乳腺調節素，非激素依賴性乳腺癌細胞特異蛋白的製作方法

2023-05-18 05:53:21 1

專利名稱：乳腺調節素，非激素依賴性乳腺癌細胞特異蛋白的製作方法
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本發明提供了由非激素依賴性人類乳腺癌細胞產生的乳腺調節素，它能影響激素依賴性腫瘤細胞的形態、生長和激素受體的表達，這是一種自然存在的至今尚未發現的新的因子，尤其是本發明提供了純化形式的乳腺調節素，即至少部分清除與其自然結合的化合物，直至至少可測定部分胺基酸順序的高純度形式。這裡介紹了乳腺調節素的生產和純化的方法，並闡述了這一因子的發現使診斷和治療方法成為可能。
人類乳腺癌的生長是一個複雜的過程，受控於內分泌，自分泌和旁分泌產生的激素和生長因子。乳腺癌的一個重要特徵就是對於激素，尤其是雌激素的依賴性。這種激素依賴性通常隨著腫瘤的發展而消失，使得激素治療無效，而且與腫瘤侵潤性增強密切相關。腫瘤一旦進入非激素依賴階段，乳腺癌病人的預後極差。
現已發現，命名為乳腺調節素(MM)的，以前未認識到的因子是由非激素依賴性乳腺癌細胞表達的。當激素受體的表達受到抑制時，這種因子刺激侵潤性較弱的激素依賴性腫瘤細胞生長加快。目前認為在腫瘤的生長進程中，在很長一段時間內，MM對於從激素依賴到非激素依賴的表型轉換起到重要作用。
這一因子首次被鑑別、分離並純化。獲得基本上純化的MM目前可用作乳腺癌的各種診斷和治療手段。例如，可測定MM水平並用作診斷指示劑，以確定乳腺癌所處的階段和嚴重程度。能夠抑制MM細胞活動特性的物質，MM單克隆抗體或其它MM結合物均可以用作治療藥物來阻斷MM對激素依賴細胞的刺激作用，由此可使癌症穩定，避免發展到腫瘤生長的侵潤性非激素依賴階段。此外，在治療方面MM類似物可用來封閉激素依賴細胞的MM受體。
MM是蛋白質，在10-15%梯度凝膠上對高度純化製劑進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測得其表觀分子量約為52-55千道爾頓。MM含有的部分胺基酸順序為Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr(SEQ ID No1)Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys(SEQ ID No2)，和X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu(SEQ ID No3).
其中「X」代表未鑑定胺基酸殘基。
目前認為，只要保留生物學活性，該蛋白質在總體上可以含有等位基因變異，包括殘基的添加、缺失、插入或取代，變異可達全部胺基酸順序的10%，但最好不超過5%。該蛋白質還可以含有各種翻譯後修飾，例如，糖苷化作用和半胱氨酸橋的形成。
MM的另一特性是對熱和酸不穩定，對胰蛋白酶和巰基乙醇敏感，而且易與其它蛋白質形成不均一的聚合體。
按照本發明實例中所介紹的方法，可以從快速生長的非激素依賴腫瘤細胞的細胞培養物提取MM並純化成表觀均一物質。獲得MM的另一方法是利用胺基酸序列的信息從生產細胞系中篩選的cDNA文庫，得到MM基因的cDNA，然後可將基因克隆並導入適當的載體，在適當的原核細胞或真核細胞系統中表達。
純化的MM可以用作抗原，用常規的方法來生產多克隆或單克隆抗體。抗體，尤其是單克隆抗體可以(ⅰ)用作治療藥物來阻斷MM以免刺激激素依賴細胞;(ⅱ)用於檢測法中(包括生物測定、放射免疫測定(RIAs)、螢光免疫測定(FIAs)、蛋白質印跡試驗和ELISAs)以檢測乳房腫瘤活組織中MM的存在，由此可得到關於癌症發展階段和預後方面的有價值的診斷信息。
純化的MM也可用於結合試驗來篩選並鑑定對MM具有親合性的化合物，還可以用於競爭性試驗來篩選並鑑定對於激素依賴細胞的MM受體具有親合性的化合物。這些化合物可用於抑制MM的生物學活性。
此外，能抑制腫瘤細胞，尤其是乳腺癌細胞，例如非激素依賴性乳腺癌細胞中MM表達的化合物和/或對於腫瘤細胞，尤其是乳腺癌細胞，例如非激素依賴性乳房腫瘤細胞的乳腺調節素受體具有親合性的化合物都是新藥而且具有應用價值。目前已知可作為MM有效抑制劑的唯一化合物就是肝素。
實例1從非激素依賴性細胞培養物中生產含MM條件培養基人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231生長於補充了5%小牛胚胎血清的HL培養基中。按歐洲專利申請公開No.417563介紹的相同方法，製備人類白血病細胞系HL60的最佳培養基。細胞在T形培養瓶中在5%CO2平衡氣體和96%水分飽和度的條件下以粘附方式生長，倍增時間約為22-24小時。呈融合狀態後用不含血清的HL培養基來替換生長培養基，在生長過程中以及在非生長融合狀態時乳腺調節素(MM)釋放到培養基中。
採用稍加改良的23l通風發酵罐(Chemap AG，Switzerland)以大規模生產MM。通風管的外部容積用8.5kg的Raschig環(8×8×5mm，石制)和10個Siraf25環(25×25×2mm，多孔玻璃Raschig環，Schott Germany)充填，可得到約20m2的表面積。發酵罐接種2個Cell Factories單位(Nunc，每單位6000cm2)的經胰蛋白酶處理的MDA-MB-231細胞。通風發酵罐以1標準升/分鐘空氣通風，連續監測，控制溶解氧含量(30%)，pH(7.2)，溫度(37℃)。
