一種用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系的製作方法
2023-05-18 13:06:41 1
專利名稱：一種用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系的製作方法
一種用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系
背景技術：
實蠅科(T印hritidae)是雙翅目(Diptera)中最大的類群，世界上已經描述的實 蠅種類超過4500餘種，有70餘種被認為是農業上的重要害蟲，已對農林作物生產構成威 脅。現階段，在實蠅的口岸檢疫鑑定工作中，主要以成蟲的外部形態特徵作為分類依據， 若截獲的是幼蟲或卵，則需對其進行室內飼養，待獲得成蟲後再進行鑑定，造成檢疫周期 長，不利於檢疫性害蟲發現與防控。
發明內容
本發明的目的在於提供一種用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系。為了實現上述目的，本發明採取的技術方案如下
本發明的用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，總體積為25μ 1 模板DNA 50ng，dNTP 200 μ mol/L，10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，引物0. 25 μ mol/L，Taq 酶0. 5U，最後加 ddH20 至 25μ 1 ；ISSR 擴增反應程序94°C預變性 5min ；94°C變性 30s ；52°C退火 45s, 72°C 延伸90s ；共36個循環；最後72°C延伸lOmin。1、模板DNA的製備。所述模板DNA的製備如下
取實蠅成蟲，加入800 μ 1提取緩衝液，於冰浴中充分研磨後移入1.5 ml Eppendorf管 中，加0. 5mg/ml蛋白酶K，混勻後於65°C水浴lh，加入8mol/L KAclOO μ 1，使其充分混勻， 然後冰浴lh，4°C下12000r/min離心20min，取上清液加入800 μ 1預冷的無水乙醇，混勻， 冰浴2h，12000r/min離心20min，取沉澱用70%的乙醇洗滌1次，5000r/min離心5min，沉澱 於37°C乾燥4 6min，最後加入10μ 1 RNA酶和40 μ 1 TE溶解，37°C水浴lh，4°C保存備 用；所述提取緩衝液配製為0. lmol/L Tris-HCLO. lmol/L NaCl，0. 2mol/L蔗糖，0. 05mol/ L EDTA,0. 5% SDS。為了得到上述技術方案，本申請人進行了一系列有益的試驗
本發明的分子反應體系從模板濃度、引物濃度、dNTP濃度和Taq DNA聚合酶用量等影 響ISSR反應的4個主要因素著手，優化了適合於實蠅ISSR-PCR擴增反應的最佳反應條件， 進而建立了一套用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系。(1) ISSR-PCR反應體系的優化
基準反應體系(總體積 25 μ 1):模板 DNA 20 ng，dNTP 200 μ mol/L, 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，引物 0.20 ymol/L，Taq_l U，最後加 ddH20 至 25μ1。①dNTP濃度優化在模板濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶用量等其它條件不變 的情況下，設計 100 ymol/LU50 μ mol/L,200 μ mol/L,250 μ mol/L,300 μ mol/L 等 5 個dNTP濃度梯度，檢驗dNTP濃度對ISSR反應的影響，以尋找最適濃度。②引物濃度優化在模板濃度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶用量等其它條件不變的 情況下，設計0.15 μ mol/L,0. 20 μ mol/L,0. 25 μ mol/L,0. 30 μ mol/L,0. 35 μ mol/L 等 5個引物濃度梯度，檢驗引物濃度對ISSR反應的影響，以尋找最適濃度。
