一種鏈球菌重組亞單位疫苗及其製備方法

2023-05-02 03:40:36

專利名稱：一種鏈球菌重組亞單位疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種基因工程重組蛋白疫苗，具體地說，涉及一種預防豬鏈球菌病的基因工程重組亞單位疫苗。
背景技術：
豬鏈球菌是嚴重危害世界養豬業的一種重要的細菌性傳染病，並可引起人類的感染。該病的主要病原為馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)和豬鏈球菌2型(Streptococcus suis，type 2)。目前，防制該病主要是用抗生素和化學藥物，但因存在抗藥性和藥物殘留等不足，研製新型的疫苗是當務之急。
類M蛋白(M-Like Protein)是馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)細胞壁表面一種纖絲狀表面蛋白，是該菌重要的毒力因子和保護性抗原(Timoney J F，WalkerJ，Zhou M，et al.Cloning and sequence analysis of a protective M-like gene from streptococcusequi subsp.Zooepidemicus.Infect，Immune，1995，631440-1445)。馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多種生物學功能(Timoney JF，Arliushin SC，Boschwitz JS.Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-like protein Sem and SzPse.Infect Immun，1997，65(9)3600～3605)。其表面有調理素表位，能刺激機體產生抗調理素抗體(Timoney JF，Mukhtar M.Varability in the M proteins of the equine strains of Streptococcus equisubsp zooepidemicus，P.15～20In W.Plowright，P D Rossdale，and J F Wade(ed)，Equine Infectiousdiseases VI，Cambridge 1991，RW Publications，Newmarket，England)；能抑制補體C3b在菌體表面沉積，從而抑制機體補體系統的活化(Boschwitz JS，Timoney JF.Inhibition of C3deposition of Streptococcus equi by M proteina mechanism for survival in equine blood.InfectImmun，1994，623515～3520)；能結合機體的纖維蛋白原，使其具有抗吞噬細胞的吞噬活性(Boschwitz JS，Timoney JF.Characterization of the antiphagocytic activity of equine fibrinogenfor Streptococcus.zooepidemicus.Microb Pathog，1994，17121～129)。因此，以類M蛋白為靶點，可能研製出防制由馬鏈球菌獸疫亞種引起的豬鏈球菌病的疫苗。
在豬鏈球菌2型中，存在強毒、弱毒以及無毒三種不同毒力的菌株(Vecht U，Wissclink HJ，Jellema M L，et al.Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suistype 2.Infect.Immun，1991，593156～3162)。強毒株與無毒株的最大差別是前者呈MRP+，而後者MRP-。MRP+的豬鏈球菌往往可引起嚴重的臨床症狀，MRP-的菌株則不致任何症狀，可見MRP是該菌重要的毒力因子。MRP是豬鏈球菌2型菌體表面重要的菌體蛋白，分子量為136000，是該菌重要的保護性抗原，其結構和分布複雜(Smith Hilde E，Vecht Uri，Gielkens Arno L J，et al.Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding the 136-KDSurface Protein(Muramidase-Released Protein)of Streptococcus suis Type 2.Infect Immun，1992，602361～2367)。因此，以MRP為靶點，可能研製出防制由豬鏈球菌2型引起的豬鏈球菌病的疫苗。
