一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合的製作方法

2023-05-06 05:29:11

一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合。本發明組合為使用烷化劑作為病毒滅活劑的水貂病毒性腸炎滅活疫苗兼作組合中犬瘟熱活疫苗的稀釋液；組合中兩種疫苗具有特定的配比關係。該疫苗組合相比兩種疫苗傳統的應用方法達到一針兩防(預防水貂病毒性腸炎和犬瘟熱)，降低了疫苗成本、減少了動物應激反應、提高了免疫效果、減輕了飼養者的勞動強度從而取得顯著的經濟效益。
【專利說明】一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗及犬瘟熱活疫苗組合。屬於獸用生物制 品領域。

【背景技術】
[0002] 水紹病毒性腸炎是由水紹腸炎病毒（Mink Enteritis Virus, MEV)引起的一種急 性、烈性和高度接觸性傳染病，主要以劇烈腹瀉為主要特徵，1949年由加拿大學者Sehofield 首次發現本病（Schofield F W. Virus enteritis in mink. Am Vet, 1949, 30:6512654·)。 1981年姜廷秀等（姜挺秀，樸厚坤，王喜龍等.疑似水貂病毒性腸炎初報.毛皮動物飼養， 1981，（2):224.)首先報導了我國發生水貂病毒性腸炎，此後該病逐漸蔓延全國，給我國養 貂業帶來巨大的經濟損失（高雲，宋純林，吳玉林等水貂病毒性腸炎（MEV)流行病學調查及 防治.特產科學實驗，1984,（4) 33234.)。
[0003] 犬癌熱是由犬癌熱病毒（Canine distemper virus, (DV)引起的犬科、融科和熊 科動物的一種高度接觸性傳染病，病死率30 %?80 %。犬瘟熱病毒為副粘病毒科麻疹病毒 屬，呈圓形或不整形。直徑100?300nm，含有直徑為15?17nm的螺旋狀核衣殼，外覆一 層雙輪膜，膜上長I. 3nm的纖突。發病率高，幾乎可以達到100%，且臨床症狀多樣，容易繼 發其他細菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高，素有"毀滅性傳染病"之稱，對養犬業、 毛皮動物養殖業造成巨大損失。自1809年Jeneer首次報導犬瘟熱，1905年Carre通過動 物接種分離的濾過性致病因子複製出病例以來，各國學者已經對犬瘟熱病毒的分離培養、 理化特性、流行病學以及免疫與防製作了大量的研究。近年來，其感染範圍不斷擴大，危害 也越來越大，甚至已經有人感染犬瘟熱病毒的病例。Mee等也從患Pagets疾病的病人組織 中檢測出犬瘟熱病毒核酸，這使得犬瘟熱有可能成為繼狂犬病之後犬傳播給人的第二種疫 病。在我國，隨著近幾年來軍犬、警犬、實驗用犬和寵物犬飼養量的大幅度增加，以及異地交 流的不斷增多，犬瘟熱在我國犬中的發病率和致死率也均有升高的趨勢，而且臨床症狀也 與以往的表現有所不同。
[0004] 水貂病毒性腸炎與犬瘟熱是毛皮動物養殖中發病率最高的兩種疾病，均需要免疫 預防，目前這兩種疾病均有單獨疫苗可以使用。但是由於毛皮動物養殖中，每次免疫均會對 動物造成較大的應激，因而尋找一種將兩種疫苗聯合使用的方法極為重要。由於傳統的水 貂病毒性腸炎滅活疫苗使用的是甲醛溶液滅活劑，如果與犬瘟熱活疫苗共同使用則會造成 犬瘟熱抗原的失效，無法實現聯合使用。
[0005] 燒化劑屬於細胞毒類藥物，又稱生物燒化劑（Bioalkylating Agengts)，在體內能 形成碳正離子或其他具有活潑的親電性基團的化合物，進而與細胞中的生物大分子中含有 豐富電子的基團發生共價結合，使其喪失活性或使DNA分子發生斷裂，導致細胞死亡。其中 二乙烯亞胺（BEI)可以破壞病毒核酸，不改變病毒蛋白質，而且不同病毒對BEI的抵抗力不 盡相同，同時BEI對核酸具有較高的誘變作用。本發明使用BEI溶液作為水貂病毒性腸炎 滅活疫苗生產過程中的滅活劑，使得水貂病毒性腸炎滅活疫苗滿足了作為犬瘟熱活疫苗稀 釋液進行使用的可能，並通過各種創造性試驗，實現了水貂病毒性腸炎滅活疫苗與犬瘟熱 活疫苗的聯合應用。