通過每天更換17-18 1不含血清的加強HL培養基(5-7.5g葡萄糖，5-6.5mM穀氨醯胺，0.25-0.3%Primatone RL)而收集含有MM的耗盡的培養基。在整個酵解過程中按照Schumpp B.and Schlaeger E.J.，J.Cell.Sci.97∶639-647介紹的方法測定葡萄糖和穀氨醯胺消耗量和乳酸鹽及氨的生成量來監測細胞的代謝狀態。
生產過程中MM滴度保持不變。
採用裝有2個S10 Y10螺旋形濾芯(1.8m2膜面積，截止分子量為10KDa)的Amicon SP20超濾裝置(Amicon，Switzerland)將酵解罐內含MM但不含細胞的培養液濃縮20倍(100升濃縮至5.5升)。含MM的濃縮液置-80℃冷凍。
實例2用四步層析法從部分純化的MDA-MB-231細胞上清液中提純MM如果沒有另外的說明，所有操作均在室溫(RT)下進行。對各流程純化的組分均進行特性分析，方法是測定280nm處的吸光率，採用Laemmli，U.K.Nature 227，680-685(1970)介紹的還原SDS-PAGE方法和實例6中介紹的生物學活性測定。
將5.5l冷凍的濃縮上清液(按實例1中介紹的方法製備，相當於100l原始上清液)溶化，3000g離心15分鐘(4℃)。280nm，光程長度為1cm時上清液的吸光率乘以體積毫升數(＝OD280)等於35000。測定的總活性為5.8×106U(100%)，比活性為165U/OD280然後將上清液用12l下列物質8M 脲0.3mM 3-｛(3-膽醯胺丙基)-二甲氨基｝-1-丙磺酸鹽(CHAPS)30mM Tris/HCl ＜緩衝液A＞pH 7.5和1.7 1蒸餾水稀釋。再將該溶液加入Q-瓊脂糖凝膠FF層析柱(Pharmacia，Dubendorf，Switzerland)，該層析柱(1.2 l，4-8℃)已經用6M 脲0.2mM CHAPS20mM Tris/HCl ＜緩衝液B＞pH 7.5預平衡。用1個柱體積的緩衝液A洗滌層析柱，然後在7小時36分鐘內用100%緩衝液B至40%緩衝液B和60%的下列物質溶液6M 脲0.2mM CHAPS
20mM Tris/HCl ＜緩衝液C＞500mM NaClpH 7.5進行線性梯度洗脫(10ml/分鐘，RT)。緩衝液C濃度為30-50%之間時的流出組分(1550ml)含2630 OD280，7.5×106U(130%)，比活性為2852U/OD280。層析譜見

圖1。將組分合併，用配有4個PTGC室的Millipore Minitan System(Millipore，Volketswil，Switzerland)將其濃縮至210ml(4-8℃)。
將濃縮液用由下列物質組成的溶液1mM N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基丙磺酸鹽(Zwittergent 3-12)50μM 乙二醇-雙(β-氨乙基醚)N，N，N′，N′-四醋酸(EGTA)50mM Tris/HCl150mM NaCl ＜緩衝液D＞0.02% NaN3pH 7.6進行1∶15稀釋，最終體積為3150ml。將該稀釋液加入一個80ml的Heparin-瓊脂糖凝膠CL-6B層析柱(Pharmacia，4-8℃)，該柱已用緩衝液D預平衡。用24個柱體積的緩衝液D洗滌層析柱，然後進行洗脫(3ml/分鐘，RT)洗脫是用100%的緩衝液D變化至100%的由下列物質組成的溶液1mM Zwittergent 3-1250μm EGTA ＜緩衝液E＞50mM Tris/HCl
1350mM NaCl0.02% NaN3pH 7.6進行線性梯度洗脫。緩衝液E為39%至64%之間濃度時的洗脫組分(240ml)含有19.1 OD280，7.7×106U(134%)，比活性為403000U/OD280(層析譜見圖2)。將組分合併，再用裝有YM10濾膜的400ml Amicon攪拌池(Amicon，Zurich，Switzerland)將其濃縮至80ml。向其中加入80ml由下列物質組成的溶液6M鹽酸胍2.5mM Zwittergent 3-1250μm EGTA ＜緩衝液F＞50mM Tris/HClpH 7.5。
濃縮/稀釋程序重複3次。將溶液濃縮至最終體積2.6ml。將濃縮液加入Superdex 200層析柱(Pharmacia 1.6×60，120ml，1ml/分鐘)。層析柱已用緩衝液F預平衡。柱體積(20ml)的47%至63%之間的洗脫組分含有3.8 OD280，4×106U(69%)，比活性為1，050，000 U/OD280(層析譜見圖3)。將組分合併，再用裝有YM10濾膜的50ml Amicon攪拌池將其濃縮至5ml，再用5ml含有下列物質的溶液6M脲0.3mM Zwittergent 3-1220mM Tris/HCl ＜緩衝液G＞pH 7.5將其稀釋，濃縮/稀釋重複一次，將溶液濃縮至1.6ml，然後做1∶30稀釋至最終體積為48ml。將該溶液加入用緩衝液G預平衡的Mono S層析柱(1ml Pharmacia)，用12個柱體積的緩衝液G洗滌層析柱，然後洗脫(0.5ml/分鐘)，洗脫所用線性梯度是由100%緩衝液G變化至100%的由下述物質組成的溶液6M脲0.3mM Zwittergent 3-1220mM Tris/HCl ＜緩衝液H＞500mM NaClpH 7.5緩衝液H為36%至56%之間時的洗脫組分含有0.27 OD280，4.4×106U，比活性為16，000，000U/OD280(層析譜見圖4)。按活性計總產率為76%，純化因數為97000。圖5顯示了用SDS-PAGE分析的所研究組分的蛋白質組成。採用12.5%T的SDS-PAGE(還原)分析並用Coomassie R250染色時，生物學活性與蛋白質區帶的強度相關，蛋白質區帶強度說明其分子量為41-45KD之間。對部分組分將進一步純化(見實例4)。