我國豬鏈球菌病主要由馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型所引起，目前還沒有有效的預防鏈球菌病的疫苗。亞單位疫苗安全、高效，是目前研究的熱點之一。範紅結(範紅結，陸承平，唐家琪。豬鏈球菌2型mrp基因免疫功能片段的克隆、表達及動物試驗。微生物學報，2004，44(1)54-57)和蘇良科(蘇良科，陸承平。馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白亞單位疫苗對小鼠免疫效果評價。農業生物技術學報，2004，12(2)226-227)等分別研製了類M蛋白和MRP的亞單位疫苗，免疫仔豬後能抵抗強毒菌株的攻擊。但單獨表達的類M蛋白和MRP的亞單位疫苗因分子量較小，故免疫原性相對較差，對仔豬的免疫保護率還有待提高，並且一次免疫只能預防一種鏈球菌的感染。通過將含保護性抗原表位的類M基因和MRP基因融合，進行融合表達，製備的亞單位疫苗因分子量大，可提高其免疫原性，從而提高疫苗的免疫保護率，並且免疫一次可以預防兩種鏈球菌引起的感染。因此，將馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白和豬鏈球菌2型MRP抗原表位融合就成為研製預防豬鏈球菌病基因工程疫苗的一個技術關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於預防和/或治療豬鏈球菌疾病的重組蛋白疫苗，其中包括由馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白和豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-Released Protein，MRP)片段融合而成的融合蛋白。
本發明的另一個目的是提供一種編碼本發明所述融合蛋白的基因。
一方面，本發明提供了一種具有免疫原性的融合蛋白，該融合蛋白是由馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)類M蛋白片段和豬鏈球菌2型(Streptococcus suis，type 2)MRP片段融合而成。在本發明的一個實例中，其中類M蛋白片段位於該融合蛋白的氨基端，MRP片段位於該融合蛋白的羧基端，該融合蛋白具有SEQ ID NO4所示的胺基酸序列。
本發明所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白和豬鏈球菌2型MRP片段融合形成的融合蛋白在進入豬體內以後，可刺激豬體內外周免疫器官的B淋巴細胞，使其活化、增生、分化為漿細胞，產生針對馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白和豬鏈球菌2型MRP的特異性抗體分子，藉助於ADCC、補體活化以及粘附抑制等途徑清除進入體內的馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型，因而對豬鏈球菌病有預防作用。
另一方面，本發明提供了一種編碼本發明所述融合蛋白的嵌合基因。該嵌合基因是將編碼馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的多核苷酸片段和編碼豬鏈球菌2型MRP片段的多核苷酸片段融合形成的。在本發明的一個實例中，該嵌合基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
另一方面，本發明還提供了編碼本發明所述類M蛋白片段的多核苷酸片段。在本發明的一個實例中，該多核苷酸片段具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，克隆自馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株。
另一方面，本發明還提供了編碼本發明所述MRP片段的多核苷酸片段。在本發明的一個實例中，該多核苷酸片段具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，克隆自豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2)HA9801株。該菌系姚火春等1998年從江蘇爆發豬鏈球菌病的病豬中分離獲得的，具體分離過程及該菌株特徵參見文獻姚火春等，豬鏈球菌1998分離株病原特性鑑定，南京農業大學學報，1999，22(2)67～70，該文獻在此全文引入作為參考。
本發明中的HA9801菌株已於2005年8月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCC NO.1446。
另一方面，本發明提供了一種豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2)菌株，其保藏號為CGMCC NO.1446。
另一方面，本發明還提供了一種重組構建體，其中包括上述編碼本發明所述融合蛋白的基因，該基因被可操作地連接於表達調控區域。
另一方面，本發明還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞已被上述重組構建體轉化。
另一方面，本發明還提供了一種製備本發明所述融合蛋白的方法，該方法將上述的宿主細胞置於足以表達該融合蛋白的條件下進行培養。
另一方面，本發明還提供了所述融合蛋白在製備用於預防或治療豬鏈球菌疾病藥物中的用途，其中所述的豬鏈球菌病是由馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌以及D、E群鏈球菌引發的，其中所述豬鏈球菌病優選是由馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌2型引發的。
