B型肝炎病毒前c/c區變異及其用途的製作方法

2023-05-18 10:03:51 4

專利名稱：B型肝炎病毒前c/c區變異及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及B型肝炎病毒前C/C區變異。基於這些變異情況，本發明提供了可用於肝癌預測以及早期(輔助性)診斷的檢測試劑或試劑盒。
背景技術：
原發性肝細胞肝癌是我國常見惡性腫瘤之一，已佔居民腫瘤死亡的第二位。B型肝炎病毒(HBV)慢性感染是導致我國肝癌發生的首要原因。我國約有HBV表面抗原(HBsAg) 攜帶者1. 2億，他們中相當部分的慢性肝炎患者，經10 20年的發展會進入肝硬化狀態， 而肝硬化患者中每十年即有30 50%的人將演變成肝癌。近年來，隨著B肝疫苗的普遍應用，我國兒童中肝炎的發病得到了很好的控制。但在那些已經感染了B肝病毒的人群中，肝癌的發病率和死亡率卻仍然呈上升趨勢。江蘇啟東是世界著名肝癌(HCC)高發區。據1978-2002年統計資料，男性肝癌的發病率為92. 7/10萬，女性肝癌的發病率為27. 8/10萬，是鄰近上海地區的兩倍。HBV感染和黃麴黴毒素暴露是導致啟東肝癌發生的兩大主要原因。啟東HBsAg陽性者肝癌的發病率較HBsAg陰性者高12倍以上。雖然日益增多的研究表明，HBV的生物學特性(包括基因型、 病毒載量及基因變異等)與病毒感染後的臨床進展密切相關，但至今有關啟東肝癌高發區 HBV流行毒株的基因組特徵及變異與肝癌的關係還研究甚少。B型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒科，其DNA為部分環狀雙鏈DNA，約有3200鹼基對，由正鏈和負鏈構成。負鏈有4個開放讀碼區(0RF)，分別為前S/S區，前C/C區，P區和X區，分別編碼B肝病毒包膜蛋白、核心蛋白(HBcAg)/E抗原(HBeAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。由於HBV複製過程中有一獨特的逆轉錄過程，故較其它DNA病毒更易發生自然突變。隨著HBV長期持續性感染，病毒基因組突變逐漸累積，在逃避宿主免疫的同時加重對肝細胞的損傷。HBV核心啟動子區(BCP)以及前C區等突變，都曾被報導與嚴重的肝臟病變相關。因此，應用HBV基因組的突變作為肝癌高危的早期預警標誌物，成為近年人們關注的熱點問題之一。隨著對HBV與肝癌關係研究的深入，到目前為止，人們發現了許多與肝癌發生密切相關的突變位點。HBV的前C基因及C基因共享同一個讀碼框(前C/C區，nt. 1814-2452)，根據不同的起始密碼子，分別編碼HBeAg以及HBcAg。由於HBeAg的起始密碼子在前C基因，故前C 基因變異會直接影響HBeAg的表達及分泌；而C基因編碼的HBcAg可通過誘導病毒特異的細胞毒T淋巴細胞(CTL)作用及通過旁路機制輔助HBV包膜特異性的B細胞產生抗ms中和抗體從而使機體完成對病毒的清除，因此C基因的某些突變則可致使病毒逃避機體免疫清除而持續感染損傷肝細胞。G1896A是HBV前C/C區最常見的突變類型，它可造成的前C蛋白翻譯終止從而使HBeAg合成受阻。除此之外，前C基因的其他位點如1856、1862等位點突變也曾被報導可降低前C蛋白信號肽斷裂而影響HBeAg的合成。Ehata等通過對HBV慢性感染者的研究，最早提出了該區C基因胺基酸84-101位(nt. 2150-2203)的變異與患者肝臟損傷相關。之後， 其他研究者證實了這一發現，並進一步補充闡述了 C基因某些突變與HBV感染後機體免疫清除間的關係。然而，迄今為止，世界範圍內關於HBV前C/C區變異與肝癌關係的研究卻甚少。由於癌症是危害人類健康的主要疾病之一。為了有效地治療和預防腫瘤(如肝癌)，目前人們已越來越關注腫瘤的早期診斷和預後，儘管目前本領域已經發現了一些位點的突變與肝癌有關，然而還有必要作進一步研究，從而為肝癌的診斷、分型或預後提供更詳盡的依據，進一步提高診斷、分型或預後的準確性。綜上所述，本領域迫切需要開發新的可用於肝癌預測以及早期(輔助性)診斷的檢測試劑或試劑盒。

發明內容
本發明的目的就是提供新的可用於肝癌預測以及早期(輔助性)診斷的檢測試劑或試劑盒，所述的試劑或試劑盒用於檢測核酸樣品中是否存在特定的B型肝炎病毒前C/C 區變異。本發明的另一目的在於提供體外檢測核酸樣品中特定的B型肝炎病毒前C/C區變異的方法。在本發明的第一方面，提供一種檢測核酸樣品中是否存在B型肝炎病毒前C/C區變異的試劑盒，它包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基 「A」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基 「A」的序列的限制性內切酶。在另一優選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基 「G」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基 「G」的序列的限制性內切酶。在另一優選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基 「C」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」的序列結合的探針；或
