NDAQFADFIETHYLTEQVEAIKKLADYITNLERCGPGLGEYLFDRHTLHSS171塵蟎過敏原Der f 30基因克隆步驟包括:塵蟎總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法擴增編碼基因。基因測序結果表明塵蟎過敏原Der f 30的編碼基因(GenBank accession KC305503)由516個核苷酸組成，該基因的5』端至3』端序列為(核苷酸序列為SEQ ID N0:4):atggctgcta atcctgaatc aacaaccaaa acttcacgtg tacgaatgaa tattcaaatt 60aatttggagt tctatgcatc ctatgtatat caacagatgg cctatcattt taatcgtgat 120gatgttgcat tgcctggttt tgaaaaattt ttcgatgtat catccaaaga agaacgtgaa 180cacgctgaac gttttatgaa attacagaat caacgtggtg gacgtattgt attggatgat 240attcataaac cgcaacaaca agattggtca tcaggattgg aagcaatgcg tgctgcattg 300gaattggaaa aaacagtcaa tcaggcattg ttggatttgc atgccgttgc caccaaacac 360aatgatgcac aatttgctga ttttattgaa acacattatc taactgaaca agtggaagcc 420atcaagaaat tggctgatta tattaccaat ttggaacgtt gtggccccgg acttggtgaa 480tatctttttg atcgtcatac attgcattca tcgtaa516Western blot檢測發現,來自41份塵蟎過敏病人血清，Der f 29與其中的35份呈陽性反應，陽性反應率為85.6% ;Der f 30與其中的26份呈陽性反應，陽性反應率為63.4%。Elisa檢測發現，Der f 29和Der f 30陽性組在450nm處的吸收值分別是陰性對照組的4.6和5.1倍。臨床皮膚針刺實驗顯示，對於10位塵蟎過敏患者，Der f 29與其中7位的皮膚針刺實驗呈陽性反應，陽性反應率為70% ;Der f 30與其中6位的皮膚針刺實驗呈陽性反應，陽性反應率為60%。在嗜鹼性細胞活化實驗中，Der f 29作用於塵蟎過敏病人外周血嗜鹼性細胞所誘導的CD63和CCR3雙陽性細胞的百分率約是陰性對照組的7.1倍；Der f 30作用於塵蟎過敏病人外周血嗜鹼性細胞所誘導的⑶63和CCR3雙陽性細胞的百分率約是陰性對照組的5.9倍。上述過敏原檢測發現，Der f 29和Der f 30具有較強的過敏原性，是來自塵蟎的主要過敏原，能作為製備治療塵蟎過敏性疾病藥物的應用。本發明的有益效果在於:提供了塵蟎過敏Der f 29和Der f 30及其基因，塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30能夠作為製備治療塵蟎過敏性疾病藥物的應用。
:圖1-A是塵蟎勻漿過分子篩S印hadex_G75的峰型圖。圖1-B是塵蟎勻眾分子篩Sephadex_G75第III峰再過陰離子交換柱Resource Q的峰型圖。圖1-C是Der f 29過Resource Q的峰型圖及電泳圖。圖1-D是Der f 30過Resource Q的峰型圖及電泳圖。圖2-A是Der f 29與其中9個塵蟎過敏病人血清及I個陰性對照Western blot結果。圖2-B是Der f 30與其中9個塵蟎過敏病人血清及I個陰性對照Western blot結果。圖2-C是Der f 29與塵蟎過敏病人血清IgE作用的Elisa結果，其中組I用血清來自健康人，用作陰性對照，組2所用血清來自塵蟎過敏病人。圖2-D是Der f 29與塵蟎過敏病人血清IgE作用的Elisa結果，其中組I所用血清來自健康人，用作陰性對照，組2所用`血清來自塵蟎過敏病人。圖3-A至圖3-D是Der f 29的嗜鹼性細胞活化結果。其中:圖3-A所用的嗜鹼性細胞來自Der f 29過敏病人的外周血，組I未用Der f 29活化來作為陰性對照；圖3-B所用的嗜鹼性細胞來自健康人的外周血，組I也是未用Derf 29活化來作為陰性對照；圖3-C所用的嗜鹼性細胞來自Der f 30過敏病人的外周血，組I未用Der f 30活化來作為陰性對照，圖3-D所用的嗜鹼性細胞來自健康人的外周血，組I也是未用Der f 30活化來作為陰性對照。圖4-A 為塵蝴勻眾 Sephadex_G75 III峰的 Western blot 圖,其中點 I 為 Der f 29。圖4-B 為塵蝴勻眾 Sephadex_G75 III峰的 Western blot 圖，其中點 I 為 Der f 30。
