生物矽-粘附蛋白納米複合材料合成和在牙科中的應用的製作方法

2023-05-06 17:28:11

專利名稱：生物矽-粘附蛋白納米複合材料合成和在牙科中的應用的製作方法
生物矽-粘附蛋白納米複合材料合成和在牙科中的應用
背景技術：
矽石作為分子篩的組分、作為食品添加劑、載體、穩定劑(如在牙膏 中)以及作為半導體裝置的絕緣體，廣泛用於工業和醫藥中，如用於製造 玻璃、陶瓷、塗料、膠粘劑以及催化劑。矽石在納米(生物)技術中也是重 要的材料。矽石的生產工藝大多要求高溫條件以及極端的pH。值得注意 的是，某些單細胞或多細胞有機體，包括硅藻、多孔動物以及高等植物， 在周圍低溫、低壓以及近中性pH條件下，能形成它們的矽石骨架。另外， 這些有機體骨架元件的產生是高保真性的且拷貝數巨大，因此，使得這 些有機體以及解釋它們的目的骨架形成的機制可用於製造具獨特特性的
新生物^圭(biosilicas)。
海洋和淡水多孔動物具有酶促合成矽石(生物矽)的獨特能力。這種能 力使得多孔動物受到(納米)生物技術的高度關注。迄今，用於生產矽石(玻 璃)的方法需要高溫、高壓以及侵蝕性化學製品的存在。多孔動物能在生 物學的以及環境無害的條件下高精確度和高重複性地通過酶(生物催化劑) 合成;圭納米結構。
矽質多孔動物骨架的主要元件是針樣骨針，其由尋常海綿綱 (Demospongia)和六放海綿綱(Hexactinellida)內的無定形非晶體珪石組成。
骨針形態和骨針生物起源的現有技術描述於Uriz et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:163-193; Miiller et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:195-221。多孔動物骨針的蛋白石矽石(opal sinica)含有6-13%的水， 對應於式(Si02)2 H20 (Schwab & Shore (1971) Nature 232:501-502)。尋常 海綿綱類生物骨針的形成開始於軸絲周圍，矽石在軸絲的周圍酶促沉積。
已經描述了在形成矽石的有機體中與Si02骨架的合成和/或降解有關 的兩種酶以及它們的4支術應用。
第一種酶是存在於多孔動物骨針(針)軸絲中的Q!-矽酸鹽蛋白(silicatein-a)(也稱為A主酸鹽蛋白)(PCT/US99/30601: Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides， metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly(silicon/ metallo)oxane materials under environmentally benign conditions(在環境無害的條{牛下，用於催化和在空 間上指導矽醇鹽(silicon alkoxides)、金屬醇鹽(metal alkoxides)和它們的有 機共扼物的縮聚以製備矽石、聚矽氧烷(polysiloxanes)、聚金屬氧烷 (polymetallo-oxanes)以及混合的聚(矽/金屬)氧烷材料的方法、組合物和 仿生催化劑，如矽酸鹽蛋白和嵌段共聚多肽)。發明人/申請人Morse DE, Stucky GD， Deming， TD， Cha J, Shimizu K, Zhou Y; DE 10037270 A 1。 Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung.發明人/申i奮人Mtiller WEQ Lorenz B， Krasko A, Schr6der HC; European Patent No. 1320624(歐洲專利號1320624)。 Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof(矽酸鹽蛋白介導的無定形矽酸鹽和矽氧烷的合成及其用途)。發明 人/申i青人Mtiller WEQ Lorenz B， Krasko A， Schr6der HC;國家階段 US2003134391;第20030407號；日本第2002-516336號；中國第1460110T 號；加拿大第2,414,602號；澳大利亞第2001289713號)。已經從海洋矽 質多孔動物寄居蟹皮海綿OS"Z^n'tes ^mw"cw/fl)克隆了這種酶(Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878-4887)。矽酸鹽蛋白能由有機矽化合物(烷 氧基矽烷)合成無定形石圭石(聚石圭酸和聚矽酸鹽)(Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:361-365)。