【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗 組合，將水紹病毒性腸炎滅活疫苗作為犬癌熱活疫苗稀釋液，達到降低疫苗成本、減少動物 應激、提高經濟效益的目的。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案在於：
[0008] 1. -種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，是由水貂病毒性腸炎滅活 疫苗和犬瘟熱活疫苗組成，其中水貂病毒性腸炎滅活疫苗兼作犬瘟熱活疫苗的稀釋劑。
[0009] 2. -種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合中水貂病毒性腸炎滅活疫 苗使用的滅活劑為烷化劑，優選滅活終濃度為〇. 05%?0. 3%的BEI溶液。
[0010] 3. -種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合中兩種疫苗具有每3毫升 水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋1頭份犬瘟熱活疫苗的配比關係，其中水貂病毒性腸炎滅 活疫苗滅活前病毒含量為每暈升I. ox i〇7_°tcid5(i以上，犬癌熱活疫苗每頭份病毒含量為 104_ 5TCID5tl 以上。
[0011] 4. 一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合中水貂病毒性腸炎滅活疫 苗製備步驟包括：
[0012] (1)將F81細胞系或者CRFK細胞系進行傳代和培養；
[0013] (2)將水貂病毒性腸炎病毒接種到長滿80%的F81或者CRFK單層細胞的介質上， 用維持液培養，製備生產用種毒；
[0014] (3)通過微載體平衡、細胞接種及消化轉移、細胞罐放大轉移使細胞培養擴大至 1000L的細胞罐。當細胞密度達到I. 5X 106cells/ml時，接種水貂腸炎病毒MEV-RCl株，得 到水貂病毒性腸炎病毒抗原液；
[0015] (4)將水貂病毒性腸炎病毒抗原液分別加入BEI溶液滅活，混合均勻，加入水溶性 佐劑，優選滅菌的氫氧化鋁膠配苗，即得。
[0016] 5.組合中水貂病毒性腸炎滅活疫苗製備中使用水貂病毒性腸炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)為MEV-RCl株該毒株已於2012年04月12日送交北京市朝陽區北 辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心保藏，編號為：CGMCC No. 4331。

【具體實施方式】
[0017] 一、水貂病毒性腸炎滅活疫苗
[0018] 1.水貂病毒性腸炎滅活疫苗的生產製備
[0019] (1)生產用毒種製備
[0020] 取生長良好的F81細胞或者CRFK細胞按常規方法傳代，待細胞長成80%單層後， 棄去生長液，換以含0. 5%?1% MEV-RCl株毒種的維持液（含2%在56°C下滅活30分鐘 的新生牛血清的MEM) (MEM購自美國Gibco公司，新生牛血清購自濟南勁牛生物科技有限公 司），置37°C繼續培養，待80%左右的細胞出現典型拉網式病變時收穫，凍融1次，定量分 裝，冷凍保存，註明收穫日期、毒種代次等。
[0021] (2)制苗用材料的選擇
[0022] 選擇生長良好、符合現行《中國獸藥典》生產、檢驗用細胞標準的或者CRFK細胞做 為制苗用材料，細胞代次為F6?F35代。
[0023] (3)制苗用毒液的繁殖
[0024] 1)生物反應器清洗滅菌及微載體平衡
[0025] 將生物反應器清洗乾淨，121°C滅菌30分鐘。滅菌結束後，將滅菌好的微載體打入 細胞培養罐中，將平衡培養基MEM打入罐中至最小培養體積，平衡20?24小時。平衡載體 期間完成溶氧電極100%點的校正。
[0026] 2)細胞接種及消化轉移