具體實施方式
:實施例一:塵蟎過敏原的鑑定及其胺基酸序列測定一、塵蟎的飼養和收集及塵蟎勻漿的製備將純品系的粉塵蟎至於25 1:相對溼度75%的條件下採用磨成粉末狀的鼠糧進行批量飼養。由於塵蟎具有避光的生活特性，可用白熾燈光照法將塵蟎從飼料中分離出來。對於分離的塵蟎可加入適量的20mM pH 7.8 Tris-HCL進行充分研磨，然後在轉速12000 Xg離心30 min獲取上清。二、塵蟎過敏原的分離純化以上述收集的上清液為原料，上樣於預先用20mM pH7.8 Tris-HCL緩衝液平衡好的分子篩凝膠層析SephadeX-G75，用相同的緩衝液進行洗脫。流速為0.3ml/min，用自動收集器每IOmin收集一管,檢測每管在280nm和215nm處的吸收值,製作吸收值變化的峰型圖如圖1A所示。然後將每峰收集凍幹濃縮用於下一步的分離純化或雙向電泳及其Westernblot檢測。將來自分子篩凝膠層析Sephadex_G75 III峰繼續過陰離子交換柱Resource Q,峰型圖如圖1-B所示，圖1B中的2峰再繼續過Resource Q的峰型圖如圖1-C和圖1_D所示，所插入的為Der f 29和Der f 30電泳圖。三、雙向電泳及其Western blot檢測雙向電泳及其Western blot具體步驟如下:A.樣品處理:採用GE公司的2D clean-up對來自分子篩各峰的樣品進行脫鹽濃縮等處理，主要過程如下:1:將含有約60 μ g 100 μ I的樣品至於1.5 ml的微型離心管中，加入300 μ I沉澱劑振蕩攪勻，冰浴15 mirio2:以最大轉速(12000Xg)離心5 min，儘量取淨上清。加入40 μ I共沉澱劑，冰浴5 min。再次相同轉速離心5 min，用移液槍將上清移去，加入25 μ I加入I ml洗滌緩衝液(在-20 1:至少預冷I小時)和5 μ I洗滌添加劑，振蕩直至沉澱完全散開。將管在-20°C下孵育至少30 min,每10 min振蕩20至30 S。3:以轉速 12000 X g 離心 5 min。4:小心將上清移去，此時可見白色沉澱，將沉澱簡單風乾。5:加入150 μ I水 化液再溶解沉澱，以備第一向等電聚焦電泳(IEF)使用。B.等電聚焦(IEF):將含有約60 μ g樣品100 μ I水化液上樣於7 cm長Immobiline DryStrip非線性膠條,在Ettan IPGphor III等電聚焦系統上聚焦,等電聚焦條件為20 °C，每條膠的電流為50 μ A，總聚焦伏小時約為6 kVh。將等電聚焦好的膠條分別用含有二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙醯胺的平衡液各洗15 min，將平衡好的膠條橫放在以配好的濃度為12%的SDS-PAGE膠面上，並用瓊脂糖封好，準備第二向電泳。C.第二向電泳:對於膠寬度只有7 cm的膠塊可用SE260進行跑膠。在20 mA/膠的條件下一個半小時即可。D.雙向電泳的Western blot:對於同一個樣品需要跑兩塊雙向電泳，其中一塊用於直接染色，一塊接著用於Western blot,具體過程如下:1:轉膜:將2-D-SDS-PAGE膠上的蛋白用轉膜槽在200 mA 2 h的條件下轉至PVDF膜上。2:封閉:將轉有蛋白的PVDF膜用5%的脫脂奶粉在常溫封閉此。3:一抗孵育:將封閉好的PVDF膜用PBS洗滌，把一抗(塵蟎過敏病人血清)用5%的脫脂奶粉按1:20稀釋，在4 °C孵育過夜。4:二抗孵育:將一抗孵育的PVDF膜再用PBS洗滌，把二抗(羊抗人IgE)用5%的脫脂奶粉按1:2000稀釋，在常溫孵育I小時。5:顯影:將二抗孵育好的PVDF膜用PBS洗滌3次，每次5 min,在膜表面加上適量的二抗特異發光底物，用膠片進行顯影。E.將與膠片上顯影點匹配較好的2-D-PAGE蛋白點進行ES1-Q-TOF質譜測序。實施例二:塵蟎過敏原的基因克隆一、塵蟎總RNA提取A.稱取約80 mg的活塵蟎,加入已預冷的I mL Trizol提取液(美國Invitrogen公司)，並加入液氮充分勻漿。B.加入Trizol 1/5體積的氯仿，劇烈混勻約15秒，室溫放置5分鐘，4°C，12000rpm離心10分鐘,取上清。C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4 V，12000 rpm離心10分鐘，沉澱用75%乙醇洗一次，晾乾，管底沉澱物即為地鱉蟲消化道中腸總RNA。二、塵蟎mRNA的純化塵蟎mRNA 分離純化米用美國 PR0MEGA 公司的 PolyATtract mRNA IsolationSystems試劑盒。