除了 a-矽酸鹽蛋白外，發明人從淡水多孔動物中還克隆了其他的矽 酸鹽蛋白包括/5-矽酸鹽蛋白(專利申請DE10352433.9. Enzym- und Template-gesteuerte Synthese von Silica aus nicht-organischen Siliciumverbindungen sowie Aminosilanen und Silazanen und Verwendung. 申請人:University of Mainz(美因茲大學)。發明人Schwertner H, Mtiller WEG, Schr6der HC)以及4種矽酸鹽蛋白同種型(矽酸鹽蛋白-al-4; DEI 02006001759.5.KontrollierteHerstellungvonSilber- undGold-Nanopartikeln und Nanokristallen definierter Gr6Be und Form durch chirale Induktion mittels Silicatein.申i貪人/發明人Tremel W, Tahir MN, Miiller WEG. Schr6der HC)。矽酸鹽蛋白在與表面結合後保留了其催化活 性(Tahir et al. (2004) Chem Commun 2004:2848-2849)。
第二種酶是屬於碳酸酐酶(carbonic anhydrase)群組的矽酶(silicase)(德 國專利第10246186號。In vitro and in vivo degradation or synthesis of silicon dioxide and silicones, usefUl e.g. for treating silicosis or to prepare prosthetic materials, using a new silicase enzyme (可用於利用i斤石圭酶治療石圭 肺或製備修復術材料的二氧化矽和矽樹脂的體外和體內降解或合成)。申 請人University of Mainz(美因茲大學)。發明人Miiller WEQ Krasko A， Schr6der HC; PCT/EP03/10983. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. 申請人: University of Mainz(美因茲大學)。發明人Mtiller WEQ Krasko A, Schr6der HC)。這種酶是在海洋多孔動物寄居蟹皮海綿中首次發現的，能在游離矽 酸形成的過程中溶解矽(Schr6der et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:250-268)。另外，矽酶，在可逆反應中，也可介導多聚體的合成 (DE10352433.9. Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. 申請人:University of Mainz(美因茲大學)。發明人Miiller WEQ Schwertner H， Schr6der HC)。 同矽酸鹽蛋白一樣，矽酶也受到納米技術的關注，例如在醫藥和微電子 中用於矽基質的修飾。
矽石是用作組織工程骨和軟骨中的包括生物活性玻璃和合成材料的 支架材料的重要成分(Hench and Wilson (1984) Science 226:630-636; Yamamuro et al. (1990) Handbook on Bioactive Ceramics, Vol I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics (生物活性制陶術手冊第一巻生物活性玻璃 和玻璃制陶術)，CRC Press, Boca Raton, FL)。生物相容性和穩定性是決定 這些材料適用性的關^:特徵，改進用於手術(如骨替換)和牙科的這些材料 的需求日益增加。多聚體矽和其他基於矽氧烷的材料的化學合成通常需 要劇烈的條件，如高溫和高壓，以及使用腐蝕性化學品，這可損害用作 合成材料的組分的有機分子。然而，矽質多孔動物在環境條件(低溫和低
9壓)下，利用矽酸鹽蛋白的生物催化活性，能合成它們的矽骨架。
本發明人證明，當培養於用矽酸鹽蛋白和I型膠原蛋白預包被並隨後
利用矽酸鹽蛋白底物TEOS通過用生物矽進行包被而受到修飾的培養平 板上時，人類骨肉瘤SaOS-2細胞的礦化(磷酸鈣的形成)顯著增加 (Schr6der et al. (2005) J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 75B:387-392; DE102004021229.5. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung bioaktiver, Osteoblasten-stimulierender Oberflachen und Verwendung. 申請 人University of Mainz(美因茲大學)。發明人Schwertner H, Miiller WEQ Schr6derHC)。這些結果表明，生物矽修飾的表面是生物活性的並可用於 提高成骨細胞的功能。
重組的石圭合成酶(silica-synthesizing enzyme)(石圭酸鹽蛋白)的可用性為
段。本發明人也解決了以可持續的方式產生新的生物材料即多孔動物生 物義圭的才支術其是通過建立多孔動物細胞團培養物(primmorph culture，多 孔動物細胞培養的特殊形式；專利/專利申請DE19824384.7、 PCT/EP99/ 03121和EP99955288.8)而實現的。細胞團的矽石產生可通過某些添加劑 而i曾力口(EP05012162.3. Selenium-enriched liquid media for the cultivation of siliceous sponges and for biogenic silica production(用於培養石圭質多孑L動物 以及用於產生生物來源的矽的竭富集液體培養基)。申請人University of Mainz(美因茲大學)。發明人Mtiller WEQ Schr6der HC， Osinga R, Schwertner H》
