蠟樣芽孢桿菌及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-06 16:31:11 4

專利名稱：：蠟樣芽孢桿菌及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種蠟樣芽孢桿菌，同時還涉及一種該蠟樣芽孢桿菌的製備方法，及其在防治小麥紋枯病方面的應用。
背景技術：
：由禾穀絲核菌(Rhizoctoniacerealis)侵染小麥引起的小麥紋枯病(wheatsharpeyespot)是一種重要的土傳病害，在我國廣泛分布於黃淮冬麥區、西北春麥區和長江中下遊麥區，嚴重危害到小麥的生產，一般田塊可減產10%30%，重病田塊減產50%以上，個別田塊甚至絕收。目前，對於小麥紋枯病，尚缺乏有效抗病品種，病害的防治主要通過化學防治的方法，生產中主要採用立克秀、適樂時、三唑類等化學殺菌劑。由於農藥的大量使用，不僅導致小麥種植成本的提高，還對環境造成危害，甚至導致抗藥性菌株的出現，致使化學農藥的防效降低或者喪失。生物防治作為一種有廣泛前途的植物病害的防治方法，目前已經成為國內外研究和應用的熱點，但是，由於傳統生物防治是通過根際微生物及其代謝產物對病原物的競爭、拮抗以及誘導植物產生抗病作用(Inducedsystemicresistance,ISR)來實現的，容易受環境條件的影響，在實際應用過程中出現防效不穩定的現象。植物內生細菌是指能定殖在健康植物組織內，並與植物建立了和諧關係的一類細菌。利用定殖於小麥內部的內生細菌來進行生物防治，可以克服上述傳統生物防治的不足，具有重要的理論意義和廣泛的應用前景。因此有必要加強篩選對病害有較高防治效果的小麥內生細菌，從而加以應用。目前關於用內生芽孢桿菌來防治小麥紋枯病的研究中，沒有任何關於用蠟樣芽孢桿菌的報導。
發明內容本發明的目的在於提供了一種從拔節期健康小麥植株中分離篩選得到一株具有防治小麥紋枯病的內生細菌——賭樣芽孢桿菌。同時，本發明的目的還在於提供一種該蠟樣芽孢桿菌的製備方法。更進一步地，本發明的目的在於提供了一種蠟樣芽孢桿菌的應用。為了實現上述目的，本發明的技術方案採用了一種蠟樣芽孢桿菌，Bacilluscereus0-9，其保藏號為CCTCCNO:M209041。同時，本發明的技術方案採用了一種蠟樣芽孢桿菌的製備方法，選取健康小麥，取新鮮小麥根，自來水衝洗表面，濾紙吸去水分，經消毒、無菌水衝洗2-4次後剪小段於無菌研缽中，加入無菌磷酸緩衝液(PH7.0)，充分研碎；靜止10-20min取上清進行稀釋，取稀釋液經培養基在28-30°C培養l-2d；菌落長出後再純化於4-6°C保存。所述的消毒是先用75%乙醇表面消毒25-35S，再用0.升汞消毒10-15min。所述的培養基的具體成分為蛋白腖20g，甘油10.0g,K2HPO4L5g,MgSO4·7H201.5g，瓊脂15g，蒸餾水IOOOmL,pH7.2。胰蛋白腖(tryptone)5g、酵母提取物(yeastextract)2.5g、NaCl5g，瓊脂粉15g溶解於800ml去離子水中，調pH至7.5。進一步地，本發明的技術方案採用了一種蠟樣芽孢桿菌在預防小麥紋枯病方面的應用及蠟樣芽孢桿菌在治療小麥紋枯病方面的應用。本發明的用於防治小麥紋枯病的菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)0-9，該菌株是從黃淮麥區，拔節期小麥植株中分離得到的，短杆狀，個體較小，兩端鈍圓，革蘭氏陰性，接觸酶實驗陰性，不產生芽孢，在LB平板上菌落不透明、光滑、溼潤、白色、全緣，該菌具有運動性，產生幾丁質酶、鐵載體等可能的生防相關因子。