容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基 「C」的序列的限制性內切酶。在另一優選例中，所述的試劑盒還包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基 「W」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基 「W」的序列的限制性內切酶。在另一優選例中，上述各試劑盒中同時包括了①容器，以及裝於所述容器的特異性擴增的引物；和②容器，以及裝於所述容器的與含突變位點的序列結合的探針。在另一優選例中，所述的B型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。在另一優選例中，所述的B型肝炎病毒前C/C區核苷酸位置編號基於GenBank登錄號為⑶434374的B型肝炎病毒全基因序列。在另一優選例中，所述的引物是具有SEQ ID NO :15_16所示序列的引物對。在另一優選例中，所述的探針具有選自SEQ ID NO :18、20、22、和24中任一所示的序列。在本發明的第二方面，提供一種體外(優選非診斷性地)檢測核酸樣品中B型肝炎病毒前C/C區變異的方法，所述的方法包括以下步驟檢測該核酸樣品的B型肝炎病毒前C/C區，並與野生型的B型肝炎病毒前C/C區比較，存在選自以下變異形式就表明該個體B型肝炎病毒前C/C區存在核苷酸變異B型肝炎病毒前C/C區第1899位，G —A。在另一優選例中，所述的變異形式還包括選自下組的一種或多種B型肝炎病毒前C/C區第2159位，A —G ；B型肝炎病毒前C/C區第2189位，A —C;或B型肝炎病毒前C/C區第2203位，G —W。在本發明的第三方面，提供了一種B型肝炎病毒前C/C區核苷酸序列的用途，它被用於製備肝癌預測或肝癌早期輔助診斷的試劑或試劑盒。在本發明的第四方面，提供了一種SEQ ID NO 1_24所述的引物和/或探針或其組合的用途，它(或它們)被用作肝癌預測或肝癌早期輔助診斷的試劑；或者用於製備肝癌預測或肝癌早期輔助診斷的試劑盒。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。


圖1顯示了本研究篩選階段檢測的55條HBV全基因序列基因分型結果。其中，以 A-H起始命名的為GenBank上下來的分型標準株；以Qidong起始命名的為檢測標本， 為肝癌樣品，〇為肝炎樣品。「Qidong」表示啟東。
具體實施例方式本發明人通過大規模地對肝癌高發區B型肝炎及肝癌發病人群進行研究，首次揭示B型肝炎病毒前C/C區第1899、2159、2189、和/或2203位鹼基的突變(HBV前C/C區 1899位G — A、2159位A — G突變、2189位A — C突變以及2203位G — W突變)與肝癌的發生密切相關。因此，可將該這些位點的變異作為肝癌易感性標誌，從而設計特異性檢測所述突變位點的試劑或試劑盒。在此基礎上完成了本發明。本發明人自1992年起，建立了一個用於腫瘤病因學研究的前瞻性隊列，共計 1，638人。此隊列中慢性肝炎符合2000年《病毒性肝炎防治方案》診斷標準。隊列含 HBsAg (+)患者852例(其中男性776例，女性76例)，HBsAg㈠患者786例(男性723例， 女性63例)。迄今為止，隊列中累計發生肝癌189例，其中HBsAg(+)患者中有170例發生肝癌。隊列成員每年隨訪一次，留有完整的隨訪資料和系列血樣，長達15年。對該隊列成員的研究首次發現，B型肝炎病毒前C/C區第1899、2189、2203、2159位突變在肝癌患者中的比例顯著高於慢性肝炎患者。如本文所用，術語「B型肝炎病毒前C/C區」指B型肝炎病毒前C/C區，其核苷酸序列為GenBank登錄號⑶434374所示B型肝炎病毒序列的核苷酸第1814-2452位。以C基因型為例，野生型的B型肝炎病毒前C/C區如SEQ IDNO :25 (C基因型)和SEQ ID NO :26(B 基因型)所示。如本文所用，術語「肝癌相關的B型肝炎病毒前C/C區變異」指B型肝炎病毒前 C/C區第1899、2189、2203、和/或2159位突變，尤其是第1899位G — A (簡寫為G1899A)； 第2159位A — G(簡寫為A2159G)；第2189位A — C(簡寫為A2189C)禾Π /或第2203位 G-K簡寫為G2203W)。應理解，所述的變異可以是一個位點的突變，也可以是2、3或4個位點的突變的組合。基於本發明人的新發現，可以將B型肝炎病毒前C/C區第1899、2189、2203、2159 位的相關突變作為標誌，從而從B型肝炎病毒陽性的人群中分離出對於肝癌易感性的人群，或作為肝癌疾病的鑑別診斷、和/或易感性分析的輔助性工具；早期評估相關人群肝癌患病風險。