裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771及其在製備DHA粉末和油脂中的應用的製作方法
2023-05-06 06:22:36
專利名稱：裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771及其在製備DHA粉末和油脂中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體地說，涉及一種新的裂殖壺菌(Schizochytrium)及其應用。
背景技術：
二十二碳六烯酸(cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，簡稱DHA)俗稱腦黃金，是大腦、視網膜的重要結構物質，還能夠調節中樞神經系統功能、預防和治療心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。長期以來，DHA的商業來源是魚油和微藻。魚油的產量和DHA含量都不穩定，提取物夾雜魚腥味。微藻培養需要光照和二氧化碳，生產工藝繁雜，成本高。隨著人口的增加，DHA需求量相應增加，需要尋找量大質優的DHA新來源。目前認為具有潛力的候選是海洋異養微生物(包括細菌和真核微生物)。細菌的不飽和脂肪酸含量比不上真核微生物，因為不飽和脂肪酸只存在於細菌的細胞膜，而真核微生物更以不飽和脂肪酸的甘油三酯作為能量儲存物質。
破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)是一類類似於微藻但缺乏葉綠體故而不行光合作用的專性海生真核微生物，嗜腐敗，廣泛存在於有機溶解物多和鹽度高的環境中。過去認為破囊壺菌科歸屬於真菌界(Fungi)、壺菌門(Chytridiomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、水黴目(Saprolegniales)，而分子生物學的研究結果認為它更應該屬於原生生物，現歸屬於管毛生物界(Stramenopila)、不等毛門(Heterokonta)、網粘菌綱(Labyrinthulomycetes)、破囊壺菌目(Thraustochytriales)(Dick M W.Straminipilois fungiSystematics of the peronosporomycetes，including accounts of the marinestraminipilous protistes，the plasmodiophorids，and similar organisms.DordrechtKluwer Academic Publishers，2001，269-287)。
破囊壺菌科不致病、不產毒，人類通過食物鏈中的貽貝和蛤直接攝食之，美國FDA將其列為公認安全級(GRAS，Generally Recognized as Safe)。破囊壺菌科中的破囊壺菌屬(Thraustochytrium)和裂殖壺菌屬(Schizochytrium)被認為是DHA最好的微生物來源(Ward 0P，et al.Process Biochemistry，2005，403628-3652)。自上個世紀九十年代FAO和WHO等機構推薦在嬰、幼兒食品配方中添加DHA以來，破囊壺菌科生產DHA受到更加廣泛的關注。T.roseumATCC28210在優化培養基中培養5天，DHA生產率為0.2克/(升·天)(Singh A，et al.J Ind Microb，1996，16370-373)。S.limacinum SR21在含有葡萄糖(9％)或甘油(12％)的培養基中培養5天，DHA生產率為0.8克/(升·天)(Yokochi T，et al.Appl Microbiol Biotechnol，1998，4972-76)。一株可能是S.mangrovei Raghu Kumar的破囊壺菌以葡萄糖為碳源，培養107小時，DHA生產率為0.5克/(升·天)(Bowles R D，et al.J Biotechnol，1999，70193-202)。當培養溫度為25℃，一株S.mangrovei在葡萄糖-酵母膏培養基中培養52小時，DHA生產率為1.27克/(升·天)(Fan K W，et al.J IndMicrobiol Biotechnol，2001，70199-202)。T.aureum HO在葡萄糖(3％)培養基中培養4天，DHA生產率為1.55克/(升·天)(黃惠琴等.微生物學報，2002，42498-501)。T.roseum MF2在葡萄糖(4％)培養基中培養4天，DHA生產率為0.31克/(升·天)(吳克剛等.湛江海洋大學學報，2002，22(4)24-32)。但是，目前破囊壺菌所達到的DHA生產率都不是很高，其產業化受到很大的限制。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771，從而提高DHA生產率，以利於發酵生產DHA的產業化。