實例3A)用五步層析法從MDA-MB-231細胞上清液中純化MM至高純度用與實例2所述的相似實驗方法從130l上清液中純化MM。與實例2不同的是在Q-瓊脂糖凝膠層析柱的全程流出液中含有更多的MM，因此，需要用全程流出液反覆進行這種層析，也要用Heparin-瓊脂糖凝膠和Superdex 200層析柱分別進行2個流程的進一步層析。Mono S柱層析的梯度改進如下
48分鐘內由0%緩衝液H變化至40%緩衝液H120分鐘內由40%緩衝液H變化至60%緩衝液H46分鐘內由60%緩衝液H變化至100%緩衝液H緩衝液H為42%至45.5%之間時的洗脫組分含有6.1 OD2804.1×106U，比活性為6.7×106U/OD280為進一步純化，採用裝有YM10濾膜的10ml Amicon攪拌池將這些組分濃縮，體積從11ml減少至0.7ml。加入2.5ml緩衝液F，再將體積濃縮至0.7ml。稀釋和濃縮重複一次。將0.7ml的樣本加入用緩衝液F預平衡的Superdex 200層析柱(1×30cm，0.5ml/分鐘)(層析譜見圖6)。採用與Pharmacia SMART系統相連接的Fast Desalting層析柱(Pharmacia)將所得組分的50μl等分試樣轉移到緩衝液G中。所得樣本用SDS-PAGE(還原，12.5%T，Coomassie染色，見圖7)分析。主要組分(m)只在41-45KD的範圍內顯示一個蛋白質區帶。在這種組分中收率為0.12 OD280，活性為4×106U，比活性為33×106U/OD280。按活性計總收率為36%，純化因數為170，000。
將在主要組分(m)之後洗脫的組分n進一步純化(見實例4)。
B)用八步層析法從MDA-MB-231細胞上清液中純化MM至高純度用與實例2所述的相似實驗方法，用下列步驟(省略Q-瓊脂糖凝膠柱層析)從146l上清液中純化MM將6.6l濃縮液稀釋並加入Heparin瓊脂糖凝膠層析柱(80ml)，用1mM CHAPS作為去垢劑。將洗脫的活性組分稀釋並加入Heparin瓊脂糖凝膠層析柱(50ml)，用1mM CHAPS作為去垢劑。用2mM精脒作為所有緩衝液的添加劑將活性組分合併，用含有4mM.Zwittergent 3-12去垢劑的緩衝液稀釋，再加入Heparin瓊脂糖凝膠層析柱(10ml)。將活性組分(8ml)合併，在補充6M鹽酸胍後分4個流程用Superdex 200層析柱(120ml)純化，每流程2ml。用10ml和2ml的Heparin瓊脂糖凝膠層析柱分兩步將活性組分合併、稀釋和濃縮。最後一步中活性最高(2×106U/ml)的組分用於實例5C所述的生長實驗。這一組分用SDS丙烯醯胺梯度凝膠(10-15%，Phast Gel，Pharmacia)分析，經銀染色後出現一條約52KDa的主帶。
實例4將MM純化為表觀均勻物按照方法A純化實例2得到的物質(組分f至h)，按照方法B純化實例3得到的組分n，因為樣本中鹽濃度很高(緩衝液F)。
方法A做4倍稀釋以降低實例2所得物質的離子強度，再用SMART層析系統(Pharmacia)在Mono S(PC 1.6/5)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)層析柱上將其濃縮。
層析柱以100μl/分鐘的流速以及由緩衝液G變化至緩衝液H(緩衝液成分見實例2′)的線性梯度(12.5%/分鐘)展開。組分按50μl一份收集，將活性組分(活性測定見實例6)合併。MM濃度的典型層析譜特徵見圖8。
方法B實例3所得物質用下列緩衝液0.1% TFA水溶液 ＜緩衝液J＞0.09% TFA乙腈溶液 ＜緩衝液K＞在反相分配層析柱PorosR/H(Perseptive Biosystems，Cambridge，MA USA)(內徑0.8mm，長度10cm)上濃縮，該層析柱用LC Packings，Amsterdam，Netherlands裝填並用Parmacia生產的SMART層析系統。
層析柱以50μl/分鐘的流速，以及由緩衝液J變化至K的線性梯度(5%/分鐘)展開。組分按25μl一份收集，將活性組分合併。
用瓊脂糖凝膠法(ProSieve Gel System from FMC Bioproducts，Rockland，ME，U.S.A)分離方法A和B所得樣本，採用高質量級SDS按照製造商說明在非還原條件下電泳分析。
電泳分析完成之後從正極到負極將瓊脂糖凝膠切成2mm厚的薄片，用含下列物質的溶液6M脲20mM Tris/HCl，pH 7.50.3mM Zwittergent 3-12 ＜緩衝液I＞0.3mM NaCl在室溫下洗脫蛋白質至少4小時。
可用相應於45-55KDa的薄片的凝膠洗脫液進行活性測定，將活性洗脫液合併。
將合併的物質加入反相層析柱Poros R/H(Perseptive Biosystems，Cambridge，MA U.S.A)(徑0.8mm，長度10cm)該層析柱由LC Packings，Amsterdam，Netherlands製備並用SMART層析分析系統(Pharmacia)。
層析柱以50μl/分鐘的流速，以及由緩衝液J變化至緩衝液K的線性梯度(2.5%/分鐘)展開。組分按12μl一份收集，合併活性組分(見實例6)。用反相分配層析柱分離MM的層析譜特徵見圖9。