例如，可從B型肝炎病毒陽性患者人群中分離出B型肝炎病毒前C/C區第第 1899、2189、2203、2159位發生突變的人群，作為肝癌的高發人群，從而達到早期監測早期預防的目的。此外，還可通過進一步檢測B型肝炎病毒前C/C區其它位點的突變情況來評估肝癌易感性。本發明人的研究發現，B型肝炎病毒前C/C區第1899、2159、2189、和/或2203位的突變結合可提高肝癌發生的可能性。所述突變(G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W) 在肝癌患者中的發生比例顯著高於慢性肝炎患者中的比例。基於本發明人的上述發現，可採用各種技術來檢測B型肝炎病毒前C/C區第 1899、2159、2189、和/或2203位的鹼基的突變情況，這些技術均包含在本發明中。例如，對相關位點進行序列測定，從而判斷是否發生變異。在檢測相關位點的變異時，檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此可用例如Western印跡法間接判斷基因有無突變。此外，可用相關位點特異的引物進行聚合酶鏈反應(PCR)來進行體外鑑定；或者可根據相關位點設計可特異性結合的探針來進行體外鑑定；或者可利用特異性的限制性內切酶來進行體外鑑定。作為一種可選的方式，還可採用基於PCR技術的單鹼基延伸技術來檢測變異位點，其原理是設計一條引物，位於待測變異位點的上遊，並且該引物的3'端距離變異位點一個鹼基。加入不同螢光標記的ddNTP進行反應，只有當加入的ddNTP與變異位點鹼基互補時，引物才得以延伸。可通過檢測延伸鹼基所發出的螢光來判斷變異的類型。本發明還提供了用於在分析物中檢測是否含有所述變異位點的試劑。所述的試劑例如是對相關突變位點特異的引物；對相關突變位點特異的探針；或對相關突變位點特異的限制性內切酶。本發明還提供了用於在分析物中檢測是否含有所述變異位點的試劑盒，該試劑盒包括裝在適當容器中的、用於特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」 的序列的引物；或與B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」的序列結合的探針；或可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」的序列的限制性內切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當容器中的、用於特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」 的序列的引物；或與B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」的序列結合的探針；或可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」的序列的限制性內切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當容器中的、用於特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」 的序列的引物；或與B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」的序列結合的探針；或可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」的序列的限制性內切酶。更佳的，所述試劑盒中還包括裝在適當容器中的、用於特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」 的序列的引物；或與B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」的序列結合的探針；或可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」的序列的限制性內切酶。當所述試劑盒中含有針對多於一個位點變異情況的檢測試劑時，檢測或評估的準確性可能提高。
作為本發明的可選擇的方式，所述的試劑盒中可包括特異性與B型肝炎病毒前 C/C區發生G1899A、A2159G、A2189C和/或G2203W突變的基因產物結合且不結合於相關位點未突變的基因產物的抗體。更優選的，所述試劑盒中還包括常規的可用於檢測抗原抗體結合狀況的試劑。此外，所述的試劑盒中還可包括用於提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑， 包括但不限於抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液、抗體等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或晶片圖像分析軟體等。