粘附蛋白
已知粘附蛋白來自貽貝(貽貝粘附蛋白MAPs (mussel adhesive proteins),如足蛋白1和Mefp-l)。貽貝能經由由粘附蛋白組成的粘附斑 (adhesive plaques)將自身附著於金屬、陶瓷以及玻璃的表面。這些粘附蛋 白含有高百分比的3，4-二羥苯丙氨酸(DOPA)。紫貽貝(M,7w e^/fc)的 Mefp-l具有序列為Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-DHP-Hyp-Thr-DOPA-Lys的串聯 樣重複的十肽(tandem-like repeating decapeptide)。對表面的粘附受鄰苯二 酚氧(catechol oxygens)介導。粘附蛋白也存在於其他的海洋生物體中，如海參屬(Holothuria)種類。 本發明人已經研究並首次描述了海參屬Z/o/^Awn'a/orac幼'的顧維爾氏器 官(Cuvier organs)的生化粘附機制(Miiller et al. (1972) Cytobiologie 5:335; Mtiller et al. (1976) Biochim Biophys Acta 433:684);

圖1 。另夕卜，本發明人 還證明，多孔動物也含有將一元酚(monophenols)轉變為二元酚的酪氨酸 酶(Miiller et al. (2004) Micron 35:87)(圖2)。
發明概述
本發明涉及合成無定形二氧化矽(矽石)、矽氧烷和這些化合物的修飾 物的方法、用於合成無定形二氧化矽(矽石)、矽氧烷和這些化合物的修飾 物的重組的；圭酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白(recombinant silicatein-silk fibroin fUsion proteins)的用途以及它們在牙科中的醫藥用途。
發明的詳細描述
描述了含有矽酸鹽蛋白(矽石形成序列)序列以及絲心蛋白序列的融 合蛋白以及編碼此融合蛋白的cDNA。矽酸鹽蛋白用於(生物)矽石的生物 催化形成，而生物矽可以單獨地或作為納米複合材料(nanocomposite)的組 分用作牙齒填充材料。絲心蛋白可用作粘附蛋白("水下膠粘 劑"("underwaterglue"))，將矽酸鹽蛋白和由矽酸鹽蛋白形成的矽石納米顆 粒附著於牙齒的牙釉質或包括金屬、塑料和複合材料的其他固體材料的 表面。幾種類型和同種型的矽酸鹽蛋白可用於構建融合蛋白，例如使用 PCR方法，分離自寄居蟹皮海綿的編碼o:-矽酸鹽蛋白多肽的cDNAs。相 關的cDNAs可分離自其他的海洋多孔動物，如GeoAa Q^om'wm,或分離 自淡水多孔動物，如繁茂膜海綿(Z^wm'raha 6a/ca/e"w》。融合蛋白，或 其部分，可與人類牙釉質來源的肽或含DOPA的肽/蛋白結合，因而可設 計基於矽石/肽的納米複合材料。
本發明的另 一方面是用於體外或體內合成矽石(矽酸和/或矽酸鹽的 濃縮產物)、矽氧烷和其他的金屬氧化物以及這些化合物的混合多聚體的 方法，其中所用的融合蛋白含有顯示了與SEQ ID NO.l所示的序列至少 25%的序列同源性優選同一性的a-矽酸鹽蛋白結構域。對於合成而言，使用方法，其中諸如下列的化合物可以用作底物
矽酸，單烷氧基矽烷三元醇(monoalkoxysilanetriols)，單烷氧基矽烷二元 醇(monoalkoxysilanediols),單》克氧基石圭義克酉f"(monoalkoxysilanols)， 二步克氧 基石圭烷二元醇(dialkoxysilane-diols), 二烷氧基石圭烷醇(dialkoxysilanols)， 三烷氧基矽烷醇(trialkoxysilanols)，四烷氧基娃烷(tetraalkoxysilanes)，烷 基-、芳基-或金屬-矽烷三元醇，烷基-、芳基-或金屬-矽烷二元醇，烷基-、 芳基-或金屬-矽烷醇，烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基矽烷二元醇，烷基-、 芳基-或金屬-單烷氧基矽烷醇，烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基矽烷醇，烷 基-、芳-基或金屬-三烷氧基矽烷。通過使用這些化合物的限定混合物， 可以製備混合的多聚物。
根據本發明另外優選的方面，通過將融合蛋白結合於其他分子或玻 璃、金屬、金屬氧化物、塑料、生物多聚體或其他的材料表面作為模板， 可形成限定的2維或三維結構。
根據本發明另外優選的方面，提供了修飾含有表面結構的羥基磷灰 石(實例牙釉質)、矽石或金屬氧化物的方法，其中融合蛋白用於進行修 飾，其含有與SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示的序列具有至少25。/。的 序列同源性優選同一性的矽酸鹽蛋白和/或絲心蛋白結構域。
含矽石結構或含矽石表面。
本發明另外優選的方面涉及根據SEQIDNO. 1的來自寄居蟹皮海綿 的a-矽酸鹽蛋白或同源多肽的融合蛋白，所述同源多肽具有與SEQ ID NO.l所示的序列具至少25%的序列同源性優選同一性的的a-矽酸鹽蛋白 結構域的胺基酸序列或其部分。