在非還原和還原條件下將純化產物的等分試樣與低分子量標準蛋白質(例如，可來自Bio-Rad，Hercules，CA USA，8ng/泳道/蛋白質，泳道1)一起加樣於SDS凝膠(Phast Gel 10-15%Pharmacia)，用銀染色(圖10a)。對泳道1-3進行掃描，其結果見圖10b。230 PM的純化產物用作順序分析。將MM還原，S-羧基-氨基甲基化，再用蛋白內切酶Lys-C(Wako，Neuss，Germany)在37℃消化16小時。酶與底物的比例為1∶100。用Mini S陽離子交換柱(3×0.5cm)收集消化液，該柱已用pH2.5的20%乙腈磷酸鉀平衡。將柱用梯度NaCl展開，收集各色譜峰組分。用Vydac C4(0.1×15cm)或Brownlee RP-300(0.1×10cm)反相分配層析柱將峰組分進一步純化，用水/乙腈-0.1%TFA梯度展開，再用475A或477A順序分析儀(Applied Biosystems，Foster City，CA)進行順序分析。三種肽的胺基酸順序如下Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr(SEQ ID No1)Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys(SEQ ID No2)，和X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu(SEQ ID No3)，「X」代表一個測序周期，其中該胺基酸沒有被識別。
實例5MM對激素依賴細胞的影響A)形態學將ZR-75-1激素依賴細胞與非激素依賴性人類乳腺癌細胞MDA-MB-231的限制性培養基相作用，而誘導的形態學變化見圖11的顯微照片。細胞培養皿用Ⅳ型膠原預鋪被，在其中接種激素依賴細胞(ZR-75-1，例如，可來自美國典型培養物收集中心(ATCC)，Rockville，Maryland，USA)，50，000個/cm2，在不含血清的條件下生長3天。然後用非激素依賴性MDA-MB-231細胞限制的不含血清培養基來替換原培養基。在更換培養基之前(圖11a)，刺激後15分鐘(圖11b)、35分鐘(圖11c)和3小時(圖11d)立刻進行連續位相顯微攝影。顯微攝影表明，未受刺激的激素依賴細胞在培養中呈上皮細胞樣斑塊生長，細胞間緊密相連(圖11a)。用生產細胞的含有MM的限制性培養基或用各個純化階段的蛋白質純化物刺激後數分鐘內外周細胞呈現膜皺縮而且開始產生層形足板(圖11b)。在此之後由於細胞變為扁平，細胞集落明顯增大，細胞間連接變弱(圖11c和圖11d)。由高度純化的MM刺激的反應細胞的活動可持續數小時，然後細胞又呈現原來的斑塊狀。形態學變化持續的時間取決於MM的濃度，高濃度時持續較久。如表Ⅰ所示，在很多種激素依賴細胞均可觀察到細胞活動。表Ⅰ中的所有細胞系均有公開的來源，例如美國典型培養物收集中心(ATCC)，Rockville，Maryland，USA。
對於純化MM或MDA-MB-231細胞限制培養基的刺激，非激素依賴人類乳腺癌細胞MDA-MB-453不發生形態學改變，也不分泌致ZR-75-1或T-47D細胞膜皺縮的因子。
B)運動性激素依賴反應細胞與快速生長的非激素依賴細胞培養基或純化MM相作用後呈現與纖維細胞樣細胞形態有關的短暫的隨機運動活性。由於這種誘導的運動性，重新連接之後形成的細胞斑可能不是由與MM刺激之前的斑塊相同的細胞組成的。
C)增殖1.MM對雌激素受體陽性人類乳腺癌細胞T47-D的細胞增殖的影響。
將激素依賴性T47-D細胞接種於預先用Ⅳ型膠原鋪被的96孔細胞培養皿中，密度為每孔10，000個細胞，在無血清無酚紅培養基中生長。採用純化的乳腺調節素(按實例3B方法製備)，濃度為20U/ml。作為對照，測定了在乳腺調節素不存在和存在的條件下促細胞分裂原，即Ⅰ型胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ)及雌二醇(E2)和生長抑制因子，即腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細胞介素-1α(IL-1)的效應。5天後按照Kung et al.，Analyt.Biochem.182，16-19 1989介紹的方法測定孔中的細胞數量。可溶性染料(結晶紫)在590nm處的光密度與細胞數量線性相關，在染色時該染料為固定的細胞吸收。
如圖12所示，純化的乳腺調節素能刺激激素依賴細胞系T47-D的增殖。在該圖中條代表四次重複測定的均數和標準差。所用濃度的IGF-1能最大限度地刺激細胞，乳腺調節素對於細胞增殖沒有額外效應。單純雌二醇對細胞生長的效應不大，而乳腺調節素卻使這些細胞生長加快。同時加入乳腺調節素可使TNF-α和IL-1對於T47-D增殖的抑制效應逆轉，至少可部分逆轉。
2.MM對於雌激素受體陽性人類乳腺癌細胞MCF-7的細胞增殖的影響將MCF-7細胞接種於微孔細胞培養皿(Falcon)中，每孔7，000個細胞，在規定的無血清無酚紅條件[Kung et al.，Contr.Oncol.23，26-32(1986)]以及沒有和有25U/ml乳腺調節素或1×10-10M雌二醇條件下生長。本實驗所用的MM製劑是如圖9所示的由反相分配層析柱分離的最純物質(合併物質)。該物質的等分試樣是從層析柱中洗脫出之後立刻用不含血清培養基稀釋。3天後給培養物再補充營養。7天後將細胞固定，用上述Kung et al.，(1989)介紹的結晶紫方法測定其數量。可溶性染料(結晶紫)在590nm處的光密度與細胞數量線性相關，因為在染色時該染料為固定細胞吸收。