另一方面，本發明還提供了一種疫苗組合物，其中包括本發明所述的具有免疫原性的融合蛋白，以及藥物學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。本發明提供的免疫保護力試驗證明該疫苗組合物能夠有效預防和/或治療豬鏈球菌疾病。在本發明的一個實施例中，使用的佐劑為氫氧化鋁凝膠。
本發明所述的由馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白抗原表位和豬鏈球菌2型MRP抗原表位片段融合形成的融合蛋白具有下述優點(1)使用方便，在向豬施用含該融合蛋白的疫苗組合物後，能夠同時提供針對馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型的免疫保護作用；(2)具有良好的免疫原性，本發明人將單獨表達的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白抗原表位和豬鏈球菌2型MRP抗原表位分別向豬施用，雖然可刺激機體產生針對類M蛋白和MRP的免疫應答，但免疫保護作用與融合蛋白相比明顯較弱。


圖1.圖示的是表達產物SDS-PAGE電泳結果。
其中，第1泳道為含PET32-a(+)的BL21空白菌體；第2泳道為未經IPTG誘導的重組質粒；第3-6泳道為經IPTG誘導後的重組質粒；第7泳道為分子量大小的Marker。
下列實施例的給出是為了更好地理解和闡述本發明，而決不應理解為對本發明的任何限制。
除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。
實施例實施例1獲取馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白抗原表位的編碼基因馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株，1977年分離自我國四川，由ATCC收藏。挑取兔血瓊脂平板上ATCC35246株單菌落接種至含5％犢牛血清(衛崗血清廠產品)的Todd-Hewittbroth(THB)(購自Oxford公司)肉湯中，37℃靜置培養過夜，取0.5mL菌液離心，提取染色體DNA，溶於PH8.0TE緩衝液中，凍存備用。
提取馬鏈球菌獸疫亞種基因組DNA的方法參照按Michael W Lema等(Michael W L，Brown A，Collins A.A general method foe the extraction of DNA from bacterial.J MicrobiolMethods，1994，19167-172)的方法稍加改進，步驟如下分別挑取兔血平板上ATCC35246菌落接種到Todd-Hewit肉湯，37℃靜止培養過夜；取0.5mL菌液6000g離心5min，沉澱以TE緩衝液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4)洗滌；以冷丙酮懸浮菌體6000g離心5min，並乾燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL處理菌體1h，加TESN裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％Sarkosyl，6mol/L NaI，pH7.4)裂解；加等體積異丙醇沉澱DNA，10000g離心10min；沉澱懸浮於200uL40％異丙醇中，離心洗滌；70％乙醇洗滌沉澱；乾燥的沉澱溶於100uLTE緩衝液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃備用。
採用聚合酶鏈反應(PCR)方法自馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株染色體DNA中分離類M蛋白基因(SzpM)。採用的引物序列分別是正義引物P15′GTTGGATCCTTTGCTGGAGTTGAAGA 3′(SEQ ID NO5)反義引物P25′GTAGAGCTCGGTGAAGAATGGATTTG 3′(SEQ ID NO6)所述PCR操作程序是在一500ul微量離心管中加入下列試劑模板DNA2μL10xPCR buffer 10μL25mM Mgcl28μL2.5mM dNTPs8μL引物 各0.5μLddH2O 70μLTag酶 3μL混勻後，立即進行PCR反應。PCR循環參數94℃變性4℃後，進入循環，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30個循環，最後72℃延伸10min。
按照產品說明書推薦的方法，將擴增出的類M蛋白基因片段與T載體(購自TaKaRa公司)連接，進行克隆。按常規方法提取質粒，採用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行測序(J Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
實施例2獲取豬鏈球菌2型MRP抗原表位的編碼基因豬鏈球菌2型HA9801株系姚火春等(南京農業大學學報，1999，22(2)67～70)1998年從江蘇爆發豬鏈球菌病的病豬中分離、鑑定，已於2005年8月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為CGMCC NO.1446。挑取兔血瓊脂平板上HA9801株單菌落接種至含5％犢牛血清(購自衛崗血清廠)的Todd-Hewitt broth(THB)肉湯中，37℃靜置培養過夜，取0.5mL菌液離心，提取染色體DNA，溶於PH8.0TE緩衝液中，凍存備用。