[0027] 選擇生長旺盛的轉瓶細胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液消化後，用含8%新生牛血 清的MEM和微載體（Cytodex I型微載體，購自GE公司）懸浮製成細胞懸液，接種30L細 胞培養罐，接種密度5. 0?6. OX 105cells/ml，連續培養2?3天，細胞罐培養過程中當 葡萄糖含量低於500mg/L，用含5 %新生牛血清的MEM培養基批次換液，當細胞密度達到 2. OX 106cells/ml以上後進行消化轉移，即培養規模的放大。轉移前，將在細胞培養罐內 連續培養2?3日的或者CRFK細胞取樣觀察並用0. 1 %結晶紫染色計數，細胞密度達到 2X106cells/ml時，按3?4倍放大到90L細胞罐。
[0028] 3)細胞罐放大轉移
[0029] 按照上述步驟逐級放大，將90L細胞罐依次放大轉移至350L、1000L細胞罐。
[0030] 4)接毒及收穫
[0031] 1000L細胞罐培養2?3日，細胞密度達到1.5X106cells/ml時，接種水貂腸炎 病毒MEV-RCl株，接毒時採用含1 %新生牛血清的DMEM培養基，溫度37°C，接毒量為MOI = 〇. 1。接毒後定時取樣觀察細胞，待微載體表面80%細胞病變突起且有少量脫落時，連續高 速攪拌10?15分鐘，通過消化器濾除微載體收穫病毒液，取樣進行病毒含量測定後，收穫 的病毒液標明名稱、收穫日期、批號，存放_15°C低溫冷庫，待檢備用。
[0032] (4)病毒液滅活
[0033] 向病毒液中加入2%的BEI溶液，使其終濃度為0. 2%，37°C滅活48小時，期間每 隔4?8小時混勻1次；滅活完全後，向病毒液中添加50%的硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度 為0. 4%，加入後攪拌1小時。
[0034] (5)半成品檢驗
[0035] 1)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。
[0036] 2)病毒含量每暈升病毒含量應不低於107_°TCID5(i。
[0037] 3)滅活檢驗將滅活病毒液和MEM按1 : 5的比例混合後接種已長成80 %單層的 或者CRFK單層細胞4瓶（每瓶細胞瓶底面積為5cmX 7cm)，每瓶接種lml，置37°C下吸附 30分鐘後，換維持液（含2%在56°C下滅活30分鐘的新生牛血清的MEM)，繼續培養觀察4 日，應無細胞病變；再盲傳1代，仍應無細胞病變。取培養液作血凝試驗，應為陰性。
[0038] (6)配苗將滅活病毒液和滅菌的氫氧化鋁膠（附註3)按9 : 1的比例進行配苗， 使疫苗中氫氧化鋁膠含量以氧化鋁表示不超過3. 9mg/ml，充分攪拌。
[0039] (7)分裝定量分裝。分裝時，應隨時攪拌使其混合均勻。
[0040] 2.成品檢驗
[0041] (1)性狀靜置後，上層為粉紅色液體，下層為淡粉紅色沉澱，振搖後呈均勻混懸液。
[0042] (2)無菌檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應無菌生長。
[0043] (3)裝量檢查按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應符合規定。
[0044] (4)安全檢驗用2?10月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價不高於1:4)5隻，各 皮下注射疫苗3ml，連續觀察10日，應全部健活。
[0045] (5)效力檢驗
[0046] 取2?10月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價不高於1:4)5隻，各皮下注射疫苗 lml，同時設不接種對照水貂5隻。免疫後14日，對所有水貂分別通過口服途徑攻擊水貂腸 炎病毒MEV-RCl株病毒液15ml (病毒含量為15 X 107_ tlTCID5tl)，觀察10日。對照水貂應全部 發病（附註2)，免疫水貂應全部健活。
[0047] (6)汞類防腐劑殘留量測定分別按現行《中國獸藥典》附錄進行測定，應符合獸用 生物製品通則的規定。
