一種黃瓜子葉注射接種快速鑑定黃瓜抗細菌角斑病的方法與流程
2023-05-06 08:55:21 1
本發明涉及作物抗病育種技術領域，尤其涉及一種黃瓜子葉注射接種快速鑑定黃瓜抗細菌角斑病的方法。
技術背景
黃瓜（cucumissativusl.,2n=14）是世界範圍內種植的一種重要的蔬菜作物，在我國蔬菜供應和國民經濟中佔有極其重要的地位，但是近年來隨著黃瓜保護地栽培面積的不斷擴大，黃瓜病害越來越成為制約黃瓜生產的一個重要因素，嚴重影響黃瓜的產量和品質。據報導2014-2016年，中國河北、山東、河南和遼寧省等地黃瓜細菌角斑病（angularleafspot,als）危害十分嚴重，嚴重減產的達到30-50%（mengetal.,2017）。
黃瓜角斑病是由丁香假單胞桿菌黃瓜細菌角斑病致病變種(pseudomonassyringaepv.lachrymans，psl)引起的葉部病害，病菌在種子和病殘體倖存，初侵染來源為帶菌的種子、昆蟲、雨水、勞動者、病殘體及汙染病殘體的土壤等，帶菌土壤通過大風或者灌溉迅速遠距離傳播。病菌通過種子萌發時定植到子葉上增殖發病，子葉侵染首先在子葉邊緣開始黃化，葉片侵染髮病時首先在葉背面出現水浸狀的褪綠斑，病斑的外圍擴大呈褪綠暈環，因受葉脈限制而呈多角形，逐漸成黃褐色、褐色、灰白色、白色，易破裂形成穿孔，有時可危害瓜條，腐爛有臭味（youngetal.1996）。
黃瓜角斑病菌psl與寄主植物互作的報導甚少，ps小種存在分化現象，renata等收集了侵染瓜類作物的22個psl小種，利用感病黃瓜lineb鑑定了不同小種的致病性和毒力，並通過分子進化方法對小種進行了劃分。根據psl小種的致病性及其分子進化分析結果，將psl菌株劃分為兩種類型，強致病力類型和弱致病力類型(renataetal.,2015）。當病菌侵染寄主植物後，寄主植物一般產生兩種反應，其一是過敏性壞死反應，當病菌侵染寄主細胞後，病菌在寄主植物中繁殖很少，一般在12-24h內達到高峰，然後迅速衰減；另一種反應為非過敏性壞死反應，細菌感染寄主後，在寄主的接種部位不斷增殖，一般3至4d內達到高峰產生壞死斑。黃瓜對psl抗病反應為延遲了病菌在寄主細胞的增殖，表現為耐病，接種psl後侵染位點可檢測到高濃度的游離胺基酸，psl的生理小種的致病性與其產生的蛋白裂解酶成正相關（keenetal.,1967aandb)。而寄主在psl侵染位點誘導產生病程相關蛋白（pathogenesis-relatedproteins,prps）來抑制psl分泌的蛋白酶功能，從而減緩病害的發展（kryczynskietal.,2002)。這種互作方式符合親和互作的特徵，這為我們指導開展黃瓜抗als抗病性鑑定奠定了理論基礎。
利用化學農藥防治als不僅汙染環境，而且容易產生抗藥性（lamichhaneetal.,2015）。利用黃瓜種質資源進行抗病品種的選育是一項最經濟和有效的措施，而快速、可靠、準確的接種鑑定是實現這一目標的關鍵。目前黃瓜als抗病鑑定主要是通過噴霧接種病菌的方法，雖然操作簡單，但是病害發病不穩定，受環境影響大，每次噴霧接種後的材料的發病率及病情指數不穩定，給抗病鑑定帶來困難。目前缺乏一種快速準確評價不同黃瓜種質資源對als抗病鑑定表現型的方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種子葉注射接種快速鑑定黃瓜抗細菌角斑病的方法，該方法首先在黃瓜幼苗兩片子葉完全展開時，以一定濃度的強致病力的黃瓜細菌角斑病psl病菌液輕輕注射黃瓜幼苗的子葉背面，然後保溫保溼7天後根據子葉的表現的症狀來判定黃瓜對細菌角斑病的抗病性。
為了實現上述目的，本發明採用了如下技術方案：一種黃瓜子葉接種快速鑑定黃瓜抗細菌角斑病的方法，該方法使用黃瓜細菌角斑病菌psl強致病力菌株進行子葉注射接種，從而根據接種子葉的症狀快速鑑定黃瓜種質資源對細菌角斑病的抗病性，該方法包括以下步驟：
（1）鑑定黃瓜細菌角斑病病菌psl強致病力菌株用於黃瓜幼苗子葉接種，且接種濃度在1×106cfu/ml至5×106cfu/ml之間；
（2）黃瓜幼苗子葉為受體注射接種：將黃瓜種子消毒後播種到營養土中，在人工氣候室內培養，培養條件為24℃光照培養16小時、20℃黑暗培養8小時、溼度100%，當子葉完全展開時，將psl菌液輕輕注射入黃瓜幼苗子葉背面的細胞間隙中。接種完後扣透明的塑料蓋密封，在人工氣候室內繼續培養7天，然後統計接種後的子葉的發病症狀，根據子葉的症狀來判斷黃瓜對細菌角斑病的抗病性。