如圖17所示，25U/ml MM強烈刺激MCF-7的生長。也用雌二醇(E2)刺激細胞，用作細胞正常功能的對照。在圖17中受刺激培養物中的細胞數量增加是用從對照培養物中得到的數據的百分數表示的。數值代表四次重複測定的均數和標準差。
D)促細胞分裂原活性用流式細胞計數法進行細胞周期分析，結果表明MM能誘導合成期(S)激素依賴細胞的比例明顯增加，在細胞周期分析的實驗開始前2天和前1天，激素依賴MCF-7，ZR-75-1和T47-D細胞的培養物用無血清無酚紅培養基洗滌兩次。然後向培養基中補充25單位的純化MM製劑(取自圖9中反相層析柱的合併組分)。刺激後24小時收穫細胞，採用適合FACScan分析儀(Becton Dickinson，CellFIT program)的標準方案進行分析。結果表明用純化MM處理可顯著增加MCF-7、ZR-75-1和T47-D細胞中S-期細胞的百分比，與對照細胞比較，MCF-7細胞增加186%，ZR-75-1細胞增加243%，T47-1)細胞增加161%。為提供MM與這些細胞已知的促細胞分裂原之間比較的基礎，細胞用高濃度的胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ，10-8M)或雌二醇(3×10-9M)處理。由IGF-Ⅰ或雌二醇誘導的S-期細胞增加的數值是MCF-7細胞分別為176%和158%，ZR-75-1細胞分別為280%和180%，T47-D細胞分別為203%和105%。
E)激素依賴細胞的轉化快速增殖的非激素依賴細胞系MDA-MB-231的含MM的限制性培養基可明顯地抑制激素依賴性細胞的雌激素受體(ER)的水平。MCF-7細胞與含MM的培養基(30單位/ml)作用2天，其雌激素受體數量減少到約55%±10%(5次測定值的標準差)，以相同方式處理，ZR-75-1細胞的雌激素受體數量為約32%±20%，以上結果都是與未經處理的細胞比較得到的，其測定方法是採用氚化雌激素(17-β雌二醇)與完整細胞的結合試驗。
同時也證明了MM可抑制MCF-7激素依賴細胞中雌激素受體mRNA的表達。在無血清和無酚紅培養物中用20單位/ml的高度純化MM(實例2，Mono S組分g至h)來刺激MCF-7細胞(2.5×106)，或者在MM存在或不存在的條件下用1×10-9M雌二醇來刺激。處理後5小時收穫細胞，然後提取細胞中的RNA，用預製備的玻璃絲層析柱(Pharmacia)純化mRNA。測定mRNA濃度，然後將各提取物2.5μg加樣於瓊脂糖凝膠並分離。轉移到膜上(RNA印跡法)之後，用人類ER探針(圖13)進行雜交將攜帶ER信息的mRNA結合。ERmRNA在MCF-7對照細胞中表達(圖13，泳道1)。10-9M雌二醇可刺激ERmRNA的表達(圖13，泳道2)。MM在10-9M雌二醇不存在條件下(圖13，泳道3)和存在條件下(圖13，泳道4)均可顯著降低mRNA的表達。
在另外一個實驗中，無血清和無酚紅培養物中2.5×106個細胞用高度純化的MM(實例3，圖6中的組分「m」)，1×10-10M雌二醇或兩者合併物來刺激24小時，這時提取細胞中mRNA並用Pharmacia生產的QuickPrep微量mRNA試劑盒來純化。mRNA製劑用1.1%瓊脂糖凝膠分離，採用RNA印跡法將其轉移至硝化纖維素膜上，用具有放射活性的ER探針與印跡雜交。結果(圖14)表明，雌二醇可抑制mRNA對於ER的表達，MM可明顯降低ER的mRNA水平。當雌二醇與MM同時保溫時這種效應增強。
用受刺激的MCF-7細胞提取物和酶免疫試驗(EIA)測定ER和孕酮受體(PR)蛋白。在5%FCS存在條件下將MCF-7細胞接種於12孔細胞培養皿(Costar)中，密度為每孔150，000個細胞。第二天用無血清和無酚紅培養基替換原培養基。再過一天用MM(200U/ml)或雌二醇(1×10-9M)刺激平行孔內的細胞。6和48小時後清除培養基，將細胞於-70℃冷凍至少12小時。溶化後加入含有500mM KCl，10mM KH2PO4，1.5mM EDTA和5mM鉬酸鈉的225μl萃取緩衝液，按照Madedu et al.，介紹的方法[Eur.J.Cancer Clin.Oncol.24，385-390(1988)]萃取細胞，用1MKOH將pH調整至7.4。臨用前現加入濃度為0.01%的β-巰基乙醇。緩衝液4℃放置。90分鐘後，用1ml Eppendorf管將萃取液以12，000xg，4℃離心5分鐘。收集上清液，取100μl萃取液用於受體測定。用Abbott Laboratories，North Chicago，IL，USA生產的EIA試劑盒來測定ER和PR的水平。結果(圖15)表明，用MM刺激後6小時，與對照比較，MCF-7細胞的ER蛋白水平稍有下降，48小時後急劇下降。當細胞用MM刺激時，PR水平在上述兩個時間點上均與對照相似。
作為MCF-7細胞正常細胞功能對照，也測定了用雌二醇處理的細胞中ER和PR水平。目前已知雌二醇(E2)能抑制MCF-7細胞的ERmRNA和ER蛋白的表達，但卻能刺激PR的表達。而且PR的表達取決於雌二醇對ER的激活[Ree et al.，Endocrinology 124，2577-2583，(1989)]。對照實驗表明，雌二醇降低ER蛋白的表達，但卻能刺激PR蛋白的表達。MCF-7細胞的這些結果與上述Ree et al.，和Read et al.[Molec Endocrinol.3，295-304(1989)]獲得的數據一致。