A.取塵蟎總 RNA 500 μ g 溶於 500 μ L DEPC 水中，65 °C水浴 10 min，加人 3UL的Oligo(dT)探針和13 uL 20XSSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。B.磁珠(SA-PMP)的洗滌:將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5X SSC 300 μ L，至磁力架吸附30秒，最後加100 μ L 0.5X SSC懸浮，稱為B液。C.將A液加入B液中，室溫 放置10 min，至磁力架吸附30秒，棄上清，用Ο- X SSC洗滌4次，最後棄上清，加100 μ L DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30 S，將上清移至新的試管，再加入150 UL DEPC水重懸，至磁力架吸附30 S，移上清至上述試管，即為純化的地鱉蟲消化道中腸mRNA。D.加入1/10體積的pH5.2,3 M的乙酸鈉溶液，等體積異丙醇，於_70°C放置30分鐘，4°C，12000 rpm離心10 min，棄上清，沉澱溶解於10 μ L DEPC水中。三、塵蟎cDNA文庫構建米用CL0NTECH公司 Creator SMART cDNA Library Construction Kit 構建塵蟎cDNA文庫。A.cDNA 第一鏈合成於無菌PCR管加入2μI 塵蟎mRNA、l μ I SMART IV引物、I μ I CDS 111/3』 PCR引物、I μ I RNA-free水，使總體積達到5 μ I ,混勻並短暫離心。1.72°C 保溫 2 min，冰上孵育 2 min。2.在上述 PCR 管中加入 2 μ I 5 X 第一鏈 buffer、I μ I 20 mmol/L DTTU μ I10 mmol/L dNTP混合物、I μ I PowerScript逆轉錄酶，混勻並短暫離心。3.置於PCR儀中42°C保溫I hr後，冰浴終止第一鏈的合成。B.採用長末端聚合酶鏈式反應(LD- PCR)方法擴增cDNA第二鏈1.將 I μ I cDNA 第一鏈、40 μ I 去離子水、5 μ I IOXAdvantage 2 PCR 緩衝液、I μ I 50XdNTP 混合物、I μ I 5』PCR 引物、I μ I CDS 111/3』PCR 引物以及 I μ I 聚合酶於PCR管中混勻。2.在 PCR 儀中按以下程序擴增:95°C，20 sec ;22 個循環:95°C，5 sec ；68°C,6min。3.擴增結束後，將合成的雙鏈cDNA置於_70°C保存。C.酶切、連接以及連接產物的轉化:1.在微量離心管中加入I μ L pMD19_T載體(日本Takara公司)、4 μ L塵蟎cDNA雙鏈溶液，全量為5 UL02.加入5 μ L (等量)的連接酶緩衝混合物。
3.16°C反應 2 小時。4.全量(10 μ L)加入至100 μ L DH5 α感受態細胞(北京天根生化科技有限公司)中，冰浴30分鐘。5.42°C加熱90秒鐘後，再在冰中放置I分鐘。6.加入37°C溫浴過的LB培養基900 μ L，37°C緩慢振蕩培養60分鐘。7.取200 μ L塗布於含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養基上37°C培養16小時，形成單菌落。8.每個LB平皿用5 mL LB液體培養基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構建的cDNA大約含2 X IO6個單獨克隆。四、塵蟎過敏原基因序列擴增和測定:根據實施例一中分離純化所得塵蟎過敏原Der f 29的胺基酸序列，我們設計了一條簡併引物Der f 29-F和Der f 30-F，與構建地鱉蟲消化道中腸cDNA文庫時所使用的接頭引物⑶S 111/3』 PCR配對，正反向引物序列為:CDS 111/3』 PCR: 5』 -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCATG-3』。Der f 29-F: 5， -ATGGC(A/T/C/G)CT(A/T/C/G)CC(A/T/C/G)AG(A/G)GT(A/T/C/G)TT (T/C) TT (T/C) -3，。Der f 30-F: 5，-ATGGC(A/T/C/G)GC(A/T/C/G)AA(T/C)CC(A/T/C/G)GA(A/G)AG (T/C)AC (A/T/C/G) _3，。其中，括號內的鹼基表示簡併引物。簡併引物和接頭引物⑶S 111/3』 PCR配對使用，以塵蟎cDNA為模板，進行PCR。