提取馬鏈球菌獸疫亞種基因組DNA的方法參照按Michael W Lema等(Michael W L，Brown A，Collins A.A general method foe the extraction of DNA from bacterial.J MicrobiolMethods，1994，19167-172)的方法稍加改進，步驟如下分別挑取兔血平板上HA9801菌落接種到Todd-Hewit肉湯，37℃靜止培養過夜；取0.5mL菌液離心沉澱，TE緩衝液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH7.4)洗滌菌體；以冷丙酮懸浮菌體6000g離心5min，並乾燥；37℃用溶菌酶(2mg/mL)200uL處理菌體1h，加TESN裂解液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，1％Sarkosyl，6mol/L NaI，pH7.4)裂解；加等體積異丙醇沉澱DNA，10000g離心10min；沉澱懸浮於200uL40％異丙醇中，離心洗滌；70％乙醇洗滌沉澱；乾燥的沉澱溶於100uLTE緩衝液(10mMol/LTris-Hcl，1mMol/L EDTA，pH8.0)，4℃備用。
採用聚合酶鏈反應(PCR)方法自豬鏈球菌2型HA9801株染色體DNA中分離mrp基因。採用的引物序列分別是正義引物P35′GTAGAGCTCGAACAGGTAACATCAGA 3′(SEQ ID NO7)反義引物P45′GAGAAGCTTAAGAGTAACGAATGTAGG 3′(SEQ ID NO8)所述PCR操作程序是在一500ul微量離心管中加入下列試劑模板DNA 2μL10x PCR buffer 10μL25mM MgCl28μL2.5mM dNTPs 8μL引物 各0.5μLddH2O 70μLTag酶3μL
混勻後，立即進行PCR反應。PCR循環參數94℃變性4℃後，進入循環，94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30個循環，最後72℃延伸10min。
將擴增出的類M蛋白基因片段與T載體連接，進行克隆。按常規方法提取質粒，採用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行測序(J Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
實施例3構建豬鏈球菌2型mrp基因片段與馬鏈球菌獸疫亞種類M基因片段融合基因及克隆將擴增的類M蛋白基因片段和mrp基因片段分別以DNA回收試劑盒(Roche公司產品)純化，具體步驟按說明書進行。純化後類M基因片段以BamHI和SacI(紐英倫公司產品)進行酶切；mrp基因片段以SacI和HindIII(紐英倫公司產品)進行酶切。酶切產物再次以DNA回收試劑盒回收。
將回收的類M基因片段與經BamHI和SacI雙酶切的空pET-32a(+)質粒(TaKaRa公司產品)以T4連接酶(紐英倫公司產品)連接，轉化感受態的DH5α以氨苄抗性平板篩選重組菌。利用QIAgen質粒提取試劑盒(QIAgen公司產品)，提取含類M基因片段的重組質粒，以SacI和HindIII進行雙酶切後，以T4連接酶將其與經SacI和HindIII酶切並回收的mrp基因片段相連接，轉化感受態的DH5α，以氨苄抗性平板篩選重組菌。
目的片斷的回收和純化PCR產物經1％瓊脂糖電泳後，切下目的條帶，用DNA快速純化試劑盒提取凝膠中目的片段，具體步驟按試劑盒說明書進行操作。即瓊脂糖電泳後割下含DNA的瓊脂糖塊，使體積儘可能小，放入1.5mL ependoff管中；按每100mg瓊脂糖塊加入300μL結合緩衝液的比例加入結合緩衝液，將ependoff管渦旋振蕩15～30s，置50℃水浴10min，使瓊脂塊完全溶化，每2～3min渦旋振蕩一次；按每100mg瓊脂糖塊加入150μL異戊醇的比例加入異戊醇，渦旋振蕩徹底混勻；將溶化後的溶液移入吸附柱中，12000g、15～25℃離心1min，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個收集管中；在吸附柱中加入500μL洗脫緩衝液，12000g、15～25℃離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；在吸附柱中再次加入200μL洗脫緩衝液，靜置1min後，12000g、15～25℃離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；12000rpm、15～25℃離心1min，徹底除去吸附柱中的洗脫液；將吸附柱放入一隻乾淨的1.5mL ependoff管中，在吸附膜中央加入50～100μL溶解緩衝液，靜置1min後，12000g、15～25℃離心1min，回收產物即為純化的目的片段，回收產物-20℃凍存備用。
PCR產物的酶切反應體系為20μL，在0.5mL ependoff管中依次加入SalI 0.5μLBamHI 0.5μL10X buffer 1 1μLDNA(PCR產物) 8μLddH2O 10μL混勻，37℃酶切2h，65℃15min終止反應。
