用於控制血液葡萄糖的不溶性組合物的製作方法

2023-05-07 00:37:21

>起始蛋白人胰島素蛋白質量(mg)179(溶解人胰島素的DMSOml)20NAS醯基鏈1，4-二氯苯基硫基-乙醯基N-醯基-琥珀醯亞胺的質量(mg)30DMSO體積(ml)1.0加入的NAS溶液的體積(ml)0.412反應時間(min)50總得率(％)32.2*分子量(理論值)6026.78分子量(ESMS)6026.9HPLC純度(％)96醯化位點(HPLC)Nε*根據脫鹽的凍幹粗製產物的重量計算得率。實驗1共晶體在狗中的時間作用在接受恆定輸注促生長素抑制素以產生短暫糖尿病狀態的正常狗中，測定本發明的三種共晶體組合物的時間作用。基本上按照以上製備16中關於製劑D所述，製備包含人胰島素和B29-Nε-辛醯基-人胰島素的第一種共晶體製劑，將其以3nmol/kg的劑量皮下給予(「8753」)。基本上按照以上製備16中關於製劑D所述，製備包含人胰島素和B29-Nε-辛醯基-人胰島素的第二種共晶體製劑，將其以2.5nmol/kg的劑量皮下給予(「8752.5」)。最後，按照以上製備14中所述，製備包含人胰島素和B29-Nε-癸醯基-人胰島素的第三種共晶體製劑，將其以2.5nmol/kg的劑量皮下給予(「10252.5」)。將該數據與在同一模型中在給予HumulinN(2.0nmol/kg「NPH」)、牛/豬特慢胰島素(3nmol/kg，「BP-UL」)和鹽水後觀察到的數據進行比較。在過夜禁食的長期插管的重10-17kg的清醒雄性和雌性小獵犬(MarshallFarms，NorrhRose，NY)中進行實驗。在該項研究之前至少10天，用異氟烷(Anaquest，Madison，WI)麻醉動物，並將連接至血管入口端(vascularaceessport)(V-A-PTM，AccessTechnologies，NorfolkMedical，Skokie，IL)的矽氧烷導管插入股動脈和股靜脈。導管充滿甘油/肝素溶液(3∶1，v/v；肝素終濃度為250KIU/ml；甘油得自SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO，而肝素得自Elkins-Sinn，Inc.，CherryHill，NJ)，以防止導管阻塞，然後封閉傷口。手術前給予(20mg/kg，IV和20mg/kg，I.M.)頭孢唑啉(EliLillyCo.，IndianapoIis，IN)，手術後給予頭孢氨苄(250mg，每日口服1次，給予7天)以防止感染。手術後給予Torbugesic(1.5mg/kg，I.M.)以控制疼痛。正好在研究當天之前取血，確定動物的健康情況。只使用血細胞比容高於38％和白細胞計數低於16，000/mm3的動物(血液學分析儀Cell-Dyn900，Sequoia-Tumer，MountainView，CA)。該實驗當天早晨，進入所述埠(AccessTechnologies，NorfolkMedicai，Skokie，IL)；抽吸導管的內容物；用鹽水衝洗導管(BaxterHealthcareCorp.，Deerfield，IL)；將狗置於籠中；延長管線(extensionline)(由一條不鏽鋼系鏈保護，並連接至一個旋轉系統[InstechLaboratories，PlymouthMeeting，PA])連接至埠入口管線(portaccessline)。在取動脈血液樣品用於測定禁食胰島素、葡萄糖和胰高血糖素濃度之前(時間=-30分鐘)，讓狗適應籠中環境至少10分鐘。此時，開始給予連續的IV輸注環狀促生長素抑制素(0.65μg/kg/min；BACHEMCalifornia，Torrance，CA)，並持續接下來的30.5小時。開始輸注後30分鐘(時間=0分鐘)，取動脈血液樣品，在頸背側麵皮下注射大劑量的測試物質或溶媒。此後每3小時取動脈血液樣品，用於測定血漿葡萄糖和胰島素濃度，每6小時取動脈血液樣品，用於測定血漿胰高血糖素濃度。