本發明的主要優點在於(1)通過大規模地對B型肝炎或肝癌發病人群進行研究，發現並證實肝癌發生相關的新的變異位點，研究病例多，準確性高。(2)首次針對新的變異位點，設計出特異性的檢測試劑和試劑盒，為早期評估相關人群肝癌患病風險提供了新的途徑。(3)基於早期檢測結果，對於攜帶新的變異位點的B型肝炎病毒攜帶者個體，可採取加強隨訪和複查等手段，以便能夠儘早確診和治療。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(NewYork Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。材料和方法病人和標本1研究對象本研究篩選階段中所使用的血清樣品來自啟東腫瘤醫院。在初步的B型肝炎病毒肝癌相關變異篩選中，共選取了 55份病人樣品，其中20份來自於肝癌患者，35份來自於慢性肝炎患者。兩組間年齡、基因型分布均無顯著差異[年齡，肝癌組43. 57士9. 92歲 vs.慢性肝炎組37. 19士 10. 76歲，P = 0. 074 ；基因型分布(B 基因型基因型)，肝癌組2 :18vs.慢性肝炎組6 :29，P = O. 696]。本研究驗證階段中所使用的血清樣本來自1992年起在啟東肝癌高發現場建立了一個用於腫瘤病因學研究的前瞻性隊列。其中HBsAg陽性成員852名，配以年齡、性別相近、 居所相鄰的HBsAg陰性成員786名，共計1638人。隊列成員每年隨訪一次，留有完整的隨訪資料，血清每年收集一次，於-40°C保存。本研究驗證階段中的病人血清樣品均取自於此隊列HBsAg陽性組。慢性肝炎患者診斷符合2000年全國傳染病與寄生蟲病學術會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》標準；肝癌診斷符合2001年中國抗癌協會肝癌專業委員會通過的的《原發性肝癌的臨床診斷與分期》標準。在驗證階段的病例-對照研究中，選取了 206份病人樣品，其中103份來自於肝癌患者，103份來自於慢性肝炎患者，兩組的年齡、性別比率及HBV基因型分布均無顯著性差異(表1)。研究對象的性別比率符合我國肝癌發病性別比(男女約為4-5 1)；研究對象的HBV基因型分布符合肝癌高發區HBV流行情況，為研究的準確性奠定了基礎。在驗證階段的縱向調查研究中，選取了 5位肝癌確診當年伴有G1899A和/或 A2159G和/或A2189C的患者樣品進行研究，每一患者診斷肝癌前2到8年的血清中至少有 2份血清樣品可供研究。本研究的試劑盒應用階段所使用的隨訪病人血清樣品來自上海大華醫院。在回顧性研究中，共選取了 100份病人樣品，其中50份來自肝炎患者，50份來自慢性肝炎患者。本研究的試劑盒應用階段所使用的200名HBsAg陽性隨訪病人血清樣品，來自上海大華醫院。本研究中的樣品的採集都獲得了病人或研究對象的同意。表1驗證研究中的肝癌和慢性肝炎患者臨床情況及基本病毒學參數
HCC (η = 103)CH (η = 103)P值年齡50. 58 ±10. 4448. 54±10. 140. 157性別，男89(86. 4% )89(86. 4% )1. 000B基因型7(6. 8% )5(4. 9% )0. 552C基因型90(87. 4% )88(85. 4% )0. 684其他基因型6(5. 8% )10(9. 7% )0. 298其中，HCC表示肝癌；CH表示慢性肝炎。2血清HBV DNA的抽提採用經典的蛋白酶消化/酚-氯仿-異戊醇抽提法提取血清中HBV DNA。取血清 100 μ 1 加入 400 μ 1 裂解液(10mmol/L Tris-HCl ρΗ8· 0，lmmol/L EDTA, 1 OOmmo 1/L NaCl， 0. 5 % SDS，蛋白酶K 120 μ g/μ 1)50 V消化4h後加等體積酚_氯仿-異戊醇(體積比 25 24 1)抽提一次，8000r/min離心15min，上清液中加1/10體積的3mol/L乙酸鈉 (pH5. 2)和2倍體積的無水乙醇沉澱DNA。70%乙醇洗沉澱一次，沉澱揮幹後重懸於30 μ 1 含20 μ g/ml的RNA酶A無菌水中。3HBV全基因序列的擴增與測序(供HBV全基因篩選肝癌相關變異)以抽提好的HBV DNA為模板擴增HBV全基因序列，正向引物為FF1，反向引物為 FRl (表2)。將PCR產物克隆入T載體，應用T載體通用引物ml3+47/ml3-48及HBV特異性引物 HBV3096F/HBV2415F/HBV786R/HBV1329R(表 2)對 HBV 全基因序列進行測序。PCR 反應體積為50 μ 1，含IXPCR緩衝液(MgCl2L 5mM), dNTP 0. 2mM，正、反向引物各0. 2 μ M，血清 HBV DNA 1 μ 1，LA Taq IU(日本Takara公司)。擴增經預變性94°C 3min後，進入35個循環程序94°C 30sec/65°C 30min/72°C 3. 5min，最後 72°C延鏈 7min。PCR 產物經 AxyPr印試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)純化後，送全自動測序(上海聯合基因有限公司)。