"同源性"定義為比對候選胺基酸序列和參考胺基酸序列即a-矽酸 鹽蛋白結構域，如有必要，引入空位，以獲得最大百分比同源性後，候 選胺基酸序列中與參考胺基酸殘基即a-矽酸鹽蛋白結構域中的殘基相同 的殘基的百分比。用於比對的方法和電腦程式是本領域公知的。可用 來或適合測定候選序列是否落入此定義內的一種電腦程式是由 Genentech Inc.創4乍的"Aling2"。
本發明另一優選的方面涉及核酸，特別是根據SEQ ID NO. 3以及
12SEQ ID NO. 4的核酸，其中，該核酸編碼本專利申請所示的多肽。所述 核酸可以是DNA、 cDAN、 RNA或起混合物。核酸的序列含有至少一個 內含子和/或polyA序列。
本發明的另 一優選方面涉及(a)融合蛋白(嵌合蛋白)構建體(construct) 形式的核酸或(b)具有分別蛋白表達(蛋白酶切割位點)的構建體形式的核 酸。核酸也可以合成的方式產生。必要的方法是現有技術。
本發明另一優選的方面涉及載體，優選下列形式的載體質粒、穿 梭載體、噬菌粒、粘粒、表達載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或顆 粒、納米顆粒或脂質體，其中載體含有本發明的核酸。此外，這些載體 優選含有本發明融合蛋白的納米顆粒或脂質體形式，可用於蛋白的轉運。
本發明另 一優選方面是用本發明的載體轉染宿主細胞或用本發明的 顆粒感染或轉導宿主細胞。這種宿主細胞可表達權利要求1或7的多肽 或其部分。可以使用任何已知的宿主細胞有機體，諸如酵母、真菌、多 孔動物、細菌、CHO細胞或昆蟲細胞。
本文請求保護的融合蛋白可以以合成的方式產生或存在於原核或真 核細胞或細胞提取物或裂解物中。細胞提取物或裂解物可以由來自體內 (ex Wvo)或來自體夕卜Ojc v"ra)的細胞如重組細菌細胞製備。
本文請求保護的融合蛋白可利用現有技術的方法進行純化，因而基 本上不含其他的蛋白。
融合蛋白中的粘附蛋白可用於調控矽酸鹽蛋白和生物矽構造區 (biosilica building blocks)只十表面的附著。
此外，本發明的融合蛋白或核酸也可用於調節矽和矽移植物的代謝 和再吸收。矽酸鹽蛋白可以由單體矽前體合成多聚體矽，因此可用於移 除體細胞吸收的單體。最後，本文所述的本發明可應用於用本文所述的 核酸轉染細胞，用於調節矽和矽移植物的代謝和再吸收。用於上文提到 的實際應用的方法是現有技術，可很容易地適應於具體的要求。
此外，已知含聯苯酚的蛋白/肽，特別是含DOPA(3，4-dihydroxy phenylalanine， 3,4-二羥基苯丙氨酸)的蛋白/肽可作為水性環境中的膠粘 劑。本發明人克隆了多孔動物酪氨酸酶並表達了重組蛋白。這種酶利用 一元酚化合物合成聯苯酚。通過利用重組多孔動物酶製備的含DOPA的蛋白和肽可用於在表面上結合矽酸鹽蛋白/生物矽構造區。
經由特別修飾的含DOPA的蛋白和肽的粘附，可以在不同材料(金屬、
玻璃、塑料等)的表面上通過用含DOPA的蛋白和肽進行包被產生圖案。 可以使用金屬(鈥、鈥合金或CoCr)表面和所選塑料和複合物材料的
表面兩者。鄰苯二酚氧特別是對Fe(in)和其他的離子具有強烈的親和性，
因而其對含DOPA的肽和蛋白在表面上的結合很重要。
在骨和移植物(如由鈦、鈦合金或CoCr製成的金屬移植物)之間產生
穩定的連接是主要的問題。金屬移植物"生物組織化(biologisation)"的
一種方式是用含DOPA的蛋白和肽包被表面。
重糹且的石圭酸鹽蛋白-絲心蛋白融4、蛋白的表達和《、離
重組的矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的製備優選在大腸桿菌(E co/z〕 中進行。在酵母細胞和哺乳動物細胞中製備所述重組的蛋白也是可能的， 並且已經成功進行。將cDNA克隆至適宜的載體，如/;7h:歷W-r(9屍0 (Invitrogen)。 在大腸桿菌轉化後，通過 IPTG (isopropyl畫/5-D-thiogalactopyranoside，異丙基畫/3-D-碌b代半乳糖苷)誘導石圭 酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的表達(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學現行實'驗方案).John Wiley and Sons, New York)。可利用如存在於重組蛋白中的組氨酸標籤，在適宜的親 和性基質如Ni-NTA基質(Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519) 上，進行矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的表達和重組蛋白的純化。
使用兩種可選構建體進行a-矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的表達。
1.無蛋白酶切割位點的融合蛋白的製備
為了用a-矽酸鹽蛋白多肽和絲心蛋白製備融合蛋白，使用適宜的表 達載體(如p7Vc/似2-:TOPO載體；Invitrogen)。製備在5'端和3'端兩端都 具有例如7VcoI限制位點的a-矽酸鹽蛋白cDNA。移除a-矽酸鹽蛋白cDNA 中的終止密碼子。使用PCR技術(PCR-Technik)且擴增所用的引物具有各 自的限制位點。因此製備編碼第二蛋白的cDNA，藉此在5'末端使用與a-^i酸鹽蛋白cDNA的3'端相同的限制位點(在本實施例中為iVcoI)，且在3， 端，也有iVcoI限制位點。