F)激素依賴細胞的細胞膜蛋白的酪氨酸磷酸化作用測定純化MM(圖6的組分「m」)對MCF-7膜蛋白的酪氨酸磷酸化作用的效應。
MCF-7細胞接種於24孔Falcon細胞培養皿(2cm2/孔)中的含有5%小牛胚胎血清(FCS)密度為150，000個細胞/孔的細胞培養基中。24小時後用含1%FCS培養基替換原培養基。再過一天，在刺激之前用無血清培養基將細胞培養2小時。用濃度為20和200U/ml的MM處理細胞，包括未受刺激的對照。置37℃細胞培養孵育箱中30分鐘後，除去培養基，加入100μl/孔的還原樣本緩衝液，置烘箱內100℃加熱5分鐘萃取細胞以供含有4%SDS和2.5%巰基乙醇的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。取各萃取液60μl和等分量的EGFR參照樣本加入Tris-Tricine微凝膠(6%)並分離。在蛋白質印跡法中用含有10%甲醇pH11.0的10mM CAPS緩衝液將蛋白質轉移到PVDF膜(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上，繼而用抗酪氨酸磷酸鹽抗體檢測蛋白質。用鹼性磷酸酶標記的第二抗體來檢測酪氨酸磷酸化蛋白質，該抗體來自Upstate Biotechnology Incorporated(UBI，Lake Placid，NY，product No.17-105)，並按照生產商推薦的方法使用。結果表明，與標準分子量和用EGF刺激A431得到的磷酸化EGF受體參照物比較，MM可刺激MCF-7細胞膜蛋白質的酪氨酸特異磷酸化作用，膜蛋白質的表觀分子量約為180-190KDa(圖16)。磷酸化蛋白質的特性沒有分析。
G)用MM刺激激素依賴細胞後細胞表面EGF受體表達和erbB2水平提高12×106MCF-7細胞在直徑為10cm的塑料培養皿中的無血清和無酚紅細胞培養基中生長1天，再用30U/ml或100U/ml的高度純化MM(圖6中組分「m」)刺激24小時。用流式細胞計數法以及抗人類EGF受體細胞表面域的小鼠單克隆抗體(Ab-1，Oncogene Science，Manhasset，NY)或抗erbB2細胞表面域的小鼠單克隆抗體測定表面受體的數量，並用異硫氰酸螢光素(FITC)標記的羊抗小鼠第二抗體(Becton Dickinson，San Jose，CA)對細胞結合的小鼠抗EGF受體抗體或者抗erbB2抗體進行染色。從培養皿上刮下細胞，用無血清培養基洗滌，再用微量細胞計數器(Sysmex F-300，TOA Medical Electronics，Kobe，Japan)計數。向含有106個細胞的80μl無血清培養基中加入20μl第一抗體溶液，冰存孵育45分鐘，然後用無血清冷培養基將細胞洗滌3次，用100μl再懸浮，加入4μl FITC標記的羊抗小鼠抗體，置暗處冰存孵育45分鐘。繼而用無血清培養基洗滌細胞2次，用250μl無血清培養基再懸浮，室溫下用流式細胞計數儀(FACScan，Becton Dickinson，San Jose CA)分析。可獲得各懸浮液的FITC-螢光的直條圖，數據表示為平均螢光通道數。
有所有細胞中至少有90%被螢光抗體染色，這可通過細胞數量測定來證實，因為在流式細胞計數儀門脈衝點圖中螢光強度增加。結合螢光計算如下，用第一抗體(抗受體抗體)和FITC標記抗體孵育的樣本的螢光強度減去單純用第二(FITC標記)抗體孵育的細胞的螢光強度。
圖18和圖19給出了實驗結果。數值表示3次測定的均數。在用MM刺激的激素依賴MCF-7細胞中EGF受體水平在24小時後要比對照細胞的受體水平高出約3倍(圖18)。用100U/ml的MM刺激24小時後ErbB2水平升高35%(圖19)。
實例6分離過程中MM活性測定MM活性測定是以含有雌激素受體的細胞系T47-D形態學快速變化的誘導為基礎的。T47-D細胞生長於不含血清和酚紅的細胞培養基中，該培養基中補充了運鐵蛋白，低含量胰島素和1mg/ml的牛血清白蛋白(Gibco的Albumax I)。接種密度為25，000-35，000個細胞/cm2。接種2天後細胞用於MM活性測定。與MM反應的T47-D細胞與ZR-75-1細胞相似(與圖11a比較)，但稍敏感些而更容易處理，因為該細胞與底物結合得更為緊密。向含有待檢測細胞的孔內加入適量的含有MM的溶液，然後將培養皿立刻放回細胞培養孵育箱，保持標準溫度37℃進行細胞培養。10-15分鐘後，第二次30-45分鐘後，用位相顯微鏡放大200倍檢查細胞以便誘導膜皺縮和層形足板的形成。活性可區分為五個水平a)無活性(-)，b)弱而短暫，但許多細胞斑均出現顯而易見的膜皺縮形成(+)，c)許多細胞斑有層形足板形成而且所有細胞斑均出現膜皺縮(++)，d)所有細胞斑均有層形足板形成而且許多細胞斑有大層形足板形成(+++)，e)所有細胞斑出現密集的膜皺縮和大層形足板形成(++++)。測定結果的這種等級劃分與含有MM的培養基或層析組分的1∶2稀釋液中的最後5個等級的細胞活性情況大致相符。指定(+)活性的稀釋度定義為每毫升含1單位MM。
測定結果也有某些變異，主要取決於細胞培養物的實際情況(細胞密度，培養時間)。在其它時點和用T47-D細胞的其它培養物來測定MM活性其差別通常不大於50%至200%。
實例7抗MM的抗體對於非人類哺乳動物MM具有抗原性，因此，當動物接種MM之後便產生抗體。5μgMM兩劑便足以誘導小鼠產生抗體。從被接種動物的血液中可以分離出多克隆抗血清。