[0048] 二、犬瘟熱活疫苗
[0049] 1、犬瘟熱活疫苗的生產製備
[0050] (1)生產用種毒的製備
[0051] 犬瘟熱病毒株⑶V-Il株接種轉瓶上的Vero細胞單層，接毒量為維持液量的2%， 當細胞病變達80%時即可收穫，再傳1代，製備生產用種毒。
[0052] (2)病毒液的繁殖
[0053] 用生產用種毒,接種到轉瓶上的Vero細胞單層,接毒量為細胞維持液的2%。然後 將轉瓶細胞置37°C培養，轉速為8?10r/h。
[0054] 接種後，每天觀察細胞病變情況，當細胞病變達80%左右時即可收穫，凍融1次， 置一 15°C凍結保存，此為半成品。
[0055] (3)凍幹
[0056] 經過半成品合格檢驗合格後，用常規凍幹保護劑（《中國獸藥典》）與病毒液的體 積比按照1:1混合，分裝成2ml/瓶，按照設計好的凍幹曲線進行凍幹，S卩：-65°C，維持2小 時使疫苗迅速凍結，然後抽真空，當真空度達13. 3Pa時，開始升溫乾燥，升華階段產品溫度 為一 20?一 KTC，擱板溫度為8°C，升華時間為10個小時；解析溫度為30°C，2個小時。
[0057] 2、犬癌熱活疫苗的成品檢驗
[0058] (1)無菌檢驗應無菌生長。按《中國獸藥典》中的規定進行檢驗。
[0059] (2)支原體檢驗按《中國獸藥典》中的規定進行檢驗，應無支原體生長。
[0060] (3)鑑別檢驗將疫苗作KT2稀釋，與等量KT1稀釋的犬瘟熱陽性血清混合，經37°C 中和30分鐘，接種Vero細胞4瓶，同時設病毒對照組2瓶，置37°C培養，連續觀察CPE 96? 120小時。
[0061] (4)外源病毒檢驗按《中國獸藥典》中的規定進行檢驗，應無外源病毒。
[0062] (5)安全檢驗將每頭份疫苗用Iml生理鹽水溶化後，肌肉接種2?3月齡易感犬 (SN抗體效價彡1:4)5隻，10頭份/只，觀察21日。
[0063] (6)效力檢驗用含2%新生牛血清的MEM將疫苗溶化，使每Iml疫苗含1頭份，然 後作10倍遞進稀釋，取1〇_2、1〇_ 3、1〇_4、1〇_54個稀釋度，分別接種已長成單層的Vero細胞96 孔微量細胞培養板，每個稀釋度接種8個孔，每孔100 μ 1，同時設不接毒對照，置37°C、5% 二氧化碳培養箱中培養，觀察96?120小時，記錄細胞病變（CPE)孔數，按Reed-Muench法 計算 TCID5tl，應達到 104·5TCID5qij
[0064] (7)剩餘水分測定每批凍幹製品任抽4個樣品，各樣品剩餘水分均不應超過4%。 如果有超過時，可重檢1次，重檢後如有1個樣品超過規定，該批製品應判為不合格（《中國 獸藥典》）。
[0065] (8)真空度測定包裝前測定真空度，無真空的製品，應予剔除報廢，不得重抽空出 售（《中國獸藥典》）。
[0066] 三、組合方法
[0067] 按照3毫升水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋1頭份犬瘟熱活疫苗（本發明人自行生 產，生產批准文號：獸藥生字（2010) 150256017)的比例，將水貂病毒性腸炎滅活疫苗做為 犬瘟熱活疫苗的稀釋液，配比後進行使用。
[0068] 其中，水貂病毒性腸炎滅活疫苗滅活前病毒含量為每毫升I. OX 107_ciTCID5ciAil以 上；犬瘟熱活疫苗病毒含量為IO4 5TCID5tl/頭份以上。
[0069] 本發明涉及的微生物菌種
[0070] 本發明涉及到的水紹病毒性腸炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)MEV_RCl株已 於2012年04月12日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為：CGMCC No. 4331 ;
[0071] 本發明涉及到的犬癌熱病毒（Canine distemper virus,Q)V)OW-Il株已於2009 年07月15日送交北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為：CGMCC No. 3201。
[0072] 本發明的積極意義