14採用標準的步驟，連接兩種cDNAs，將其純化並與/ 7)r歷W-rO屍(9 載體連接。靠近組氨酸標籤進行連接。使用例如存在於重組蛋白中的組 氨酸標籤的融合蛋白的表達和純化，可利用適宜的親和基質如Ni-NTA基 質(Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519)進行。
2.分別表達(蛋白酶切割位點)
可選地，對於l中的步驟，在編碼a-矽酸鹽蛋白多肽的cDNA和編 碼絲心蛋白的cDNA之間克隆蛋白酶切割位點(如腸激酶位點)。在表達和 純化後，以蛋白水解的方式切割融合蛋白。隨後分離兩種蛋白。
在下面的實施例中描述了含有來自寄居蟹皮海綿的a-矽酸鹽蛋白基 因和來自地中海貽貝(M;;"/ms ga〃o/ rav/"c^fo)的絲心蛋白基因的融合蛋 白在大腸桿菌中的表達。在這個實施例中，使用僅含有催化活性結構域 的矽酸鹽蛋白插入片段(短矽酸鹽蛋白形式)；使用含有該蛋白的完整氨基 酸序列的插入片段也是可能的。
用於構建編碼融合蛋白的cDNAs的矽酸鹽蛋白cDNAs已有描述。
編碼來自寄居蟹皮海綿的a-矽酸鹽蛋白和/3-矽酸鹽蛋白的cDNAs 是，a-矽酸鹽蛋白AJ272013 (Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267:4878-4887); /3-矽酸鹽蛋白AJ547635和AJ784227 (Schr6der et al. (2004) Cell Tissue Res 316:271-280)。編碼a-矽酸鹽蛋白的寄居蟹皮海綿 cDNA的核苷S臾序列，顯示於圖3中。編碼a-矽酸鹽蛋白的寄居蟹皮海 綿cDNA的推導的胺基酸序列，顯示於圖4中。
編碼來自繁茂膜海綿的矽酸鹽蛋白al-4的cDNA是a矽酸鹽蛋白 AJ872183;石圭酸鹽蛋白a2: AJ968945;矽酸鹽蛋白a3: AJ968946;矽酸鹽 蛋白a4: AJ968947 (Wiens et al. (2006) Dev Genes Evol 216:229-242)。
編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的核苷酸序列顯示於圖5中。 編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的推導的核香酸序列顯示於圖6 中。
編碼絲心蛋白的地中海貽貝cDNA的核苷S吏序列和推導的氨基S吏序 列，顯示於圖7和圖8中。
載體； 7>r/fe2-rOPO (Invitrogen)用於產生融合蛋白；； 7h:州W-:rO屍0 的核苷酸序列，請參考圖9。其他的表達載體也已證明是合適的。使用限制酶iVcol (C山CATGG)。這種限制酶 在絲心蛋白cDNA上無限制位點 在a-石圭酸鹽蛋白cDNA上無限制位點 在one restriction site inp7h://^2載體上有一個卩艮制^f立點。 含有用Wcol消化的突出端(overhangs)的下列引物用於矽酸鹽蛋白 cDNA:
iSV/zTVoc—For/
CCA TGG TTC TTG TCA CAG TGG TAG TAC TG (SEQ ID No. 10)。
在第一步中，使用下列特異性引物，從; w-0)/Z) cDNA中分離編碼 絲心蛋白的序列 皿F
5' GGT GGA CTC GGA GGA GC 3、 (SEQ ID No. 12)。
5、 ATA TCC TGG TTT GTG ATA GC 3、 (SEQ ID No. 13)。 隨後將絲心蛋白cDNA克隆(T/A克隆)至栽體； 7Vc/^^-rOPO
(Invitrogen)。隨後用所得的質粒轉染細菌菌4朱BL121 。
對於a-矽酸鹽蛋白序列，構建含有突出端的下述的反向引物，以便
用這種突出端作為蛋白酶(腸激酶)結合位點
5, ATC GTC ATC TAG GGT GGG ATA AG 3' (SEQ ID No.
14) 。
在下一步驟中，構建含有突出端的下列引物 礎TVoc一For/
5、 CCA TGG TTC TTG TCA CAG TGG TAG TAC TG 3、 (SEQ ID No.
15) 。
5、 CCA TGG ACT TGT CAT CGT CAT CTA GG 3、 (SEQ ID No. 16)。 這些突出端用來作為限制酶TVcoI的限制位點。p7h^fo2載體也具有這種限制酶的限制位點。這允許用載體和擴增的矽酸鹽蛋白進行雙消化。 所述消化後，將矽酸鹽蛋白克隆至絲心蛋白的前方。
用於從絲心蛋白中切割矽酸鹽蛋白的蛋白酶結合位點(腸激酶識別位 點)顯示於圖10中。
在用A^coI消化後，將具有蛋白酶結合位點的矽酸鹽蛋白cDNA克隆 至絲心蛋白cDNA前方的； 7 ci^2載體(圖11)。