整個研究持續30小時。將動脈血液樣品收集到含EDTA二鈉(TerumoMedicaiCorp.，Elkton，MD)的真空血液收集管中，立即置於冰上。將一部分血樣品(1.5ml)轉移至含40μl抑酶酞(10，000KIU/ml；Trasylol，Miles，Inc.，DiagnosticsDivision，Kankakee，IL)製劑的聚丙烯試管中，以測定血漿胰高血糖素濃度。將樣品離心，並將所得的血漿轉移至聚丙烯試管中，並在研究期間貯存於冰上。在研究當天，用葡萄糖氧化酶法，在市售葡萄糖分析儀中測定血漿葡萄糖濃度。用於其它測定的樣品貯存於-80℃，直至用於分析時。用雙抗體放射免疫測定法測定胰島素濃度。用放射免疫測定試劑盒(LINCOResearch，Inc.，St.Charles，MO)測定胰高血糖素濃度。實驗結束時，用新鮮鹽水衝洗導管，用頭孢唑啉(20mg/kg)處理，並充入甘油/肝素混合物；口服抗生素(頭孢氨苄；250mg)。可能時為了使所用動物數最小化並使資料庫配對，對動物研究多次。以1周的最小間隔，在再研究的動物中進行實驗。關於人胰島素和B29-Nε-辛醯基-人胰島素的1∶3共晶體的時間作用，在較高劑量(8753)下，其時間作用比NPH人胰島素的時間作用長9小時(24小時對15小時)，在較低劑量(8752.5)下比NPH人胰島素的作用時間長6小時(21小時對15小時)。通過統計學比較平均葡萄糖水平與對照組(鹽水)的平均葡萄糖水平，測定時間作用。人胰島素和B29-Nε-辛醯基-人胰島素的1∶3共晶體製劑的葡萄糖分布圖比NPH-人胰島素的分布圖更象預期的基礎胰島素的分布圖。所述1∶3共晶體的活性也比牛/豬特慢胰島素的活性更高，具有更想要的葡萄糖分布圖。與對照(鹽水)相比由所述共晶體製劑引起的血液葡萄糖的降低，其持續時間比由這種牛/豬特慢胰島素引起的血液葡萄糖降低的持續時間更為長久。人胰島素和B29-Nε-癸醯基-人胰島素的1∶3共晶體(10252.5)的時間作用比NPH人胰島素長9小時(24小時對15小時)。這種差異在統計學上是顯著的(p＜0.05)。在相同動物中，人胰島素和B29-Nε-癸醯基-人胰島素的3∶1共晶體製劑(2.5nmol/kg，SC)的時間作用比或者HumulinU或牛U製劑長6小時(24小時對18小時)。這種差異在統計學上也是顯著的(p＜0.05)。所述共晶體製劑的葡萄糖分布圖比NPH-人胰島素的分布圖更象預期的基礎胰島素的分布圖。此外，當給予所述3∶1共晶體時，在狗中的時間作用的變異性最小。總之，這些數據表明，本發明的共晶體在狗中有效地在延長的時間內控制葡萄糖水平。它們也支持這樣一種結論本發明的共晶體在2型糖尿病患者的過夜葡萄糖控制方面、或作為1型或2型糖尿病患者的基礎/大劑量胰島素療法的基本武器將是有效的。它們也提示，這些製劑可以產生可變性小於市售胰島素製劑的反應。實驗2共晶體在豬中的時間作用在正常的重17-25kg有感知的雌豬中進行研究。經外科手術預先植入動脈(頸動脈或股動脈)導管用於取樣，以及植入頸靜脈管線用於給予促生長素抑制素。在實驗之前，讓插管的豬禁食22-24小時。在耳後柔軟的皮膚中皮下給予胰島素注射，劑量為3.0nmol/kg(0.5單位/kg)。同時給予0.3μg/kg/min的促生長素抑制素(溶於含1％人血清白蛋白的0.9％NaCl中，MilesCanada，Etobicoke，ON)，以抑制內源胰島素的分泌。通過以可變的速率輸注20％葡萄糖維持接近血糖量正常，並且頻繁監測葡萄糖濃度。用葡萄糖氧化酶法，用市售的葡萄糖分析儀對研究當天的新鮮血漿樣品測定血漿葡萄糖水平。在血糖正常控制(clamp)研究中，在研究開始時(時間0)，皮下給予5頭豬包含1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-人胰島素的本發明微晶製劑，劑量為0.5U/kg(相當於約3nmol/kg)。