用常規的Kohler-Milstein方法產生MM單克隆抗體注射MM使適當種屬的動物免疫，獲得對MM敏感的抗體生產細胞(即脾細胞)，與適當的骨髓瘤細胞系融合以保持抗體生成細胞的傳代功能，從由此建立的選擇性永生細胞系中分離單克隆抗體。最好是用Titremax(CytRx，150 Technology Parkway，Technology Park Atlanta，Norcross，Georgia 30092)給雌性Balb/c小鼠注射MM，腹膜內注射給藥。兩周後重複注射，再過一周採集血標本測定抗體，例如可用蛋白質印跡法。將抗體水平最高的小鼠殺死，將其脾細胞與小鼠(Balb/c)骨髓瘤細胞使用PEG4000融合以保持其傳代功能並將其分布於24×24孔內。篩選由此建立的雜交瘤系，選擇出來用於生產。
實例8MM的克隆和表達用MDA-MB-231細胞的多聚(A)+RNA建立隨機引導合成的cDNA文庫，可以從中分離MM cDNA。用載體(例如λZAPⅡ載體)來形成MM融合蛋白，再用MM抗體篩選表達的蛋白質。另一種方法是可以用MM胺基酸順序信息來篩選cDNA文庫，例如用克隆雜交技術，例如在表達系統(最好是E.coli)中表達文庫，溶解克隆(例如在硝化纖維素濾膜上)，原位DNA變性並使其在濾紙上固定，用至少含有24個鹼基對的標記(最好是放射標記)寡核苷酸探針雜交，該探針具有與全部或部分MM胺基酸順序一致的cDNA鹼基序列，鑑別雜交克隆，從文庫中再獲得相應的載體，必要時採用染色體步移技術分離全部cDNA並分析其特性。一旦分離出cDNA就可以在適當的表達系統中表達，例如，像E.coli這樣的原核細胞系統。從表達系統的培養基中可分離出MM，例如，採用以上概述的方法。
實例9用肝素作為MM抑制劑由於肝素對於MM的活性具有抑制作用，所以它對於乳腺癌的治療和控制是很有用的。肝素在這方面的應用最好是腸道外給藥，最為可取的方式是放置長期的植入泵靜脈內持續輸入。儘管肝素是相對無毒的，但1000單位的實驗劑量也是高於通常的治療劑量的，因此要確保病人不會出現過敏反應。肝素製劑的應用需設計長期給藥的方案，例如具有較低的抗凝血和血管原活性。
實例10MM單克隆抗體的治療用途在治療方面MM單克隆抗體可用來阻斷MM的活性，由此可控制或減少乳腺癌的轉移。合適的給藥劑量和方式對於工藝熟練者是顯而易見的。
實例11MM多克隆或單克隆抗體的診斷用途使用MM多克隆或單克隆抗體(以下統稱抗體)的檢測試劑盒可以包括下列成份(ⅰ)抗體，最好是凍幹製劑;(ⅱ)經標記(最好是放射標記)的MM或其片斷;(ⅲ)MM含量已知的MM標準物。如果採用放射性標記MM，最好是125I-標記的MM，標記量約50-100μCi/μg。
將抗體溶解並與標記MM(或片斷)和待測定樣本或MM標準物一起保溫。保溫最好在低溫(如4℃左右)下進行，持續至少2小時，最好是4-6小時。保溫混合液的pH最好保持在5-8的範圍內，更為合適的是7或8，最好是用諸如檸檬酸鹽或Tris緩衝液等緩衝劑來調整。保溫之後將標記的MM或片斷部分與未結合片斷分離，例如可用諸如用葡聚糖包被炭等活性炭。未結合部分吸附於活性炭上，然後可用過濾法或離心法分離。可用標準技術來測定一個組分中放射活性的量，例如加入輔助溶質後用液體閃爍計數法。標記MM或與抗體結合部分的比例與未知血漿樣中MM的量成反比。定量分析時可通過分析濃度已知的MM溶液製備標準曲線。
實例12動物模型對於研究MM的作用和用拮抗劑阻斷MM作用的效果方面，接種人類乳腺癌細胞的裸露小鼠是合適的動物模型。例如，將激素依賴乳腺癌細胞(如MCF-7細胞)移植給裸露小鼠，在MM阻斷劑(例如肝素)，中和MAbs和MM受體阻斷劑不存在和存在的條件下用MM來治療輸注正形成的腫瘤，以評價MM在體內對應答細胞的作用。另一種方法是將非激素依賴性乳腺癌細胞(如MDA-MB-231細胞)接種裸鼠，用肝素、對MM有阻斷作用的MAbs和MM受體阻斷劑來治療形成的腫瘤，以評價MM在體內對生產細胞增殖的作用。
表1產生誘導膜皺縮和細胞運動因子(乳腺調節素，MM)或對該因子應答的人類腫瘤細胞和正常乳腺細胞。
細胞和 雌激素受 細胞活動因 對MDA-MB 對純化MM細胞系 體的表達 子的分泌(1) -231的CM 的反應(2)的反應MDA-MB-231 ATCC HTB 26 - + - -HBL-100 ATCC HTB 124 - + - -Hs578T(3) ATCC HTB 126 - + - -Hs578Bst(4) ATCC HTB 125 - (+) - -SK-BR-2 III ATCC HTB 29 - + - -MDA-MB-453 ATCC HTB 131 - - - -BT-20 ATCC HTB 19 - - - -MCF-7 ATCC HTB 22 + - + +ZR-75-1 ATCC CRL 1500 + - + +ZR-75-30 ATCC CRL 1504 + - + +T-47D ATCC HTB 133 + - + +MDA-MB-361 ATCC HTB 27 + - + +BT-474(5) ATCC HTB 20 (+) - (+) +正常上皮細胞/類器官 - (+) -正常間質細胞(6) + - -
(1)結果來自由所列細胞的限制性培養基(CM)刺激乳腺調節素反應細胞ZR-75-1和T-47D後形態學變化的觀察。將新鮮無血清培養基加入每種細胞(無血清生長)的融合細胞培養物中，3天後收集培養基進行測定，測定方法如實例6所述。「+」代表用100μg/ml肝素抑制後明顯可見的細胞活動;
(+)代表較弱的細胞活動。
(2)高度純化的因子(圖6中組分「m」)。
(3)同一腫瘤標本的腫瘤細胞系和(4)肌上皮細胞系。