[0073] 本發明提供一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗及犬瘟熱活疫苗組合。本發明利用BEI 滅活後可以用硫代硫酸鈉中和的特點，使用BEI滅活劑滅活水貂病毒性腸炎滅活疫苗，並 按一定比例稀釋犬癌熱活疫苗進行組合，達到了降低疫苗成本、減少動物應激、提高經濟效 益、減輕了飼養者的勞動強度的目的。該發明有以下優點 ：
[0074] 1.犬瘟熱活疫苗的目前應用中，往往是凍乾產品，需要單獨配製適用的疫苗稀釋 液；水貂病毒性腸炎滅活疫苗的目前應用中，往往是甲醛滅活的液體疫苗，也只能是單獨使 用。
[0075] 而本發明中，兩種疫苗產品的應用採用BEI滅活的水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋 犬瘟熱活疫苗的方法，直接省去了犬瘟熱活疫苗的疫苗稀釋液，降低了疫苗成本。
[0076] 2.與傳統生產工藝相比，水貂病毒性腸炎滅活疫苗滅活劑由甲醛溶液改為BEI溶 液，BEI作用於病毒核酸，不破壞病毒的抗原蛋白，不影響病毒免疫原性。由於米用BEI對 病毒也進行滅活後，可以使用硫代硫酸鈉將BEI滅活劑中和，因此滅活病毒後無殘留，相比 甲醛溶液滅活，對動物應激小、安全性好。
[0077] 3.本發明利用了使用BEI滅活劑滅活病毒後無殘留的特點，使得滅活疫苗與活疫 苗的組合後共同使用成為了可能，且疫苗組合免疫效果優於原兩種單苗分別免疫的效果。
[0078] 4.本發明兩種疫苗產品的組合，能夠將以往兩種疫苗產品單獨應用時飼養者需要 一次捕抓動物注射兩針降低為注射1針，減輕了疫苗免疫的勞動強度。
[0079] 實施例
[0080] 以下實施例進一步說明本發明。
[0081] 實施例1
[0082] --生產用毒種製備
[0083] 1、毒種繁殖取生長良好的F81細胞或者CRFK細胞按常規方法傳代，待細胞長成 80%單層後，棄去生長液，換以含1 %毒種的維持液（含2%在56°C下滅活30分鐘的新生牛 血清的MEM)，置37°C繼續培養，待80%左右的細胞出現典型拉網式病變時收穫，凍融1次， 定量分裝，冷凍保存，註明收穫日期、毒種代次等。
[0084] 2、毒種鑑定符合以上標準的毒種作為生產用毒種。
[0085] 3、毒種繼代不超過3代。
[0086] 4、毒種保存-15°C以下保存，有效期為24個月。
[0087] 實施例2
[0088] --水貂病毒性腸炎滅活疫苗的製造
[0089] 1、制苗用材料的選擇
[0090] 選擇生長良好、符合現行《中國獸藥典》生產、檢驗用細胞標準的F81細胞或者 CRFK細胞做為制苗用材料，細胞代次為F6?F35代。
[0091] 2、制苗用毒液的繁殖
[0092] (1)生物反應器清洗滅菌及微載體平衡將生物反應器清洗乾淨，121°C滅菌30分 鍾。滅菌結束後，將滅菌好的微載體打入細胞培養罐中，將平衡培養基MEM打入罐中至最小 培養體積，平衡24小時。平衡載體期間完成溶氧電極100%點的校正。
[0093] (2)細胞接種及消化轉移選擇生長旺盛的轉瓶細胞，用EDTA-胰蛋白酶分散液 消化後，用含8%新生牛血清的MEM懸浮製成細胞懸液，接種30L細胞培養罐，接種密度 5. OX 105cells/ml，連續培養3天，細胞罐培養過程中當葡萄糖含量低於500mg/L，用含5% 新生牛血清的MEM培養基批次換液，當細胞密度達到2. OX 106cells/ml以上後進行消化轉 移，即培養規模的放大。轉移前，將在細胞培養罐內連續培養，或者CRFK細胞取樣觀察並用 〇. 1%結晶紫染色計數，細胞密度達到2X 106cells/ml時，按3倍放大到90L細胞罐。
[0094] (3)細胞罐放大轉移按照上述步驟逐級放大，將90L細胞罐依次放大轉移至350L、 1000L細胞罐。
[0095] (4)接毒及收穫1000L細胞罐培養至細胞密度達到I. 5X 106cells/ml時，接種水 貂腸炎病毒MEV-RCl株，接毒時採用含1 %新生牛血清的DMEM培養基，溫度37°C，接毒量為 MOI = 0. 1。接毒後定時取樣觀察細胞，待微載體表面80%細胞病變突起且有少量脫落時， 連續高速攪拌15分鐘，通過消化器濾除微載體收穫病毒液，取樣進行病毒含量測定後，收 獲的病毒液標明名稱、收穫日期、批號，存放_15°C低溫冷庫，待檢備用。