連續測定維持血糖正常所需的葡萄糖輸注速率(設定點=約90mg/ml)。對照組接受皮下給予的相同劑量的HumulinN(U100)(n=6)。在整個實驗期間維持同時輸注促生長素抑制素(0.3μg/kg/min)。對於本發明的微晶，在前2個小時內葡萄糖輸注速率穩定上升，達到約7mg/ml/min的最大值。此後，直至約17.5小時，葡萄糖輸注速率相當穩定的降至約0.5mg/kg/min。在17.5小時和24小時時的研究結束之間的大多數時間，葡萄糖輸注速率維持在約0.5至約2mg/kg/min。相比之下，在對照組中平均葡萄糖輸注速率(HumulinNPH)穩步上升，在給藥後約3小時時達到約14mg/kg/min的最大值。此後，到約4.5小時為止，輸注速率降至約7mg/kg／min，到給藥後13小時時降至約5mg/kg/min。對於對照組沒有取進一步的數據。這些結果與包含摩爾比為1∶3的胰島素和B29-Nε-辛醯基-人胰島素的微晶製劑的葡萄糖動力學分布圖比胰島素NPH更為平坦這一結論是一致的。實驗3共晶體在大鼠中的時間作用在BBDP/Wor大鼠中測試包含1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-人胰島素的本發明微晶製劑，所述大鼠為遺傳上特徵鑑定的動物模型，由與BiomedicalResearchModels，Inc.(Rutland，MA)有聯繫的MassachusettsMedicalCenter大學(Worchester，MA)保有並提供。DPBB/Wor大鼠系有糖尿病傾向，表現出依賴於胰島素(自身免疫)的糖尿病。所有製劑均以0.9U/100g體重的劑量皮下給予。將BBDP/Wor雄性大鼠[4-5月齡，維持長效胰島素(PZI]隨機分配為5個實驗組-A、B、C、D和E。組A(n=22)用U40人特慢胰島素(HumulinUL)處理3天；組B(n=18)用IletinUltralente的U40製劑(65％牛胰島素，35％豬胰島素)處理3天；組C(n=10)用如上製備的包含1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-人胰島素的微晶製劑處理3天；組D(n=21)用包含100％B29-Nε-辛醯基-人胰島素微晶製劑處理；而組E接受U40牛-豬PZI胰島素(PZI)。在測定血液葡萄糖之前2天和測定血液葡萄糖的當天，給予每隻大鼠日劑量的其組製劑。在給予測試製劑之前半小時獲取血液。於11∶30A.M.給動物注射所述製劑樣品。通過在尾部刻痕(未麻醉)取血。在冰上短暫貯存樣品，然後離心，並用BeckmanⅡ葡萄糖分析儀測定葡萄糖。恰好在給予測試製劑之前以及給予測試製劑之後2、4、6、8、12、16、20和24小時時獲取血液樣品。考慮到由低於200mg/dL的血液葡萄糖水平指示的合適的控制，所述製劑提供約9.5小時(HumulinUL)、約12小時(IletinU)、約15.5小時(本發明)、約20.5小時(100％B29-Nε-辛醯基-人胰島素)和約21.5小時(PZI)的控制。因此，本發明的微晶製劑控制血液葡萄糖的時間比HumulinUL和IietinU獲得的時間長，而比用或者100％B29-Nε-辛醯基-人胰島素微晶製劑或者PZI製劑獲得的時間短。實驗4無定形沉澱在大鼠中的時間作用在BBDP/Wor大鼠中測試如製備19中所述製備的包含1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-人胰島素、1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰島素和1∶3胰島素∶B29-Nε-壬醯基-人胰島素的無定形沉澱製劑。所有製劑均以0.9U/100g體重的劑量皮下給予。將BBDP/Wor雄性大鼠[4-5月齡，維持長效胰島素(PZI)]隨機分配為5個實驗組-A、B、C、D和E。