大腸桿菌轉化後，通常用IPTG誘導矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白 的表達，並在37。C進行4或6小時(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學現行實驗方案).John Wiley and Sons, New York)。例如在Ni-NTA基質上通過親和層析，純化所得的融合蛋白。 為了從絲心蛋白中分離矽酸鹽蛋白，用腸激酶切割融合蛋白。隨後在2-巰基乙醇存在的情況下，將該蛋白進行凝膠電泳。凝膠電泳可在具有0.1% NaDodS04的10%聚丙烯醯胺凝膠中進行(聚丙烯醯胺凝膠電泳， polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)。用考馬斯亮蘭染色凝月交。切割、 純化合和隨後的PAGE後，獲得短形式的重組矽酸鹽蛋白和絲心蛋白。
使用抗體分離和純化矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白 可在親和性基質上進一步純化a-矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白。親 和性基質可例如通過將a-矽酸鹽蛋白特異性抗體固定於固相(CNBr-激活 的瓊脂糖或其他適宜的載體)來製備。可使用針對a-矽酸鹽蛋白的單克隆 抗體或多克隆抗體，其採用標準的方法(Osterman (1984) Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol. 2 (蛋白和核酸研究的方法第二巻); Springer-Verlag [Berlin])製備。根據製造商(Pharmacia)的使用說明書，將 抗體與基質偶聯。通過pH變化或離子強度變化，進行純a-矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的洗脫。
也可以使用其他的親和性基質。
矽酸鹽蛋白活性和矽石合成的檢測
為了測定重組矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白的酶活性，進行測定實 驗，該測定基於水解以及隨後的四乙氧基矽烷(TEOS)的聚合後測量聚合通常如下進行重組矽酸鹽蛋白的酶活性的測量。將融合蛋白用適合酶促反應的緩衝液如pH 6.8的50 mM MOPS [pH變動範圍為4.5到10.5 的其他緩衝液，也是合適的]透析過夜。將融合蛋白(1-50嗎)溶解於lml的適宜緩衝液，諸如補充了 1 ml 1-4.5 mM TEOS溶液的50 mM MOPS (pH 6.8)。酶促反應可在室溫下進 行。60分鐘孵育後，通常每100 pg矽酸鹽蛋白合成200nmol無定形矽石。 通過離心(12 000xg; 15分鐘；十4。C)收集矽石產物，用乙醇洗滌並空氣 千燥。隨後將沉澱溶解於1 M NaOH中。使用基於鉬酸鹽的測定如矽測 定(Merck),定量測定溶解的矽酸鹽。可以使用下述底物四烷氧基矽烷，三烷氧基矽烷醇 (trialkoxysilanols)， 二烷氧基矽烷二元醇(dialkoxysilanediols)，單坑氧基珪 》克三元酉享(monoalkoxysilanetriols)， 二》克氧基石圭》克酉孚(dialkoxysilanols)， 單 烷氧基矽烷二元醇(monoalkoxysilanediols)， 單烷氧基矽烷醇 (monoalkoxysilanols)，烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基矽烷，烷基-、芳基 -或金屬-矽烷醇，烷基-、芳基-或金屬-矽烷二元醇，烷基-、芳基-或金 屬-矽烷三元醇，烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基矽烷二元醇，烷基-、芳 基-或金屬-二烷氧基矽烷醇，或其他的金屬氧化物前體(鎵、鋯或鈦的烷 氧基化合物)。因此，可以產生混合的多聚體。反應可在溫和的條件下進行。因此，本發明介紹了節省能量、環境 友好的方法。使用矽石而不是羥磷灰石(其是真正的再生)的另 一個原因是，因為矽 石更抗酸，而羥》壽灰石和"天然，，牙釉質一樣是齲#文感的。矽酸鹽蛋白-粘附蛋白融合蛋白的結合矽酸鹽蛋白絲心蛋白融合蛋白和由矽酸鹽蛋白產生的(生物)矽石可 以與下列物質結合使用a)人牙釉質來源的肽。這些肽允許設計基於矽石/肽的納米複合材 料。它們是生物相容的，無需濾去潛在地引起副作用的樹脂單體或添加 劑。18b)含DOPA的多肽/蛋白。使用多孔動物酪氨酸酶，可製備這些多肽 /蛋白。它們用作矽酸鹽蛋白/生物矽表面結合的膠粘劑(生物)矽石與牙釉質來源的肽/蛋白的結合使用來自牙釉質的肽的理由是因為它們在牙釉質中遞送內聚力，並 將在矽石複合材料中產生最佳的可能的粘合，以及產生基於矽石的納米複合材料向齲齒引起的齲洞的牙釉質邊緣粘附。在樹脂膠(resin adhesives) 的下側，它們是"能感知水的"並傾向於水解降解。(生物)矽石與含DOPA的蛋白和肽的結合從海洋多孔動物中克隆的重組酪氨酸酶(Mtiller et al. (2004) Micron 35:87)用於合成含有3,4-二羥基苯基丙氨酸(DOPA)單位的粘附多肽或蛋 白。採用所述的方法(Marumo and M&ite (1986) Biochim Biophys Acta 872:98; Akemi Ooka and Garrell (2000) Biopolymers 57:92)，進行所用的含 酪氨酸蛋白和肽的酶促羥基化作用。由於酪氨酸酶介導的酪氨酸羥基化 後形成的DOPA到其它產物特別是多巴醌的氧化，在蛋白或肽中的酪氨 酸殘基到DOPA的酶促羥基化作用可能存在一個問題。多巴醌能與賴氨 酸殘基形成交聯。