本發明裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771從浙江省溫州市甌江口七都島灘涂葦地裡收集的腐葉上採用松樹花粉垂釣法分離得到，已於2006年6月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC No.1730。
其具體的篩選步驟如下1.初篩培養基(克/升)葡萄糖10，酵母膏1，蛋白腖1，瓊脂18，用海水(取自溫州海域)配製。另加鏈黴素和青黴素各250毫克/升和3毫克/升二氧化鍺；2.復篩培養基(克/升)葡萄糖30，酵母膏2，蛋白腖2，用海水(取自溫州海域)配製；3.初篩方法取溫州沿海灘涂紅樹林和葦地裡的腐葉，用含有鏈黴素和青黴素的無菌海水洗淨，接種在所述的初篩培養基平板上，加適量的無菌海水和無菌松樹花粉於平板上，培養數天。挑取松樹花粉，觀察在松樹花粉上粘附生長的培養物，將粘附培養物的松樹花粉再轉接到新的平板上進行培養，直到得到純培養物為止；4.復篩方法將純培養物接種到所述的復篩培養基中，在搖床上培養。離心分離得到培養物，乾燥至恆重，稱量細胞乾重；5.篩選指標索氏提取法檢測細胞乾重中的脂肪含量，氣相色譜法檢測脂肪中的DHA含量，以DHA生產率為指標，篩選得到高產DHA的菌株。
菌株特性
在掃描和透視電鏡下觀察所述的高產DHA的菌株的外部形態和超微結構，其特徵為營養菌體為橢圓球形，由不連續的細胞壁包裹著，單核。細胞壁由幾層緊壓在一起的緻密鱗片構成，在細胞壁不連續處可分辨鱗片，鱗片厚約2-3納米。形成放射狀的、根狀的外質網依附在底物上，外質網產生於外質網形成體，從細胞壁不連續處長出。行無性繁殖，由營養菌體轉化為遊動孢子囊，其內有許多遊動孢子。在遊動孢子生成過程中，細胞質分裂緊接著每次細胞核分裂進行，並且形成四倍體細胞。遊動孢子側生著不等長的雙鞭毛，前向鞭毛兩邊排列茸鞭茸毛，後向鞭毛較短。
存在由鱗片構成的細胞壁、外質網形成體和外質網是現行的鑑定破囊壺菌科的標準，這些特點無法在光學顯微鏡下分辨清楚(Moss S T.The Biology ofMarine Fungi.CambridgeCambridge University Press，1986)。破囊壺菌的遊動孢子形成機制有兩種，即階段性分裂(細胞核分裂完全完成後進行細胞質分裂)和連續性分裂(細胞質分裂緊接著每次細胞核分裂進行)。後者可以形成四倍體細胞。以連續性分裂形成遊動孢子，產生四倍體細胞，是裂殖壺菌的特徵(Alexopoulos C J，et al.Introductory Mycology(4th ed.).New YorkJohnWiley and Sons，1996，743-750)。
因此，所述的高產DHA的菌株鑑定為裂殖壺菌(Schizochytrium)，命名為WZU4771。一般而言，破囊壺菌屬的菌體較大，在生產中可能出現聚集和結團，而裂殖壺菌屬的生長速率更快(Barclay W R.US Patent，1997，5688500)。
所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771適宜於生長在海洋環境裡，當培養基的鹽度和pH值與海洋相似時，細胞生長和DHA積累情況良好。其適宜溫度也較一般微生物低，最佳溫度為20-25℃。能夠以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和澱粉為碳源進行細胞生長和DHA積累。有機氮源(蛋白腖、酵母膏和玉米漿等)比無機氮源(尿素、硫酸銨和硝酸鈉等)更適宜於細胞生長和DHA積累。
所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU47711通過優化培養基和培養條件，採用傳統的發酵方法，經過5天培養，發酵液中的細胞乾重達到42.5克/升、DHA含量達到14.1克/升、DHA生產率達到2.76克/(升·天)，比已見報導的菌株將近高出1倍。
發酵技術所述裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU47711的優化培養基是含有5％-12％的碳源和0.5％-1.8％的氮源，海水濃度為25％-100％，pH值為3.5-7.5；優化培養條件是以3％-10％的接種量接入所述的優化培養基，在25-35℃、100-400轉/分的條件下，採用傳統的發酵方法，培養4-8天。
發酵液以3000-8000轉/分離心10-30分鐘，得到菌體細胞。