（3）黃瓜對細菌角斑病病菌的抗病性鑑定：當psl菌液接種黃瓜幼苗子葉7天後，在抗病材料上症狀表現為無明顯褪綠暈環、子葉濃綠色，而感病材料表現為有明顯的褪綠暈環、子葉黃化。通過上述方法，即可快速鑑定出黃瓜抗細菌角斑病的材料。
進一步地，步驟（1）中分離黃瓜細菌角斑病病菌強致病力菌株的方法為：①田間採集具有黃瓜細菌角斑病典型症狀的病葉，放入離心管中，室內無菌條件下用10%次氯酸鈉消毒3min，用無菌的蒸餾水衝洗三次。②在離心管裡用無菌的玻璃棒將病葉搗碎，加無菌水0.5ml，取無菌的接種針沾取搗碎的病菌汁液，在kb培養基上劃線，24℃暗培養2天直至菌落長出。③選取單菌落kb劃板培養，然後培養的劃線菌用無菌水在平板上衝洗，收集黃瓜細菌角斑病菌液後，用無菌水調節菌液濃度在1×106cfu/ml。④用注射器輕輕在黃瓜子葉葉背面注射接種，直至菌液浸透整個子葉葉背面。⑤以24℃光照培養16小時、20℃黑暗培養8小時、溼度100%的條件培養3至7天。⑥根據接種後子葉褪綠黃化的程度來判斷黃瓜細菌角斑病菌株的致病力水平，選取強致病力的黃瓜細菌角斑病菌株用於隨後的抗病鑑定研究。
進一步地，分離的強致病力黃瓜細菌角斑病菌株用無菌的1%脫脂奶粉保存，並加甘油至終濃度為30%，分裝在1.5ml離心管後於-80℃下長期保存。
進一步地，步驟（2）中黃瓜種子要用10%的次氯酸鈉消毒後，用水衝洗3遍，催芽後定植於48孔育苗盤上，然後置於人工氣候室中培養。
一種上述方法在黃瓜抗細菌角斑病育種中的應用，也是本發明的保護範圍。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和積極效果：
（1）規範了黃瓜細菌角斑病的快速接種鑑定技術，以黃瓜幼苗子葉為接種對象，通過注射接種psl強致病力病菌，在接種過程中psl病菌接種濃度可控，保證黃瓜材料在不同批次的接種鑑定中結果的規範性、準確性、可比性、一致性和穩定性，與傳統的黃瓜幼苗葉片噴霧接種方法相比，該方法更為簡單、準確、穩定、可控，從而規範了黃瓜抗細菌角斑病菌的接種鑑定技術。
（2）採用注射快速接種子葉，接種後根據接種子葉的褪綠症狀來直接判斷黃瓜材料對黃瓜的抗性，這種判斷方法簡單、可靠，可以有效避免黃瓜噴霧接種後葉片調查時發病症狀不明顯、不穩定和鑑定結果差等問題。
（3）本發明創造性的選擇在幼苗的子葉葉背面採用微注射接種，黃瓜的子葉葉片較厚，使用無注射器針頭的注射器和子葉葉片緊密吻合，在一定的壓力作用下，可以輕輕地將菌液注射進去子葉的細胞間隙中，而且在注射過程中注意避免注射的位置產生傷口，這樣在葉片無創口情況下，接種後7天就可以根據子葉的症狀來鑑定抗病性。
附圖說明
圖1表示強致病力psl菌株的濃度；分別以1×108cfu/ml、1×107cfu/ml、1×106cfu/ml和1×105cfu/ml為濃度梯度接種黃瓜幼苗子葉。
圖2表示子葉注射法的流程；
子葉背面被去掉針頭的注射器輕輕注射到子葉細胞間隙裡，避免注射的部位產生傷口。
圖3表示在不同濃度下材料的抗病表現，其中在psl病菌>=1×107：的接種濃度下，，ps76和str8都產生黃化褪綠斑；在psl病菌=1×107：的接種濃度下，，ps76和str8都產生黃化褪綠斑；在psl病菌<=1×105:的接種濃度下，ps76和str8子葉的都不產出黃化褪綠斑，兩者無差異；在psl病菌為1×106:接種濃度下，ps76和str8症狀差異明顯，其中ps76表現為無褪綠斑，而str8的表現為黃化褪綠，該濃度合適用於區分抗感材料。表明psl強致病力菌株的最適宜接種濃度為1×106cfu/ml（圖1、圖3）。
1.子葉注射接種psl快速鑑定黃瓜抗細菌角斑病技術建立
對黃瓜的種質資源育苗並進行抗病鑑定。具體方法同（2），黃瓜種質資源在人工氣候室進行育苗，每個種質資源種8株，待到子葉完全展開時用於接種，採用psl的最適接種濃度（1×106cfu/ml）接種黃瓜的子葉背面，用手託起子葉，用無菌的注射器將菌液輕輕注入子葉背面的細胞間隙，注意在注入的時候避免接種部位產生傷口。子葉接種完後在人工氣候室內保持100%的溼度7天，然後統計不同黃瓜種質資源接種子葉的症狀。接種的子葉表現為黃化褪綠的為感病，而子葉葉片濃綠、無褪綠斑的為抗病。通過上述方法，我們篩選了10個抗細菌角斑病的材料，4個感病材料，其中4個抗病材料配製成2個雜交組合，建立了一種黃瓜子葉注射快速準確鑑定黃瓜抗細菌角斑病的方法，為應用該方法開展黃瓜抗細菌角斑病病育種奠定了技術基礎（圖4）。表1為不同的黃瓜材料對psl抗病性表現。篩選出10份抗病材料（r），4份感病材料（s）。
表1不同的黃瓜材料對psl抗病性表現
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