質粒pET-322a(+)的擴增、提取接種含pET-322a(+)空質粒的宿主菌DH5α至LB肉湯(含Amp100ug/ml)中，37℃搖振培養12～14h。按QIAGEN質粒提取試劑盒說明書進行。
取3mL菌液至1.5mL ependoff管中，4℃、8000rpm離心3min，徹底棄上清；加250μL p1緩衝液至ependoff管中，重新溶解菌泥沉澱，混勻；加250μL p2緩衝液至ependoff管中，輕輕顛倒混勻4～6次，靜置4min，可見溶液變澄清；加350μLN3緩衝液至ependoff管中，立即輕輕顛倒混勻4～6次；4℃、12000rpm離心10min，將上清吸至QIAprep柱中；4℃、12000rpm離心1min，甩去離心柱內的棄液；加0.5mL PB緩衝液至QIA prep柱中，4℃、12000rpm離心1min，甩去柱內的棄液；加0.75mLPE緩衝液至柱中，4℃、12000rpm離心1min，甩去離心柱內的棄液；再次離心1min；徹底棄去柱內的液體；將離心柱安置乾淨的1.5mL ependoff管中，加入50μL EB緩衝液(10mM Tris-HCl，pH8.5)至柱子中央，37℃靜置1～2min，4℃、12000rpm離心1min，收集洗脫液，即為提取的質粒，-20℃凍存備用。
質粒pET-322a(+)酶切在0.5mL的eppendorf管依次加入質粒 8μL10X buffer 1 2μLBamHI1μLSacl 1μLddH2O 8μL
混勻，37℃水浴酶切2h，65℃15min終止反應。
按Roche DNA快速回收試劑盒說明書回收酶切產物。
重組質粒的構建0.5mL ependorff管中依次加入載體DNA 0.5μLmrp基因PCR回收產物 4μL10X連接buffer2μLT4DNA連接酶 1μLddH2O12.5μL16℃連接過夜。
感受態細胞的製備和轉化從新鮮LB平板挑取單菌落的DH5α接種10mL LB肉湯，37℃劇烈搖振培養3～4h後，冰上放置10min；4℃、6000rpm離心4min，以冰預冷的0.1mol/mL CaCl2懸浮沉澱，置冰浴10min；4℃、6000rpm離心4min，加400μL冰預冷的0.1mol/mL CaCl2重新懸浮沉澱，4℃放置待用；取200μL感受態細胞至eppendorff管中，加入10μL的連接產物，立即混勻，冰上放置30min；42℃熱休克90s，迅速轉移至冰浴2min，然後加入800μL 37℃預熱的LB培養基，37℃緩慢搖振2h；取100μL培養液塗布LB平板(含Amp 100μg/mL)37℃培養14～16h。
含mrp基因重組質粒酶切在0.5mL的eppendorf管依次加入重組質粒 8μL10X buffer 1 2μLBamHI 1μLSacl 1μLddH2O8μL混勻，37℃水浴酶切2h，65℃15min終止反應。
按Roche DNA快速回收試劑盒說明書回收酶切產物基因融合0.5mL ependorff管中依次加入載體DNA 0.5μL類M基因PCR回收產物4μL10X連接buffer 2μLT4DNA連接酶 1μLddH2O 12.5μL16℃連接過夜。
將含融合基因的的重組質粒pET-S-M轉化大腸桿菌BL21，感受態製備的方法及細菌的轉化同上，用限制性內切酶酶切的方法及重組質粒測序的方法鑑定重組克隆。
重組質粒冰凍保存於-20℃，重組菌在含20～50％甘油培養液中保存於-20℃或-70℃。
融合基因的序列測定採用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行測序。結果表明，所得到的融合基因的序列與設計的完全一致。
實施例4豬鏈球菌2型mrp基因片段與馬鏈球菌獸疫亞種類M基因片段融合基因的表達將重組融合質粒轉化感受態大腸桿菌BL21(TaKaRa公司產品)，以氨苄平板篩選。挑取單菌落接種含Amp的LB肉湯5mL，28℃搖振4～5h，接種含Amp的LB肉湯1000mL，28℃劇烈搖振4～5h，當OD600達0.6時，加IPTG(Sigma公司產品)誘導，37℃劇烈搖振2～4h。三角燒瓶於冰上5分鐘，4℃5000g離心5分鐘，棄上清，收集細菌，立即使用或凍存。
實施例5豬鏈球菌2型mrp基因片段與馬鏈球菌獸疫亞種類M基因片段融合蛋白的純化重組菌經IPTG誘導後，離心，菌體沉澱以pH7.2、濃度為10m Mol的PBS溶液洗滌2次後，加入50mLpH7.2、濃度為10mMol的PBS溶液重新懸浮沉澱，以超聲波儀進行破碎，破碎功率設定為800瓦、共破碎100次，每次破碎10s鍾，間隔15s。破碎完畢後10000rpm離心10min，收集上清。取20μL離心後的上清，加等量SDS-PAGE上樣緩衝液，煮沸5min，BL21空宿主菌亦經同樣的處理作為對照，後進行SDS-PAGE。電泳結果如圖1所示。電泳後凝膠經染色、脫色後，以薄層掃描測定融合蛋白佔菌體總蛋白的含量，同時以BIO-RAD(Smart SpecTM3000)測定上清內菌體蛋白的總量。
破碎上清以His親和層析柱層析(QIAGEN公司產品)，純化重組蛋白，並以BIO-RAD(Smart SpecTM3000)測定收集蛋白的濃度。採用常規的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，Polyacrylamide gel electrophoresis 6.36-6.49，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)測定蛋白的純度，蛋白純度為99％。