本發明按照常規方法進行對小麥紋枯病的生物防治將蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereUS)0-9在KMB培養基中擴大培養後，製備成一定濃度的菌懸液，以此菌懸液處理小麥種子，將處理後的種子播種於感染了紋枯病菌的土壤，再以蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)0-9發酵液做一次澆灌；20天後，統計小麥紋枯病發病情況，計算防效。本發明所涉及的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)0_9在防治小麥紋枯病方面的效果明顯優於其他芽孢桿菌。以下為本發明的菌株與現有的菌株在防治小麥紋枯病方面的對比現有的菌株枯草芽孢桿菌B1-41對小麥紋枯病菌的抑制作用.微生物學雜誌200626(4)2023防效測定方法小麥種子用0.升汞表面消毒5min，再用無菌水充分洗滌，置於液體培養所得的細菌液浸種過夜，播種於無菌土中，每重複20粒種子，重複3次，出苗後接種小麥紋枯菌，4周後調查發病率，計算控病效果。同時分別設置利用井R黴素處理和僅用原始病菌作為對照。接種3周後調查，計算拮抗菌對小麥紋枯病的防治效果。所用菌株枯草芽孢桿菌平均防效60.3%對照井岡黴素防效52%。本發明的菌株採用以上所列防效測定方法，測得本發明的蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusO-9對小麥紋枯病的平均防效為74.6%。本發明的蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus0-9分離方法如下從黃淮麥區大田中選取健康小麥，取新鮮小麥根，自來水衝洗表面，濾紙吸去水分，經75%乙醇表面消毒30s、0.升汞消毒IOmiru無菌水衝洗3次後剪小段於無菌研缽中，加入6mL無菌磷酸緩衝液(pH7.0)，充分研碎。靜止IOmin取上清進行10倍、50倍、100倍稀釋，取各稀釋液200μL塗KMB(蛋白腖20g，甘油10.Og，K2HPO4L5g，MgSO4·7Η201.5g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL，pH7.2)平板，28°C培養l_2d；菌落長出後再純化於4°C保存。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)0_9在LB平板上菌落呈扁平圓形，米黃色，表面溼潤不透明，類似細小顆粒狀。該菌具有運動性，產生葡聚糖酶、幾丁質酶、蛋白酶、鐵載體等，並有利福平抗性，其他生化屬性如表1，經16srDNA鑑定為蠟樣芽孢桿菌，與其他變形斑沙雷氏菌的主要區別在於可在小麥根部大量定殖且對紋枯病有穩定防效。表1菌株0-9鑑別特徵tableseeoriginaldocumentpage5注+，陽性；_，陰性本發明的菌株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)0-9已經保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，保藏日期為2009年3月17日，其保藏編號為CCTCCNO:M209041。圖1為本發明的蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus0-9處理的病菌指數曲線。具體實施例方式實施例1從黃淮麥區大田中選取健康小麥(豫麥17)，取新鮮小麥根，自來水衝洗表面，濾紙吸去水分，經75%乙醇表面消毒30s、0.升汞消毒IOmiru無菌水衝洗3次後剪小段於無菌研缽中，加入6mL無菌磷酸緩衝液(pH7.0)，充分研碎。靜止IOmin取上清進行10倍、50倍、100倍稀釋，取各稀釋液200μL塗KMB(蛋白腖20g，甘油10.Og,K2HPO4L5g，MgSO4·7H201.5g，瓊脂15g，蒸餾水IOOOmL,pH7.2)平板，28°C培養l_2d；菌落長出後再純化於4°C保存。