4HBV前C/C區核苷酸第1824-2275位的擴增(供驗證HBV前C/C區肝癌相關位
點)以抽提好的HBV DNA為模板，採用半巢式PCR的方法擴增HBV前C區/C區 nt. 1824-2275。第一輪，正向引物為Pre-C F1，反向引物為HBV2433R ；第二輪，正向引物序列與第一輪正向引物相同，反向引物為Pre-C R2 (見表2)。PCR反應體積為25 μ 1，各成分終濃度為PCR 緩衝液 IX (MgCl2L 5mmol/L)，dNTP 0. 2mmol/L，正、反引物各 0. 4 μ mol/L，血清HBV DNA 2 μ 1，TakaRa LA Taq IU(日本TaKaRa公司)。半巢式PCR2輪擴增條件相同，均採用熱啟動PCR，經預變性94°C 3min後，進入循環程序94°C 30sec/60°C 30sec/72°C lmin, 共35個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物經AxyPr印試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)純化後，送全自動測序(上海聯合基因有限公司)。表2寡核苷酸引物
權利要求
1.一種檢測核酸樣品中是否存在B型肝炎病毒前C/C區變異的試劑盒，其特徵在於， 它包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第1899位為鹼基「A」 的序列的限制性內切酶。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，還包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2159位為鹼基「G」 的序列的限制性內切酶。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，還包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2189位為鹼基「C」 的序列的限制性內切酶。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，還包括容器，以及裝於所述容器的特異性擴增B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」的序列的引物；和/或容器，以及裝於所述容器的與B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」的序列結合的探針；或容器，以及裝於所述容器的可特異性識別B型肝炎病毒前C/C區第2203位為鹼基「W」 的序列的限制性內切酶。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的B型肝炎病毒的基因型是B基因型或C基因型。
6.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的引物是具有SEQID N0:15和SEQ ID NO: 16所示序列的引物對。
7.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的探針具有選自SEQIDNO =18,20, 22、和24中任一所示的序列。
8.—種體外檢測核酸樣品中B型肝炎病毒前C/C區變異的方法，其特徵在於，所述的方法包括以下步驟檢測該核酸樣品的B型肝炎病毒前C/C區，並與野生型的B型肝炎病毒前C/C區比較， 存在選自以下變異形式就表明該個體B型肝炎病毒前C/C區存在核苷酸變異B型肝炎病毒前C/C區第1899位，G-A0
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的變異形式還包括選自下組的一種或多種B型肝炎病毒前C/C區第2159位，A — G ； B型肝炎病毒前C/C區第2189位，A — C ；或B型肝炎病毒前C/C區第2203位，G — W。
10.一種B型肝炎病毒前C/C區核苷酸序列的用途，其特徵在於，用於製備肝癌預測或肝癌早期輔助診斷的試劑或試劑盒。
全文摘要
本發明涉及B型肝炎病毒前C/C區變異及其用途。具體地，本發明公開了檢測核酸樣品中是否存在B型肝炎病毒前C/C區變異的試劑或試劑盒。本發明還公開了體外檢測核酸樣品中B型肝炎病毒前C/C區變異的方法。本發明的研究表明，B型肝炎病毒前C/C區第1899、2159、2189、和/或2203位的鹼基的突變與肝癌的發生密切相關，可作為肝癌預測/肝癌早期輔助診斷的分子標誌物。
文檔編號C12Q1/70GK102212619SQ20101014473
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月12日 優先權日2010年4月12日
發明者屠紅, 朱宇, 金晏, 錢耕蓀 申請人:上海市腫瘤研究所