③Taq酶用量優化在模板濃度、引物濃度、dNTP濃度等其它條件不變的情況 下，設計0.5 U、0. 75 U、1 UU. 25 UU. 5 U等5個Taq酶用量梯度，檢驗Taq酶用量對ISSR 反應的影響，以尋找最適用量。④模板濃度優化在引物濃度、dNTP濃度、Taq DNA聚合酶用量等其它條件不變 的情況下，設計了 25、50、75、100、125 ng等5個DNA模板用量梯度，檢驗模板DNA濃度對 ISSR反應的影響，以尋找最適濃度。(2) ISSR-PCR擴增產物的檢測
以DNA Marker DL 2000為標準分子量，用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物， 電壓110V，電泳時間40 min，將膠塊放到EB染色液中染色10 min，再用清水漂洗，BIO-RAD 凝膠成像儀觀察，拍照保存。(3) ISSR-PCR反應體系的建立
通過ISSR-PCR反應體系的優化和ISSR-PCR擴增產物的檢測，確定了 ISSR-PCR反應體 系。根據梯度試驗確立實蠅ISSR反應最佳反應體系(總體積25 μ 1)模板DNA 50ng, dNTP 200 μ mol/L, 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，引物 0. 25 μ mol/L，Taq 酶 0. 5U，加 ddH20 至 25 μ 1。 ISSR—般擴增反應程序94°C預變性5min ；94°C變性30s ；52°C退火45s ；72°C延伸90s ；循 環36次；最後72°C延伸lOmin。本發明的顯著優點
本發明考慮了模板濃度、引物濃度、dNTP濃度和Taq DNA聚合酶用量等4個主要影響 ISSR反應的因素，探討了最佳的反應條件，構建了實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系， 能揭示其種群間的遺傳多樣性，辨析區域間實蠅種群的親緣關係，並且快速、準確和靈敏地 檢測出實蠅種類，彌補了傳統方法的不足。本發明在檢疫性實蠅的檢測鑑別方面具有很好 的應用前景。
圖1為實蠅DNA電泳檢測圖，其中1 :桔小實蠅^2)2:瓜實蠅(22)，3南瓜實蠅 (FZ)，4南瓜實蠅(FZ) 5 瓜實蠅(FZ)；
圖2為不同的ISSR反應條件對ISSR擴增的影響；其中從左到右依次為M (Marker)， 不同濃度dNTP，不同濃度引物，不同濃度Taq酶，不同濃度模板對ISSR擴增的影響；
圖3為不同地區實蠅的ISSR分析電泳檢測圖，其中1 桔小實蠅(FZ)2:瓜實蠅(ZZ)，3 南瓜實蠅(FZ)，4南瓜實蠅(FZ) 5 瓜實蠅(FZ)。
具體實施例方式本發明的用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，總體積為25μ 1 模板 DNA 50ng, dNTP 200 μ mol/L, 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，引物 0. 25 μ mol/L，Taq 酶0.5U，最 後加ddH20至25 μ 1 ；ISSR擴增反應程序94°C預變性5min ；94°C變性30s ；52°C退火45s， 72°C延伸90s ；共36個循環；最後72°C延伸lOmin。其中模板DNA的製備如下
每個種群取5頭實蠅成蟲加入800 μ 1提取緩衝液(0. lmol/L Tris-HCl，0. lmol/ L NaCl，0. 2mol/L 蔗糖，0. 05mol/L EDTA，0. 5% SDS)，於冰浴中充分研磨後移入 1. 5 mlEppendorf管中，加0. 5mg/ml蛋白酶K，混勻後於65°C水浴lh，加入8mol/L KAclOOy 1，使 其充分混勻，然後冰浴lh，4°C下12000r/min離心20min，取上清液加入800 μ 1預冷的無水 乙醇，混勻，冰浴2h，12000r/min離心20min，取沉澱用70%的乙醇洗滌1次，5000r/min離心 5min，沉澱於37°C乾燥4_6min，最後加入10 μ 1 RNA酶和40 μ 1 TE溶解，37°C水浴lh，4°C 保存備用。實施例1
試驗所用實蠅主要採自福建省漳州地區蔬菜基地誘捕的種群。實驗所需的試劑Buffer (10 XPCR Buffer)、dNTP、DNAMarker DL 2000,Taq DNA聚合酶等購自上海生物工程有限公 司；隨機引物由上海生物工程技術服務有限公司合成；Tris、HCl、EDTA、NaCl, Kac、乙醇等 均為國產分析純試劑。具體內容如下 1、模板DNA製備及有效性驗證
利用本發明改良的DNA提取方法進行了模板DNA的提取，然後用紫外分光光度計和凝 膠電泳測定實蠅DNA濃度及純度，驗證模板DNA的有效性。(1)紫外分光光度計檢測