將保存的菌株接種於液體KMB培養基擴大培養(28°C，200rpm，Id)，離心收集菌體，以無菌水調整均懸液濃度為2X109cfu/mL，以該菌懸液對催芽後的內鄉182小麥種子浸泡lh。將處理過的麥種播種於染小麥紋枯病病原菌的土壤，統計不同菌株的防效，挑取防效較好的菌株進行重複實驗，反覆篩選。實施例2本實施例與實施例1的區別僅在於分離培養基為改良LB，其配方為胰蛋白腖(tryptone)5g、酵母提取物(yeastextract)2.5g、NaCl5g，瓊脂粉15g溶解於800ml去離子水中，調PH至7.5，加去離子水至總體積1L。本發明的蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusO-9的斜面保存斜面培養基為KMB(蛋白腖20g,甘油10.Og,K2HPO4L5g，MgSO4·7Η201·5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.2)，將BacilluscereusO-9劃線接種於斜面培養基上，28°C溫度下培養24h，將斜面於4°C冰箱保存，每兩個月進行一次傳代，保證其存活。蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusO-9定殖數量測定(1)小麥催芽豫麥17麥種經表面消毒75%酒精浸泡30s後置於0.升汞中消毒lOmin，無菌水衝洗3次，無菌水浸泡8h，26°C催芽至露白，再表面消毒一次，75%酒精浸30s後置於0.升汞中消毒lOmin，無菌水衝洗3次。(2)定殖方法①實驗處理將已催芽小麥在生防菌菌懸液中浸種lh，後用無菌鑷子放入含IOOmL淘洗乾淨滅菌沙的250mL三角瓶中，每瓶5粒，無菌沙覆蓋麥子並澆灌生防菌菌懸液20mL，每細菌處理3瓶，用無菌容器封口膜封口，以無菌水浸種、澆灌的處理作為對照。22°C培養7d。實驗重複3次。②檢測用無菌水洗出生長7d的麥苗，剪取清洗乾淨的根部進行表面消毒，0.升汞中消毒lOmin，無菌水衝洗3次，消毒濾紙吸乾表面水分，單株小麥根稱重置於滅菌研缽中並加入已滅菌BPS(6mLBPS/g根)，研碎。靜止IOmin取上清進行10倍、100倍稀釋，取各稀釋液200μL塗含利福平的KMB平板，28°C培養l_2d；吸取最後一次衝水塗布於KMB平板，檢測表面消毒是否徹底。待平板上長出菌落後計算cfu/g值，並挑取與長出的菌落與出發菌比較生理生化特性差異。經形態與菌株特性比較，平板上長出的菌與出發菌BacilluscereusO-9相同，6次實驗，平均結果為1.4X105cfu/g，說明該菌株可以在小麥根部長期穩定定殖。蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusO-9生防活性測試試驗UBacilluscereusO—9的擴大培養將BacilluscereusO-9斜面培養物接種於含60mLKMB液體培養基的250mL三角瓶中，28°C，200r/min，搖培24h，離心取菌體(16°C8000r/min5min)，用無菌水配成2X109cfu/mL的菌懸液備用。2、染病土準備將麥粒沙培養的紋枯病菌與滅菌沙土按130(w/w)的比例混勻，裝入3cmXIOcm(ΦXH)的滅菌塑料管中，每管30mL。3、生防測試表面消毒的豫麥17種子催芽後在上述細菌懸液中浸種lh，播種於含染病土的10個管中，每管3粒，澆灌細菌懸液，以無菌水浸種並澆灌的處理作為對照。無菌室20°C培養20d後根據下列分級標準統計根部發病情況。實驗重複6次。O級健康，無病症1級在莖基部出現典型病症，病斑零星，未侵入莖杆。2級在莖基部病斑連片，症斑不超過莖周長的2/3，未侵入莖杆。