組A(n=7)用U40NPH(HumulinN)製劑處理。組B(n=8)用1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-人胰島素的U42.4製劑處理。組C(n=8)用1∶3胰島素∶B28-Nε-辛醯基-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰島素的U42.6製劑處理。組D(n=8)用1∶3胰島素∶B29-Nε-壬醯基-人胰島素的U42.7製劑處理。組E用U40牛-豬PZI胰島素(PZI)處理。在給予測試製劑之前半小時獲取血液。於11∶30A.M.給動物皮下注射所述測試製劑(0.9U/100g體重)。通過在尾部刻痕(未麻醉)取血。在冰上短暫貯存樣品，然後離心，並用市售葡萄糖分析儀測定葡萄糖。恰好在給予測試製劑之前以及給予測試製劑之後2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24小時時獲取血液樣品。考慮到由低於200mg/dL的血液葡萄糖水平指示的合適的控制，所述製劑提供約7.5小時(1∶3胰島素∶B28-Nε-辛醯基-Lys(B28)，Pro(B29)-人胰島素)、約9小時(NPH)、約15.5小時(1∶3胰島素∶B29-Nε-辛醯基-人胰島素)、約16小時(1∶3胰島素∶B29-Nε-壬醯基-人胰島素)和約22.5小時(PZI)的控制。在以上說明書中已經描述了本發明的原理、優選實施方案和操作模式。然而，在此計劃保護的本發明不應被解釋為限於所公開的具體形式，因為這些形式被認為是說明性的，而不是限制性的。本領域技術人員可以在不違背本發明精神的情況下，進行改變和變化。權利要求1．不溶性組合物，包含a)選自以下的蛋白胰島素、胰島素類似物和胰島素原；b)選自以下的衍生化蛋白衍生化胰島素、衍生化胰島素類似物和衍生化胰島素原；c)絡合化合物；d)六聚物穩定化合物；和e)二價陽離子。2．權利要求1的組合物，所述組合物為無定形沉澱。3．權利要求1的組合物，所述組合物為微晶。4．權利要求3的組合物，其中所述微晶具有棒狀形態。5．權利要求3的組合物，其中所述微晶具有不規則形態。6．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白選自脂肪酸醯化胰島素、脂肪酸醯化胰島素類似物和脂肪酸醯化胰島素原。7．權利要求6的組合物，其中所述絡合化合物為魚精蛋白，所述六聚物穩定化合物為酚類防腐劑，而所述二價金屬陽離子為鋅。8．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白選自脂肪酸醯化胰島素和脂肪酸醯化胰島素類似物。9．權利要求8的組合物，其中所述絡合化合物為魚精蛋白，所述六聚物穩定化合物為酚類防腐劑，而所述二價金屬陽離子為鋅。10．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白選自醯化胰島素、醯化胰島素類似物和醯化胰島素原。11．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白選自醯化胰島素和醯化胰島素類似物。12．權利要求11的組合物，其中所述衍生化蛋白於其Lys-Nε氨基單醯化。13．權利要求12的組合物，其中所述絡合化合物為魚精蛋白，其存在量為每3.5mg總蛋白約0.15mg至約0.5mg。14．權利要求13的組合物，其中所述二價陽離子為鋅，其存在量為每摩爾總蛋白約0.3摩爾至約0.7摩爾。15．權利要求14的組合物，其中所述六聚物穩定化合物為酚類防腐劑，選自苯酚、間甲酚、鄰甲酚、對甲酚、氯甲酚、對羥基苯甲酸甲酯和它們的混合物，其存在的比例至少為3摩爾酚類防腐劑對6摩爾總蛋白。16．權利要求15的組合物，其中所述蛋白選自胰島素和胰島素類似物。17．權利要求16的組合物，其中所述蛋白為胰島素。18．