為了減少來自DOPA的氧化產物的形成，在羥基化過 程中加入抗壞血酸；抗壞血酸將形成的多巴醌和其他氧化產物還原為鄰 苯二酚。在低分子量肽羥基化過程中，通過離心/過濾(微孔過濾膜)除去 酶。通過反相HPLC，將抗壞血酸從產物中分離。使用"GST融合"系統("GST Fusions" system, Amersham)製備重組多 孔動物酪氨酸酶。所得的GST融合蛋白通過在穀胱甘肽-瓊脂糖4B上的 親和層析來純化。為了從重組多孔動物酶中分離穀胱甘肽-S-轉移酶，用 凝血酶切割融合蛋白。使用作為L-酪氨酸底物，在磷酸鹽緩衝液中進行 酪氨酸酶酶促活性的測定。在280nm處，測量轉化為L-DOPA(3，4-二羥 基苯基丙氨酸)的酪氨酸。也可以使用重組的多孔動物酪氨酸酶《奮飾,圭酸鹽蛋白，該酶將一元 酚(如酪氨酸殘基)轉化聯苯酚。所得的膠粘劑蛋白可用於連接由生物矽(由矽酸鹽蛋白合成)製成的形成高階結構(higher-ordered structures)的構造區。 ce-矽酸鹽蛋白絲心蛋白融合蛋白的應用本發明的另外方面是oc-矽酸鹽蛋白絲心蛋白融合蛋白的下列應用。1. )牙齒材料表面修飾的應用(與目前所用的材料相比，改進生物相 容性、更高的穩定性和更高的多孔性)。2. )製備新牙齒材料(複合材料)的應用，如牙齒替換材料。3. )製備用於由金屬、金屬氧化物、塑料和其他材料製成的牙齒材料 的包被的應用；特別是製備這些材料上的單分子層(生物組織化；在骨和 牙齒材料間形成穩定連接)。4. )融合蛋白中存在的粘附蛋白("水下膠粘劑")將矽酸鹽蛋白和生 物矽構造區(由矽酸鹽合成的生物矽顆粒)粘附於表面(金屬、玻璃等)以連 接形成高階結構的生物矽構造區的用途。5. )生物矽作為牙科中填充顆粒(filler particles)的用途。與常規材料相 比，生物矽具有兩種優勢1.其合成是環境友好的，因為它利用重組酶^圭 酸鹽蛋白)或生物反應器(細胞團)酶促產生的。2.用矽酶，可實現表面修_ 飾，不需要高能或侵蝕性化學品。以下是圖例說明和序列方案圖1.海參屬生化粘附機制的首次描述。左兩種顧維爾氏管(Cuvier tubuli)。 A, 內圓筒(inner cylinder); B，夕卜圓筒(outer cylinder)。右附著 於石蠟的顧維爾氏管(Mtiller and Zahn (1972) Cytobiologie 3: 335-351)。圖2.通過多孔動物酪氨酸酶將一元酚向聯苯酚的轉化(以及進一步 向醌的氧化)。圖3.編碼a-矽酸鹽蛋白的寄居蟹皮海綿cDNA的核苷Sl^列。用於 構建引物的序列加了下劃線並以粗體標記。ATG起始密碼子加有雙下劃 線(SEQ ID No,5)。圖4.編碼a-矽酸鹽蛋白的寄居蟹皮海綿cDNA的推導的胺基酸序列。圖5.編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的核苷酸序列。用於構20建引物的序列加有下劃線並以粗體標記(SEQ ID No. 6)。圖6.編碼前膠原蛋白D的地中海貽貝cDNA的推導的胺基酸序列 (SEQ ID No. 7)。圖7.編碼絲心蛋白的地中海貽貝cDNA的推導的胺基酸序列(SEQ ID No. 8)。圖8.編碼絲心蛋白的地中海貽貝cDNA的核苷酸序列和推導的氨基 酸序列。用於構建正向引物和反相引物的序列加了下劃線並以粗體標記 (SEQ ID No. 9)。圖9.載體；77)r/^2-r(9屍(9(Invitrogen)的核香酸序列。圖10.用於通過腸激酶從絲心蛋白切割矽酸鹽蛋白的蛋白酶結合位 點(腸激酶識別位點)。圖11.用Wco/消化後，將具有蛋白酶結合位點的矽酸鹽蛋白基因克 隆至絲心蛋白cDNA前方的； 7 c//^2載體。SEQ ID No. 1:來自寄居蟹皮海綿的a-矽酸鹽蛋白多肽的胺基酸序列 (rSILICAa—SUBDO)，SEQ ID No. 2:來自地中海貽貝絲心蛋白多肽的胺基酸序列 (rSILKFIB—MYTGA),SEQ ID No. 3:編碼來自寄居蟹皮海綿的a-矽酸鹽蛋白多肽的cDNA 的核酸序列。SEQ ID No. 4:編碼來自地中海貽貝的絲心蛋白的cDNA的核酸序列。
權利要求
1. 融合蛋白，其含有矽石形成酶和粘附蛋白。
2. 如權利要求1所述的融合蛋白，其含有介於所述矽酸鹽蛋白形 成酶和所述粘附蛋白之間的蛋白酶切割位點。
3. 如權利要求1所述的融合蛋白，其中所述矽石形成酶是矽酸鹽 蛋白。
4. 如權利要求1所述的融合蛋白，其中所述矽石形成酶是Q!-矽酸 鹽蛋白。
5. 如權利要求1所述的融合蛋白，其中所述粘附蛋白是絲心蛋白。
6. 如權利要求3、 4或5中任一項所述的融合蛋白，其含有介於Sf X去處容紘4n 6fr ;A :i't 疋■> lVTI AA 電l V^r上 /, i "^"-^'「j" h入_nu a h , 乂 ,1〃 j j^《u ,i j H , —J w 'j w ' j工,r;、。
7. 如權利要求2、 3、 4、 5或6中任一項所述的融合蛋白，其中 所述蛋白酶切割位點是腸激酶切割位點。
8. cDNA，其編碼權利要求1-7中4壬一項所述的融合蛋白。
9. 合成權利要求1-7中任一項所述的融合蛋白的方法。
10. 納米複合材料，其含有權利要求1-7中任一項所述的融合蛋白。
11. 納米複合材料，其含有權利要求1-7中任一項所述的化合物以 及適宜的添加劑和補充劑。
12. 如權利要求10或11所述的納米複合材料，其中一種或幾種組分以儲存化合物的形式或作為前體與適宜稀釋液或載體物質共存。