(5)BT-474細胞表達很低水平的ER和PR。
(6)取自發育異常的乳腺組織。
Hs578Bst，MDA-MB-453和BT-20是雌激素受體陰性細胞，細胞培養時生長速度慢，只產生很低的或不可測出的乳腺調節素活性。
順序清單(1)一般情況(ⅰ)申請人(A)姓名F.HOFFMANN-LA ROCHE AG(B)街道Grenzacherstrasse 124(C)城市Basle(D)洲BS(E)國家瑞士(F)郵政編碼(ZIP)CH-4002(G)電話061-6884256(H)傳真061-6881359(I)電傳962292/965542 hlr ch
(ⅱ)發明題目新型有機化合物及其應用(ⅲ)順序數量3(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機Apple Macintosh(C)作業系統System 7.1(Macintosh)(D)軟體Word 5.0(2)SEQ ID No1情況(ⅰ)順序特徵(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片斷類型內部(ⅹⅰ)順序說明SEQ ID NO1Leu Val Leu Arg Xaa Xaa Glu Thr1 5(2)SEQ ID No2的情況(ⅰ)順序特徵(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片斷類型內部
(ⅹⅰ)順序說明SEQ ID NO2Ser Glu Leu Arg Ile Asn Lys1 5(2)SEQ ID No3的情況(ⅰ)順序特徵(A)長度9個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片斷類型內部(ⅹⅰ)順序說明SEQ ID NO3Xaa Leu Xaa Asn Pro Xaa Xaa Tyr Leu1 權利要求
1.純化形式的乳腺調節素。
2.根據權利要求1所述的乳腺調節素，其中它是a)用10-15%梯度SDS聚丙烯醯胺凝膠法分析是分子量為約52-55KDa的蛋白質b)含有部分胺基酸順序如下Leu-Val-Leu-Arg-X-X-Glu-Thr(SEQ ID No1)Ser-Glu-Leu-Arg-Ile-Asn-Lys(SEQ ID No2)，和X-Leu-X-Asn-Pro-X-X-Tyr-Leu(SEQ ID No3)，其中「X」代表未識別的胺基酸殘基;c)對熱和酸不穩定，對胰蛋白酶和巰基乙醇敏感;和d)可從非激素依賴乳腺腫瘤細胞中獲得。
3.編碼權利要求1或權利要求2所述的乳腺調節素的DNA或cDNA序列。
4.用於多克隆或單克隆抗體生產的權利要求1或2所述的乳腺調節素。
5.用於鑑別能抑制其活性的化合物的權利要求1或2所述乳腺調節素。
6.包括下列步驟的權利要求1或權利要求2所述乳腺調節素的生產方法a)培養非激素依賴性乳腺腫瘤細胞；和b)從培養基中分離乳腺調節素。
7.包括下列步驟的權利要求1或權利要求2所述的乳腺調節素的生產方法a)將權利要求3所述的DNA或cDNA插入到載體中;b)用載體轉染原核或真核細胞系;c)從轉染的細胞系中選擇能表達乳腺調節素的細胞;d)在適當的培養基中培養選擇的細胞;和e)從生物質中提取乳腺調節素。
8.能抑制乳腺調節素生物學活性的化合物，肝素除外。
9.具有至少一種下列活性的權利要求8所述的化合物a)抑制腫瘤細胞乳腺調節素的表達，尤其是乳腺腫瘤細胞;b)對乳腺調節素有親合性;c)對腫瘤細胞的乳腺調節素受體有親合性，尤其是乳腺腫瘤細胞。
10.能夠識別權利要求1或2所述乳腺調節素中至少一個表位的多克隆或單克隆抗體。
11.權利要求10所述的抗體，它是單克隆。
12.用於乳腺癌治療和控制的藥用組合物，它含有一種或多種下列乳腺調節素活抑制劑a)權利要求8或權利要求9所述的化合物;和/或b)權利要求10或權利要求11所述的乳腺調節素抗體;以及藥用載體或稀釋劑。
13.用於測定乳腺調節素水平的試劑盒，它包括如權利要求10或11中要求的多克隆或單克隆抗體。
14.抑制乳腺調節素活性的化合物的鑑別方法，該方法包括測定所述化合物效應的測定步驟，所述化合物的效應是在包括乳腺調節素和激素依賴乳腺癌細胞的試驗系統中根據任何一個或多個下列參數進行檢測a)激素依賴性細胞的形態學;b)激素依賴性細胞的運動性;c)激素依賴性細胞的增殖;d)激素依賴性細胞的促細胞分裂原活性;或e)激素依賴性細胞向非激素依賴細胞的轉化。
15.權利要求1或2所述的乳腺調節素在多克隆或單克隆抗體生產中的應用。
16.權利要求1或2所述的乳腺調節素在鑑別抑制乳腺調節素活性的化合物方面的應用。
17.用權利要求6和7所要求的方法製備的權利要求1或2所述的任何乳腺調節素。
18.在此所述的全部新產品、新過程和新應用。
全文摘要
乳腺調節素(MM)是由非激素依賴性乳腺腫瘤細胞表達的一種新的52-55KDa蛋白質，現已發現它影響激素依賴性乳腺腫瘤細胞的形態學、運動性、生長和激素受體的表達。MM的存在，例如在腫瘤活組織中，是重要的診斷指徵。諸如MM的MAbs和MM拮抗劑等MM活性抑制劑可用於乳腺癌的治療和控制。
文檔編號C07K14/82GK1111910SQ94190470
公開日1995年11月15日 申請日期1994年6月17日 優先權日1993年7月6日
發明者U·艾彭堡格, W·孔, H·蘭根, E·J·施萊格, K·懷耶 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司