權利要求17的組合物，其中所述衍生化蛋白為於LysB29-Nε氨基單醯化的胰島素。19．權利要求18的組合物，其中所述衍生化蛋白為用直鏈飽和脂肪酸醯化的胰島素。20．權利要求19的組合物，其中所述直鏈飽和脂肪酸選自正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。21．權利要求20的組合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之間的摩爾比為約1∶9至約9∶1。22．權利要求21的組合物，其中所述直鏈飽和脂肪酸選自正己酸、正辛酸和正癸酸。23．權利要求22的組合物，其中所述直鏈飽和脂肪酸選自正辛酸和正癸酸。24．權利要求23的組合物，其中所述直鏈飽和脂肪酸為正辛酸。25．權利要求24的組合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之間的摩爾比為約1∶3至約3∶1。26．權利要求22的組合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之間的摩爾比為約1∶9至約1∶1。27．權利要求16的組合物，其中所述蛋白為胰島素類似物。28．權利要求27的組合物，其中所述蛋白為LysB28，ProB29-人胰島素類似物。29．權利要求27的組合物，其中所述蛋白為AspB28-人胰島素類似物。30．權利要求1的組合物，其中所述蛋白為胰島素或胰島素類似物，而所述衍生化蛋白為選自醯化胰島素和醯化胰島素類似物的醯化蛋白。31．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白為用直鏈飽和脂肪酸於LysB29-Nε氨基單醯化的胰島素。32．權利要求31的組合物，其中所述直鏈飽和脂肪酸選自正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。33．權利要求32的組合物，其中所述衍生化蛋白選自B29-Nε-己醯基-人胰島素、B29-Nε-辛醯基-人胰島素和B29-Nε-癸醯基-人胰島素。34．權利要求31的組合物，其中所述直鏈飽和脂肪酸選自正十二碳酸、正十四碳酸和正十六碳酸。35．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白於Lys-Nε氨基二醯化並且也於一個N末端Nα氨基醯化，且其中所述脂肪酸選自正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。36．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白用支鏈飽和脂肪酸醯化。37．權利要求36的組合物，其中所述衍生化蛋白用最長支鏈中具有3-10個碳原子的支鏈飽和脂肪酸醯化。38．權利要求1的組合物，其中所述衍生化蛋白為於Lys-Nε氨基用直鏈飽和脂肪酸單醯化的胰島素類似物。39．權利要求38的組合物，其中所述脂肪酸選自正己酸、正庚酸、正辛酸、正壬酸和正癸酸。40．權利要求38的組合物，其中所述衍生化蛋白為於Nε氨基用選自以下的脂肪酸單醯化的胰島素類似物，脂肪酸為正十二烷酸、正十四烷酸、和正十六烷酸。41．權利要求38的組合物，其中所述衍生化蛋白選自脂肪酸醯化動物胰島素、脂肪酸醯化單體胰島素、脂肪酸醯化缺失類似物和脂肪酸醯化pI變化的胰島素類似物。42．權利要求41的組合物，其中所述衍生化蛋白為脂肪酸醯化des(B30)-人胰島素類似物、脂肪酸醯化LysB28，ProB29-人胰島素類似物或脂肪酸醯化AspB28-人胰島素類似物。43．權利要求42的組合物，其中所述衍生化蛋白為脂肪酸醯化des(B30)-人胰島素類似物。44．權利要求43的組合物，其中所述衍生化蛋白為B29-Nε-肉豆蔻醯基-des(B30)-人胰島素類似物。45．