3級莖基部病斑連片，佔莖周長的2/3-1周。4級莖基部病斑環繞莖一周，葉鞘爛掉，病斑已侵入莖杆，但植株存活。5級葉鞘全爛掉，病斑侵入莖杆，植株枯死。formulaseeoriginaldocumentpage7發病率=(發病株數/總株數)X100%4、生防測試結果BacilluscereusO-9處理後能明顯降低小麥苗期紋枯病害病情指數和發病率(見表2，圖1)，6次重複試驗平均防效為82.86%。，同時從圖1發現，每次試驗對照組的病情指數並不十分穩定，這可能是由於溫度、病菌狀態、土質差異等因素影響了小麥紋枯病的發生，同樣也可能影響生防菌的防治效果。表2BacilluscereusO-9重複生防測試結果tableseeoriginaldocumentpage7注表中數據為6次重複實驗平均值，其後有相同字母的表示差異不顯著(P=0.05)。防治效果=(對照組病情指數_處理組病情指數)/對照組病情指數X100%結果表明以Bacilluscereus0-9處理小麥種子，並以BacilluscereusO-9菌懸液對小麥做一次灌根，可以大大降低小麥豫麥17紋枯病的發病比率和病情指數，起到較好的生防效果。本發明變形蠟樣芽孢桿菌0-9是從小麥根部分離得到的一株小麥內生細菌，該菌在本發明所用的小麥豫麥17中可以大量定殖，溫室實驗結果顯示該菌株對小麥紋枯病有良好的防效，其生防效果優於已報導的其他菌株防效，具備了良好的應用和開發前景。最後所應說明的是，以上實例僅用於說明而非限制本發明的技術方案，儘管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。權利要求蠟樣芽孢桿菌，BacilluscereusO-9，其保藏號為CCTCCNOM209041。2.蠟樣芽孢桿菌的製備方法，其特徵在於選取健康小麥，取新鮮小麥根，自來水衝洗表面，濾紙吸去水分，經消毒、無菌水衝洗2-4次後剪小段於無菌研缽中，加入無菌磷酸緩衝液(pH7.0)，充分研碎；靜止10-20min取上清進行稀釋，取稀釋液經培養基在28-30°C培養l-2d；菌落長出後再純化於4-6°C保存。3.根據權利要求2所述的蠟樣芽孢桿菌的製備方法，其特徵在於所述的消毒是先用75%乙醇表面消毒25-35s，再用0.升汞消毒10_15min。4.根據權利要求2所述的蠟樣芽孢桿菌的製備方法，其特徵在於所述的培養基為KMB培養基，具體成分為蛋白腖20g，甘油10.0g,K2HPO4L5g，MgSO4·7H201.5g，瓊脂15g，蒸溜水lOOOmL，pH7.2。5.根據權利要求2所述的蠟樣芽孢桿菌的製備方法，其特徵在於所述的培養基的具體成份為胰蛋白腖(trypt0ne)5g、酵母提取物(yeastextract)2.5g,NaCl5g，瓊脂粉15g溶解於800ml去離子水中，調pH至7.5。6.蠟樣芽孢桿菌在預防小麥紋枯病方面的應用。7.蠟樣芽孢桿菌在治療小麥紋枯病方面的應用。全文摘要本發明公開了一種具有防治小麥紋枯病功能的蠟樣芽孢桿菌及其製備方法和應用。本發明的菌株Bacilluscereus0-9CCTCCNo.M209041。對小麥紋枯病進行生物防治將菌株Bacilluscereus0-9CCTCCNo.M209041在KMB液體培養基中28℃，200rpm擴大培養後，製備菌懸液，對小麥種子進行1h浸泡，將處理過的麥種播種於染病土壤，並以該細菌發酵液做一次灌根處理。本發明的菌株為小麥內生Bacilluscereus細菌，可以在小麥豫麥17中大量定殖，對小麥紋枯病具有較好的防效(82.86％)，且效果穩定，具有較好的推廣應用前景。文檔編號A01P3/00GK101812412SQ20091006486公開日2010年8月25日申請日期2009年5月12日優先權日2009年5月12日發明者劉鳳英,張穎,王俊芳,王剛,王淼申請人:河南大學