使用WFZ800-D3B型紫外可見分光光度計，檢測DNA的濃度和純度。取1 μ 1 DNA溶液， 以超純水為空白對照，檢測DNA樣品在260 nm、280 nm的吸光值(0D)，由此計算DNA的濃度 和純度
DNA樣品濃度(ng/μ 1) = DNA樣品的純度=OD260/OD280
其中，OD26tl為260 nm波長處DNA樣品的吸光值；OD28tl為280 nm波長處DNA樣品的 吸光值。(2)凝膠電泳檢測
以1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，取5 μ 1的DNA樣品，電泳緩衝液TBE (45 mmol/L Tris-硼酸、10 mmol/L EDTA)，電壓110 V，電泳時間約30 min，然後將膠塊放 到EB染色液中染色約10 min，用清水漂洗後，BIO-RAD凝膠成像儀觀察，拍照保存。結果表明所提取的DNA樣品的色澤近白色或無色，說明大多數雜質已經被徹底 去除。實蠅總DNA瓊脂糖電泳圖譜見圖1 (隨機抽取5份供試材料的基因組總DNA)所示。 由圖1可以看出.基因組DNA電泳得到的條帶，比較整齊清晰。分子量較大且基本無降解、 斷裂，完整性好。取20 μ IDNA提取原液稀釋100倍。在WFZ800-D3B紫外可見光分光光度 計上測得DNA的OD26tl及0D28(1。並計算出OD26tl及OD28tl的比值及樣液的濃度，結果如表1所 示。從表1可以看出0D26Q / OD280的比值為1. 81-1. 94，說明所提實蠅基因組DNA質量和 產量均較高。因此，本發明反應體系中製備的模板DNA是有效的，可達到ISSR反應的要求。表1 5份實蠅基因組DNA樣品的紫外分光光度計分析結果
權利要求
1.一種用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，其特徵在於所述分子反應 體系，總體積為 25 μ 1 模板 DNA 50ng, dNTP 200 μ mol/L，10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，引物 0. 25 μ mol/L, Taq 酶 0. 5U，最後加 ddH20 至 25 μ 1 ； ISSR 擴增反應程序94°C預變性 5min ； 94°C變性30s ；52°C退火45s，72°C延伸90s ；共36個循環；最後72°C延伸lOmin。
2.根據權利要求1所述的用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，其特徵在 於所述模板DNA的製備如下取實蠅成蟲，加入800 μ 1提取緩衝液，於冰浴中充分研磨後移入1.5 ml Eppendorf管 中，加0. 5mg/ml蛋白酶K，混勻後於65°C水浴lh，加入8mol/L KAclOO μ 1，使其充分混勻， 然後冰浴lh，4°C下12000r/min離心20min，取上清液加入800 μ 1預冷的無水乙醇，混勻， 冰浴2h，12000r/min離心20min，取沉澱用70%的乙醇洗滌1次，5000r/min離心5min，沉澱 於37°C乾燥4 6min，最後加入10 μ 1 RNA酶和40 μ 1 TE溶解，37°C水浴lh，4°C保存備 用；所述提取緩衝液配製為:0. lmol/L Tris-HCl，0. lmol/L NaCl，0. 2mol/L蔗糖，0. 05mol/ L EDTA,0. 5% SDS。
全文摘要
本發明提供了一種用於揭示實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，分子反應體系為模板DNA50ng，dNTP200μmol/L，10×PCR Buffer2.5μl，引物0.25μmol/L，Taq酶0.5U，最後加ddH2O至25μl；ISSR擴增反應程序94℃預變性5min；94℃變性30s；52℃退火45s，72℃延伸90s；共36個循環；最後72℃延伸10min。本發明構建了實蠅種群遺傳多樣性的分子反應體系，能揭示其種群間的遺傳多樣性，辨析區域間實蠅種群的親緣關係，並且快速、準確和靈敏地檢測出實蠅種類，彌補了傳統方法的不足。
文檔編號C12Q1/68GK102071255SQ20101058296
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者餘德億, 姚錦愛, 胡建峰, 陳 峰 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所