權利要求42的組合物，其中所述衍生化蛋白為脂肪酸醯化LysB28，ProB29-人胰島素類似物。46．權利要求45的組合物，其中所述衍生化蛋白為B28-Nε-肉豆蔻醯基-LysB28，ProB29-人胰島素類似物。47．權利要求42的組合物，其中所述衍生化蛋白為脂肪酸醯化的AspB28-人胰島素類似物。48．權利要求1的組合物，其中所述蛋白和所述衍生化蛋白之間的摩爾比為約1∶9至約9∶1。49．權利要求48的組合物，其中所述比率為約1∶3至約3∶1。50．權利要求48的組合物，其中所述比率為約1∶9至約1∶1。51．權利要求1的組合物，其中所述蛋白為胰島素。52．權利要求1的組合物，其中所述蛋白為胰島素類似物。53．權利要求52的組合物，其中所述蛋白為單體胰島素類似物。54．包括不溶相和溶液相的懸浮製劑，其中所述不溶相包含權利要求1的不溶性組合物，而溶液相包含水性溶劑。55．權利要求54的懸浮製劑，其中所述溶液相還包含濃度約0.5mg/ml溶液至約6mg/ml溶液的酚類防腐劑、藥學上可接受的緩衝劑和等滲劑。56．權利要求54的懸浮製劑，其中所述溶液相還包含胰島素、胰島素類似物、衍生化胰島素或衍生化胰島素類似物。57．權利要求56的懸浮製劑，其中所述溶液相包含胰島素。58．權利要求56的懸浮製劑，其中所述溶液相包含衍生化胰島素。59．權利要求56的懸浮製劑，其中所述溶液相包含胰島素類似物。60．權利要求56的懸浮製劑，其中所述胰島素類似物為單體胰島素類似物。61．權利要求56的懸浮製劑，其中所述胰島素類似物為LysB28，ProB29-人胰島素類似物。62．權利要求56的懸浮製劑，其中所述胰島素類似物為AspB28-人胰島素類似物。63．權利要求54的懸浮製劑，其中所述溶液相還包含選自胰島素和胰島素類似物的蛋白以及選自衍生化胰島素和衍生化胰島素類似物的衍生化蛋白。64．權利要求63的懸浮製劑，其中所述溶液相中的蛋白與所述不溶相中的蛋白相同，且其中所述溶液相中的衍生化蛋白與所述不溶相中的的衍生化蛋白相同。65．權利要求54的懸浮製劑，其中所述不溶相基本上由無定形沉澱組成。66．權利要求54的懸浮製劑，其中所述不溶相基本上由微晶組成。67．權利要求54的懸浮製劑，其中所述不溶相包含無定形沉澱和微晶的混合物。68．權利要求54的懸浮製劑，其中所述溶液相還包含鋅和魚精蛋白，其中所述懸浮製劑中鋅與總蛋白之比為每摩爾總蛋白約5至約7摩爾鋅原子，而所述懸浮製劑中魚精蛋白與總蛋白之比為每mg總蛋白約0.25mg至約0.5mg。69．治療糖尿病的方法，包括將權利要求1的組合物給予需要其的患者，其給予量足以調節所述患者的血液葡萄糖水平。70．治療高血糖的方法，包括將權利要求54的組合物給予需要其的患者，其給予量足以調節所述患者的血液葡萄糖水平。71．包含6個單體和鋅的雜化六聚物組合物，其中至少一個單體選自胰島素、胰島素類似物和胰島素原，而至少一個單體選自衍生化胰島素、衍生化胰島素類似物和衍生化胰島素原。72．包含鋅蛋白六聚物和鋅衍生化蛋白六聚物的混合六聚物組合物，其中所述鋅蛋白六聚物包含鋅和選自胰島素、胰島素類似物和胰島素原的一種蛋白，且其中所述鋅衍生化蛋白六聚物包含鋅和選自衍生化胰島素、衍生化胰島素類似物和衍生化胰島素原的一種衍生化蛋白。73．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，所述水性溶劑的pH允許形成六聚物，和b)加入絡合化合物。74．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，所述水性溶劑的pH不允許形成六聚物，和b)將pH調至約6.8至約7.8；和c)加入絡合化合物。75．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，所述水性溶劑的pH允許形成六聚物；b)單獨地將衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，所述水性溶劑的pH允許形成六聚物；c)將步驟a)和步驟b)的溶液充分混合在一起；和d)將絡合化合物加入到步驟c)產生的溶液中。