其反應條件為:95°C預變性4 min，接著在如下條件進行30輪循環，94°C 30 sec, 55°C 30sec, 72°C 40 sec，然後72°C 10 min。然後將PCR產物連接到T載體上，導入大腸桿菌DH5a，篩選單克隆進行測序。結果表明編碼過敏原Der f 29的cDNA序列由495個核苷酸組成，過敏原Der f 30的cDNA序列由516個核苷酸組成。實施例三:塵蟎過敏原Der f 29的過敏原性檢測將分離純化獲得的塵蟎過敏原Der f 29進行如下過敏原性檢測。一、Western blot 實驗配製膠濃度為12%的SDS-PAGE膠，在還原條件電泳。電泳後利用轉膜槽將PAGE膠上的Der f 29轉至PVDF上，用5%的脫脂奶粉封閉2 hr,洗滌液洗滌3次後加一抗4°C孵育過夜(一抗為姚虻過敏病人血清，按1:80稀釋)。用洗滌液洗滌3次後加二抗常溫孵育Ihr (二抗為羊抗人IgE)，再次洗滌3次後，即可用二抗所連接的辣根過氧化物酶底物顯影。二、Elisa 實驗用包被液把過敏原稀釋成10 μ g/ml，用50 μ I 4°C包被過夜，病人血清按1:50稀釋，二抗是按1:2000稀釋，最終測0D450 nm的光吸收值。三、競爭性Elisa抑 制實驗具體過程:用50 μ I濃度為50 μ g/ml的塵蟎粗提液包被96孔板,一抗用3%的BSA按1:30稀釋，然後分別與終濃度為30至3 X 10_4 μ g/ml的粗提液和過敏原室溫作用I小時，二抗按1:2000稀釋，檢測0D450的吸收值。四、誘導嗜鹼性細胞活化實驗
利用ficoll-hypaque法分離對Der f 29過敏病人全血中的外周血單核細胞(PBMC)，PBMC含有淋巴細胞、單核細胞和嗜鹼性細胞。以終濃度為I μ g/ml的過敏原與PBMC在 37°C孵育 30 min,洗滌 3 次後再與抗體 FITC-anti_CD63 和 PE-anti_CD193 (CCR3) 37°C孵育20分鐘，洗滌3次後用流式細胞儀檢測。其中陽性對照用的是ant1-1gE，陰性對照用的是wash buffer (細胞用PBS)。PE標記的anti_CD193 (CCR3)在嗜鹼性細胞膜上穩定表達，它可以作為嗜鹼性細胞的marker。在PBMC的流式圖上嗜鹼性細胞位於淋巴細胞和單核細胞的交界處，利用陰性對照和PE-ant1-⑶193 (CCR3)將這部分細胞圈出來(gating)。嗜鹼性細胞活化結果可用CD63和CCR3雙陽嗜鹼性細胞的百分率表示。五、皮膚針刺實驗用生理鹽水溶解的過敏原滴在患者前臂掌側皮膚，用特製的點刺針刺破皮膚，使少量的過敏原進入皮膚內，擦乾遺留的過敏原，15 min後讀結果，分別用生理鹽水和組胺作陰性和陽性對照。Der f 29結果如表1，Der f 29如表2。表1:Der f 29對10名塵蟎過敏病人的皮膚針刺實驗結果
權利要求
1.塵蟎過敏原Derf 29和Der f 30、其特徵在於分別由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列組成。
2.編碼塵蟎過敏原Derf 29和Der f 30的基因，其特徵在於分別由SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列組成。
3.權利要求1所 述的塵蟎過敏原Derf 29和Der f 30在製備治療塵蟎過敏性疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30及其基因和應用，屬於生物醫學技術領域。塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30、分別由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示的胺基酸序列組成。編碼塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30的基因，分別由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列組成。所述的塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30在製備治療塵蟎過敏性疾病藥物中的應用。本發明的有益效果在於提供塵蟎過敏Der f 29和Der f 30及其基因，塵蟎過敏原Der f 29和Der f 30能夠作為製備治療塵蟎過敏性疾病藥物的應用。
文檔編號C12N15/12GK103073636SQ201310034209
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者賴仞, 安輸, 容明強, 李東升 申請人:中國科學院昆明動物研究所