[0096] 3、滅活向病毒液中加入2%的BEI溶液，使其終濃度為0. 2%，37°C滅活48小時， 期間每隔4?8小時混勻1次；滅活完全後，向病毒液中添加50%的硫代硫酸鈉溶液，使其 終濃度為〇. 4%，加入後攪拌1小時。
[0097] 4、配苗將滅活病毒液和滅菌的氫氧化鋁膠（附註3)按9 : 1(V/V)比例進行配苗， 使疫苗中氫氧化鋁膠含量以氧化鋁表示不超過3. 9mg/ml，充分攪拌。
[0098] 5、分裝、貼籤、入庫保存。
[0099] 實施例3
[0100] -水貂病毒性腸炎滅活疫苗的成品檢驗
[0101] (1)性狀靜置後，上層為粉紅色液體，下層為淡粉紅色沉澱，振搖後呈均勻混懸液。
[0102] (2)無菌檢驗無菌生長。
[0103] (3)裝量檢查按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，均符合規定。
[0104] (4)安全檢驗用5月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價不高於1 : 4)5隻，各皮下 注射疫苗3ml，連續觀察10日，均未出現異常，全部健活。
[0105] (5)效力檢驗
[0106] 取5月齡健康易感水貂（MEV HI抗體效價不高於1 : 4) 5隻，各皮下注射疫苗lml， 同時設不接種對照水貂5隻。免疫後14日，對所有水貂分別通過口服途徑攻擊水貂腸炎病 毒MEV-RCl株病毒液15ml (病毒含量為15 X 107_ tlTCID5tl)，觀察10日。對照水貂全部發病， 免疫水貂全部健活。
[0107] (6)汞類防腐劑殘留量測定分別按現行《中國獸藥典》附錄進行測定，測定結果為： 未檢出。
[0108] 實施例4
[0109] --犬瘟熱活疫苗的製備
[0110] 1、生產用種毒的製備
[0111] 犬瘟熱病毒株⑶V-Il株接種轉瓶上的Vero細胞單層，接毒量為維持液量的2%， 當細胞病變達80%時即可收穫，再傳1代，製備生產用種毒。
[0112] 2、病毒液的繁殖
[0113] 用生產用種毒,接種到轉瓶上的Vero細胞單層,接毒量為細胞維持液的2%。然後 將轉瓶細胞置37°C培養，轉速為10r/h。
[0114] 接種後，每天觀察細胞病變情況，當細胞病變達80%左右時即可收穫，凍融1次， 置-15°C凍結保存，此為半成品。
[0115] 3、凍幹
[0116] 經過半成品合格檢驗合格後，用常規凍幹保護劑（《中國獸藥典》）與病毒液的體 積比按照1:1混合，分裝成2ml/瓶，按照設計好的凍幹曲線進行凍幹，S卩：-65°C，維持2小 時使疫苗迅速凍結，然後抽真空，當真空度達13. 3Pa時，開始升溫乾燥，升華階段產品溫度 為-20?-KTC，擱板溫度為8°C，升華時間為10個小時；解析溫度為30°C，2個小時。
[0117] 實施例5
[0118] --犬瘟熱活疫苗的成品檢驗
[0119] (1)無菌檢驗無菌生長。
[0120] (2)支原體檢驗無支原體生長。
[0121] (3)鑑別檢驗將疫苗作KT2稀釋，與等量KT1稀釋的犬瘟熱陽性血清混合，經37°C 中和30分鐘，接種Vero細胞4瓶，同時設病毒對照組2瓶，置37°C培養，連續觀察CPE 96? 120小時。中和組和細胞對照組均未出現CPE，不中和對照組全部出現CPE。
[0122] (4)外源病毒檢驗按《中國獸藥典》中的規定進行檢驗，均無外源病毒。
[0123] (5)安全檢驗將每頭份疫苗用Iml生理鹽水溶化後，肌肉接種3月齡易感犬（SN抗 體效價彡1:4) 5隻，10頭份/只，觀察21日，5隻接種易感犬均未出現異常反應。
[0124] (6)效力檢驗每頭份疫苗病毒含量為105 57TCID50。
[0125] (7)剩餘水分測定4個樣品結果為：1. 84%、1. 81%、1. 73%、1. 80%。
[0126] 實施例6
[0127] --水貂病毒性腸炎滅活疫苗加倍劑量安全性比較試驗