76．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、六聚物穩定化合物、二價金屬陽離子和絡合化合物溶於水性溶劑中，其中在所得溶液的pH下不發生沉澱；b)單獨地將衍生化蛋白、六聚物穩定化合物、二價金屬陽離子和絡合化合物溶於水性溶劑中，其中在所得溶液的pH下不發生沉澱；c)將步驟a)和步驟b)的溶液充分混合在一起；和d)將步驟c)的溶液的pH調至發生沉澱的pH值。77．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物、二價金屬陽離子和絡合化合物溶於水性溶劑中，其中在所得溶液的pH下不發生沉澱；b)將步驟a)的溶液的pH調至發生沉澱的pH值。78．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，其中當加入絡合劑時在所得溶液的pH下不發生沉澱；b)加入絡合化合物；和c)將步驟b)的溶液的pH調至發生沉澱的pH值。79．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，其中當加入絡合化合物時在所得溶液的pH下不發生沉澱；b)單獨地將衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，其中當加入絡合化合物時在所得溶液的pH下不發生沉澱；c)將步驟a)和步驟b)的溶液充分混合在一起；d)將絡合化合物加入步驟c)的溶液中；和e)將步驟d)的溶液的pH調至發生沉澱的pH值。80．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，其中當加入絡合化合物時在所得溶液的pH下不發生沉澱；b)將步驟a)的溶液的pH調至加入絡合化合物時發生沉澱的pH值；和c)將絡合化合物加入步驟b)的溶液中。81．製備權利要求1的不溶性組合物的方法，包括a)將蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，其中當加入絡合化合物時在所得溶液的pH下不發生沉澱；b)單獨地將衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，其中當加入絡合化合物時在所得溶液的pH下不發生沉澱；c)將步驟a)和步驟b)的溶液充分混合在一起；d)將步驟c)的溶液的pH調至加入絡合化合物時發生沉澱的pH值；和e)將絡合化合物加入步驟d)的溶液中。82．製備雜化六聚物的方法，包括將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，所述水性溶劑的pH允許形成六聚物。83．製備雜化六聚物的方法，包括a)將蛋白、衍生化蛋白、六聚物穩定化合物和二價金屬陽離子溶於水性溶劑中，所述水性溶劑的pH不允許形成六聚物，和b)將pH調至約6.8至約7.8。全文摘要本發明涉及不溶性組合物,它含有一種選自胰島素、胰島素類似物和胰島素前體的蛋白;含有一種選自以下的衍生的蛋白:衍生的胰島素、衍生的胰島素類似物和衍生的胰島素前體;一種絡合物;一種六聚體穩定化合物;和一種二價金屬陽離子。所述不溶性組合物製劑適用於經胃腸外和非胃腸外傳遞治療高血糖和糖尿病。微晶型的所述不溶性沉澱物在藥學上類似於中性魚精蛋白Hagedorn(NPH)胰島素晶體型。令人驚奇的是,發現這類不溶性組合物的懸浮劑具有獨特而可控的溶解特性,與胰島素NPH製劑相比,該溶解特性賦予萄萄糖動力學的藥學優勢。文檔編號A61P3/10GK1284876SQ98813743公開日2001年2月21日申請日期1998年12月22日優先權日1997年12月23日發明者M·L·布拉德申請人:伊萊利利公司