採用傳統的發酵方法、在所述的優化培養基中、以所述的優化培養條件所獲得的所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771菌體細胞含有35％-76％的油脂和18％-32％的DHA(均以細胞乾重為基準)，最高的細胞乾重達到42.5克/升、DHA含量達到14.1克/升、DHA生產率達到2.76克/(升·天)，幾乎比已見報導的菌株高出1倍。氣相色譜顯示，該菌的長鏈多不飽和脂肪酸譜簡單，除DHA外，只含有少量的二十二碳五烯酸(cis-7，10，13，16，19-docosapentaenoic acid，簡稱DPA)，有利於DHA的分離和純化。
本發明所要解決的另一個技術問題是提供裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771在製備DHA粉末和DHA油脂中的應用。
DHA粉末的生產所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU47711菌體細胞採用傳統的食品乾燥技術，將菌體水分降低至不高於12％。加入抗氧化劑、抗結塊劑和填充劑，混勻，得到應用於食品或飼料的DHA粉末。
所述的DHA粉末為黃色或淺橙色的粗粉，其DHA含量不低於6％，過氧化值不高於6.0毫當量/千克，細菌總數不高於50000個/克，大腸菌群近似數不高於90個/100克，致病菌(指腸道致病菌和致病性球菌)不得檢出。
DHA油脂的生產所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU47711菌體細胞採用傳統的植物油脂生產技術，經過浸出、脫膠、脫酸、脫色、脫臭、脫蠟和過濾，加入抗氧化劑，混勻，得到應用於食品的DHA油脂。
所述的DHA油脂為黃色或淺橙色的澄清、透明的油狀液體，其DHA含量不低於20％，酸價不高於1.0毫克氫氧化鉀/克，過氧化值不高於6.0毫當量/千克，正己烷不高於50毫克/千克。
本發明的優點在於採用松樹花粉垂釣法，從浙江省溫州市甌江口七都島灘涂葦地裡收集的腐葉上，分離得到一株高產DHA的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771。該菌含有豐富的油脂和DHA。在優化的培養基中，以優化的培養條件，採用傳統的發酵方法，經過5天培養，發酵液中的細胞乾重達到42.5克/升、DHA含量達到14.1克/升、DHA生產率達到2.76克/(升·天)，比已見報導的菌株將近高出1倍。並且，氣相色譜顯示，該菌的長鏈多不飽和脂肪酸譜簡單，除DHA外，只含有少量的DPA，有利於DHA的分離和純化。採用傳統的食品乾燥技術和植物油脂生產技術，將裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771菌體細胞開發為應用於食品或者飼料的DHA粉末和油脂。
下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
實施例1取浙江省溫州市甌江口七都島灘涂葦地裡的腐葉，剪成直徑約為1.5釐米的小圓片或長度為1.5釐米的片段，用含有鏈黴素和青黴素各1克/升的無菌海水洗淨，接種在所述的初篩培養基平板上，加約5毫升無菌海水和少量無菌松樹花粉於平板上，在25℃下培養4-5天。挑取松樹花粉，觀察在松樹花粉上粘附生長的培養物，將粘附培養物的松樹花粉再轉接到新的平板上進行培養，直到得到純培養物為止。
將純培養物接種到裝有50毫升所述的復篩培養基的250毫升三角瓶中，在150轉/分的搖床上培養3天，培養溫度為25℃。培養物以3500轉/分離心10分鐘，水洗後再離心，在105℃乾燥3小時，稱量細胞乾重。
索氏提取法檢測細胞乾重中的脂肪含量，氣相色譜法檢測脂肪中的DHA含量，以DHA生產率為指標，篩選得到高產DHA的菌株。
根據在掃描和透視電鏡下觀察所述的高產DHA的菌株的外部形態和超微結構，鑑定為裂殖壺菌(Schizochytrium)，命名為WZU4771。
所述的初篩培養基含有(克/升)葡萄糖10，酵母膏1，蛋白腖1，瓊脂18，用海水(取自溫州海域)配製。另加鏈黴素和青黴素各250毫克/升和3毫克/升二氧化鍺。
所述的復篩培養基含有(克/升)葡萄糖30，酵母膏2，蛋白腖2，用海水(取自溫州海域)配製。
實施例2分別選取幾種不同的碳源，濃度均為10％，以0.8％的蛋白腖為氮源，海水濃度為50％，pH值為6。接種量為10％，培養溫度為25℃，搖床轉速為150轉/分，進行裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA發酵。培養5天，結果如表1所示，葡萄糖為最佳碳源。
表1碳源對DHA生產率的影響