13. 如權利要求10-12中任一項所述的納米複合材料，其中這種 複合物具有其他的生物學活性，即與其他的化合物正相互作用並調節 磷酸鈣(羥基磷灰石)沉澱、牙釉質細胞更新以及顯示抗菌活性。
14. 使用這些融合蛋白和納米複合材料，體外或非人類體內合成 二氧化矽(矽酸或矽酸鹽的濃縮產物；也稱為矽石)、矽和包括鈦氧化 物(二氧化鈥)、4告氧化物(氧化鋯)、氧化4夾和4凡氧化物的其他金屬氧4匕 物以及混合的多聚體的方法。
15. 使用這些融合蛋白和納米複合材料，體外或非人類體內合成 二氧化矽(矽酸或矽酸鹽的濃縮產物；也稱為矽石)、矽和包括鈦氧化 物(二氧化鈦)、鋯氧化物(氧化鋯)、氧化鐵和釩氧化物的其他金屬氧化 物以及混合的多聚體的方法。
16. 體外或非人類體內合成二氧化矽(矽酸或矽酸鹽的濃縮產物； 也稱為矽石)、矽和包括鈦氧化物(二氧化鈦)、鋯氧化物(氧化鋯)、氧 化鐵和釩氧化物的其他金屬氧化物以及混合的多聚體的方法，其中所 用的融合蛋白含有粘附蛋白結構域，所述粘附蛋白結構域顯示了與 SEQ ID NO. 1所示的序列的至少25%的序列相似性。
17.體外或體內合成二氧化矽(矽酸或矽酸鹽的濃縮產物；也稱為 矽石)、矽和包括鈦氧化物(二氧化鈦)、鋯氧化物(氧化鋯)、氧化鐵和 釩氧化物的其他金屬氧化物以及混合的多聚體的方法，其中所用的融 合蛋白含有矽酸鹽蛋白結構域，所述矽酸鹽蛋白結構域顯示了與SEQ ID NO. 1所示的序列的至少25%的序列相似性。17. 如權利要求14-16所述的方法，其中，矽酸，矽酸鹽，單烷 氧基矽烷三元醇，單烷氧基矽烷二元醇，單烷氧基矽烷醇，二烷氧基 矽烷二元醇，二烷氧基矽烷醇，三烷氧基矽烷醇，四烷氧基矽烷醇， 烷基-、芳基-或金屬-矽烷三元醇，烷基-、芳基-或金屬-矽烷二元醇， 烷基-、芳基-或金屬-矽烷醇，烷基-、芳基-或金屬-烷氧基矽烷二元醇， 烷基-、芳基-或金屬-單烷氧基矽烷醇，烷基-、芳基-或金屬-二烷氧基 矽烷醇，烷基-、芳基-或金屬-三烷氧基矽烷或其他金屬氧化物前體化 合物，用作合成的底物。
18. 如權利要求17所述的方法，其中限定複合物的混合的多聚體 是使用所述化合物的限定的混合物產生的。
19. 如權利要求14-17中任一項所述的方法，其中通過融合蛋白 在用作模板的玻璃、金屬、金屬氧化物、塑料、生物多聚體或其他的 材料上的表面結合，產生限定的2維或3維空間結構。
20. 使用重組的多孔動物酪暴.酸酶製備含DOPA的蛋白和肽的方法。
21. 使用含DOPA的多肽，將矽酸鹽蛋白/生物矽構造區結合於表 面(金屬表面、塑料表面或複合材料的表面)的方法。
22. 牙齒填充材料，其通過利用上述權利要求所述方法獲得。
23. 如權利要求8所述的核酸，其為(a)融合蛋白(嵌合蛋白)構建體 的形式或(b)具有分別蛋白表達(蛋白酶切割位點)的構建體的形式。
24. 如權利要求23所述的核酸，其中所述核酸是DNA、 cDNA、 RNA或其混合物。
25. 如權利要求8、 23或24中任一項所述的核酸，其中所述核酸 的序列含有至少 一個內含子和/或poly A序列。
26. 如權利要求8和權利要求23-25中任一項所述的核酸，其中 所述核酸是以合成的方式產生的。
27. 載體，其優選為下列形式質粒、穿梭載體、噬菌粒、粘粒、 表達載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體或顆粒、納米顆粒或脂質體， 所述載體含有權利要求8和權利要求23-25中任一項所述的核酸。
28. 載體，其優選為納米顆粒或脂質體形式，含有權利要求1-7 中任一項所述的多肽。
29. 宿主細胞，其用權利要求8和權利要求23-28中任一項所述 的載體轉染或用權利要求8和權利要求23-28中任一項所述的顆粒感 染或轉導。
30. 如權利要求29所述的宿主細胞，其中權利要求1-7所述的多 肽或其部分得以表達。
31. 如權利要求1-7中任一項所述的多肽，其中所述多肽是以合 成的方式產生的。
32. 如權利要求1-7中任一項所述的多肽，其中所述多肽存在於 原核或真核細胞提取物或裂解物中。
33. 如權利要求1-7中任一項所述的多肽，其中所述多肽得到純 化且基本上不含其他蛋白。
34. 上述權利要求所述的多肽、核酸或納米複合材料用於調節矽移植物中矽和矽單體的再吸收的用途。
35. 上述權利要求所述的核酸用於轉染細胞以調節矽移植物中矽 和珪單體的再吸收的用途。
36. 由矽酸鹽蛋白酶促產生的矽石或其他金屬氧化物和粘附蛋白作為金屬、金屬氧化物、塑料和其他材料的包被的用途，特別是在這 些材料上產生單分子層的用途。
37. 矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白與生物相容的人類牙釉質來 源的肽/蛋白的結合物(基於矽石/肽的納米複合材料)的用途。
38. 矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白與含DOPA的蛋白和肽的結合 物的用途。
39. 使用矽酸鹽蛋白產生的(生物)矽石作為牙科的填充顆粒的用途。
全文摘要
本發明涉及牙科的矽酸鹽蛋白-絲心蛋白融合蛋白合成用作填充材料的含矽的納米複合材料的用途。
文檔編號C12N15/62GK101506365SQ200780031255
公開日2009年8月12日 申請日期2007年8月21日 優先權日2006年8月23日
發明者海因茨·C.·施洛德, 維爾訥·E·G·米勒, 維爾訥·K·戈特森 申請人:海洋納米技術有限公司