[0128] 取2月齡水貂30隻，隨機分為3組。第1組後腿部肌肉注射一針本發明疫苗組合 3ml (10頭份犬瘟熱活疫苗用3ml水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋），第2組左右後腿內側肌 肉分別免疫犬瘟熱活疫苗10頭份和水貂病毒性腸炎滅活疫苗3ml作為疫苗對照，第3組不 免疫作為空白對照。分別隔離飼養，觀察10日，觀察水貂精神、飲食變化。並在14日時將 所有水貂剖殺作病理學檢查。
[0129] 結果一針兩防免疫組接種水貂精神、飲食均正常；體溫無明顯變化，均在正常 38. 5°C?39. 4°C範圍內，與對照水貂各項指標無明顯差別；接種部位沒有出現腫脹、壞死， 無全身不良反應；免疫後14日將所有水貂剖殺，免疫組接種部位均未出現腫塊和潰瘍等不 良反應。
[0130] 實施例7
[0131] --疫苗組合與各自單苗對水貂免疫效力比較試驗
[0132] 取2月齡水貂30隻，隨機分為3組。第1組（疫苗組合免疫組）腿部肌肉注射一 針兩防疫苗Iml (1頭份犬瘟熱活疫苗用3ml水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋），第2組（免疫 對照組）兩側腿部肌肉分別免疫2種疫苗（福馬林滅活的水貂腸炎滅活疫苗Iml、犬瘟熱 活疫苗0. 33頭份/lml)，第3組不免疫作為空白對照。免疫後21天，採血，分別測定犬瘟 熱、水貂病毒性腸炎病毒抗體效價。
[0133] 結果顯示一針兩防免疫方式抗MEV HI值與⑶VSN抗體值均達到保護要求，且均高 於兩種疫苗分別注射免疫方式。具體結果見表1。
[0134] 表1疫苗組合與各自單苗對水貂免疫效力比較試驗結果
[0135]

【權利要求】
1. 一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特徵在於該組合是由水貂病 毒性腸炎滅活疫苗和犬瘟熱活疫苗組成，其中水貂病毒性腸炎滅活疫苗兼作犬瘟熱活疫苗 的稀釋劑。
2. 權利要求1所述的一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特徵在於 組合中水貂病毒性腸炎滅活疫苗使用的滅活劑為烷化劑。
3. 權利要求1所述的一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特徵在於 組合中兩種疫苗具有每3毫升水貂病毒性腸炎滅活疫苗稀釋1頭份犬瘟熱活疫苗的配比關 系，其中水貂病毒性腸炎滅活疫苗滅活前病毒含量為每毫升l.〇Xl〇 7_°TCID5(l以上、犬瘟熱 活疫苗每頭份病毒含量為l〇4 5TCID5(l以上。
4. 如權利要求1、2所述的一種水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特徵 在於該組合中水貂病毒性腸炎滅活疫苗製備步驟包括： (1) 將F81細胞系或者CRFK細胞進行傳代和培養； (2) 將水貂病毒性腸炎病毒接種到長滿70%?90% F81或者CRFK單層細胞的介質上， 用維持液培養，製備生產用種毒； (3) 通過微載體平衡、細胞接種及消化轉移、細胞罐放大轉移使細胞培養擴大培養，當 細胞密度達到1.5X106cells/ml以上時，接種水貂腸炎病毒，得到水貂病毒性腸炎病毒抗 原液； (4) 將水貂病毒性腸炎病毒抗原液滅活後加入水溶性佐劑即得。
5. 權利要求2所述的水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特徵在於所述 烷化劑為滅活終濃度為0. 05 %?0. 3 %的BEI溶液。
6. 權利要求4所述的水貂病毒性腸炎滅活疫苗-犬瘟熱活疫苗組合，其特徵在於是其 中的水貂病毒性腸炎病毒為水貂病毒性腸炎病毒（Mink Enteritis Virus，MEV)MEV-RC1 株，保藏號為CGMCC No. 4331。
【文檔編號】A61K39/175GK104258386SQ201410462321
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】禚寶山, 宋曉飛, 李營, 秦緒偉, 田真, 王景偉, 王蕾, 鮑海忠 申請人:齊魯動物保健品有限公司