實施例3分別選取幾種不同的氮源，濃度均為0.8％，以10％的葡萄糖為碳源，海水濃度為50％，pH值為6。接種量為10％，培養溫度為25℃，搖床轉速為150轉/分，進行裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA發酵。培養5天，結果如表2所示，蛋白腖為最佳氮源。
表2氮源對DHA生產率的影響
實施例4培養基含有10％的葡萄糖和0.8％的蛋白腖，分別用不同海水濃度的海水配製，pH值為6。接種量為10％，培養溫度為25℃，搖床轉速為150轉/分，進行裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA發酵。培養5天，結果如表3所示，50％-100％的海水濃度最適宜。
表3海水濃度對DHA生產率的影響
實施例5培養基含有10％的葡萄糖和0.8％的蛋白腖，海水濃度為50％，用鹽酸或氫氧化鈉調節其pH值。接種量為10％，培養溫度為25℃，搖床轉速為150轉/分，進行裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA發酵。培養5天，結果如表4所示，最佳pH值為6。
表4pH值對DHA生產率的影響
實施例6培養基含有10％的葡萄糖和0.8％的蛋白腖，海水濃度為50％，pH值為6。接種量為10％，搖床轉速為150轉/分，在不同的培養溫度下，進行裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA發酵。培養5天，結果如表5所示，最佳溫度為20-25℃。
表5溫度對DHA生產率的影響
實施例7裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU47711菌體細胞在105℃乾燥至水分不高於12％。加入抗氧化劑、抗結塊劑和填充劑，混勻，得到應用於食品或飼料的DHA粉末。
實施例8裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771菌體細胞在105℃乾燥至水分低於12％，用己烷浸出，浸出級數為4，前三級採用濃度漸稀的混合油，最後一級採用新鮮溶劑，總的溶劑比為1∶1。
混合油過濾除去固體懸浮粕末等雜質，在常壓下經過2次蒸發和1次汽提，分離去己烷，得到毛油。
毛油在強烈的攪拌下，加入濃度為90％的硫酸溶液(添加量為毛油量的1％)，再加入熱水(添加量為毛油量的4％)。靜置沉降，取出上層毛油，用熱水反覆洗滌至pH值呈中性。
毛油在強烈的攪拌下，加入濃度為8％的氫氧化鈉溶液(添加量根據毛油的酸值確定，超量0.01％)。加熱至90℃，靜置沉降，除去皂腳。
毛油用90℃的去離子水洗滌(洗滌水量為毛油量的50％)，然後真空乾燥，乾燥溫度為100℃-105℃，真空度為98.6千帕。
毛油用活性白土進行吸附脫色(活性白土添加量為毛油量的2.5％)，脫色溫度為90℃，脫色時間為20分鐘。過濾除去活性白土。
毛油用水蒸汽汽提脫臭，脫臭溫度為180℃，脫臭時間為2小時，蒸汽用量為毛油量的4％。
脫色毛油在慢速攪拌下，充分冷卻至25℃，結晶時間為48小時，過濾除去蠟質。
加入抗氧化劑，得到富含DHA的成品油脂。
權利要求
1.裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771 CGMCC No.1730。
2.權利要求1所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771在製備DHA粉末中的應用。
3.權利要求1所述的裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771在製備DHA油脂中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771及其在製備DHA粉末和DHA油脂中的應用，本發明裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU4771從浙江省溫州市甌江口七都島灘涂葦地裡收集的腐葉上採用松樹花粉垂釣法分離得到，已於2006年6月1日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1730，所述裂殖壺菌(Schizochytrium)WZU47711在優化的培養基中、以優化的培養條件培養5天，發酵液中細胞乾重達到42.5克/升，DHA達到14.1克/升，DHA生產率達到2.76克/(升·天)，比已見報導的DHA生產率將近高出1倍。
文檔編號C12P7/64GK1916156SQ200610028869
公開日2007年2月21日 申請日期2006年7月10日 優先權日2006年7月10日
發明者趙肖為, 周茂洪 申請人:溫州大學