實施例6重組蛋白疫苗對仔豬的免疫保護效力試驗1菌株和質粒馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)ATCC35246株，分離自我國四川，購自美國菌種保存中心；豬鏈球菌2型HA9801株系姚火春等從江蘇1998年爆發豬鏈球菌病的病豬中分離、鑑定。
2實驗動物實驗豬為安徽省地方優良品種定遠豬，由安徽蕪湖某養豬場提供，重約8kg，免疫前飼養1周，確證無任何疫病。試驗豬共40頭，分4組，10頭/組。
3試驗方法3.1類M蛋白和MRP亞單位疫苗的製備將本實驗室構建的含類M基因片段和含mrp基因片段的重組菌pET-32a(+)分別經IPTG誘導表達，以His親和層析柱層析(QIAGEN公司產品)純化，將蛋白濃度調整至2.0mg/mL，加入10％的氫氧化鋁凝膠(南京藥械廠產品)製備免疫用疫苗。
3.2融合蛋白免疫原的製備將重組菌的純化融合蛋白調整濃度至2.0mg/mL，加入10％的氫氧化鋁凝膠製備免疫用疫苗。
3.3疫苗豬體免疫實驗及攻擊將40頭仔豬分成4組，每組10頭。第1組用重組類M蛋白亞單位疫苗免疫，第二組重組MRP亞單位疫苗免疫，第三組用純化的融合蛋白免疫，第四組為對照組。初次免疫1月後，各組以同樣的疫苗加強免疫一次。再次免疫2周後，連同對照組均以強毒菌株攻擊，記錄每組的死亡豬頭數。
4試驗結果及結論強毒菌株攻擊後，第一組兩周內有3頭豬發病死亡；第二組攻擊後第5天有一頭豬死亡，兩周內共有4頭豬死亡；第三組第六天開始有豬死亡，兩周內共有2頭豬死亡。對照組全部發病死亡(表1)。
表1融合蛋白的免疫保護效力試驗

結論是重組融合蛋白對豬有80％的免疫保護率，經過優化和添加適當佐劑，其免疫保護效力會更高，其可作為預防豬鏈球菌2型和馬鏈球菌獸疫亞種有效的重組亞單位二聯疫苗。
序列表110範紅結 陸承平 姚火春120一種鏈球菌重組亞單位疫苗及其製備方法130
1608170PatentIn version 3.12101211480212DNA213馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)220
221基因組222(1)..(480)223
4001tttgctggag ttgaagaaaa gcatgctcaa gcaatggctg catttgaagc agcattcgca 60gcatacaagg aagctgttaa ggctgaattg aaggcagcag gtgctagcga cttctacacc 120aagaagattg actctgccaa cacagttgac ggtgttaaga cactcagaga aatgatctta 180gactcaattg ctaagccaga ggttgaacca gaggctaagc ctgaacctaa gccagaacca 240aaacctgagc caaaaccaga acctaaacca gaacctaaac cagaacctaa gccagagcca 300aaaccagaac ctaagcctga gcctaagcca gaaccaaaac cagaacctaa gccaaaacct 360caacctaaac cagctccagc tccaaaacct gaagctagga aggaagagaa gaaagcagcg 420cctaagcaag acgccaacaa attgccatca acaggtgaag ctacaaatcc attcttcacc 480
2102211529212DNA213豬鏈球菌2型(Streptococcus suis type 2)220
221基因組222(1)..(529)223
4002aagagtaacg aatgtaggca tcaacttcag ctcctttata agttgagcta gccatatttt60tattatatga gtacaaatcg tacgattcaa aagtatacca atttggctct gatgtcgctt120taattccatc ttgagttcga agtgtatgtg gagcaattgc tgcaccattt ggctcagcca180ttgaaggcgt tgctgttgta gtgctatcta gaagggtacc ttcgccatca ccaactttca240atgttgatgc agttgtatca ggtgctactg tatcaagagc cgctgtcaag agaccatcta300cagtgtattt ttgcaattca ttccctagcg cctcgttggc tactttaacc gctgcgactt360gcgcttcaac ttgctcaaca gttgcttctg agtcagccaa aattgcctta gctgctgcaa420gttttgtttg agcatcctct atagcttttg caagagttgc atcttcagtt ttagccaact480ctttttgacc aagaccagcc aaaagtggtg attctgatgt tacctgttc52921032111015212DNA213人工序列220
221融合基因222(1)..(1015)
223
4003tttgctggag ttgaagaaaa gcatgctcaa gcaatggctg catttgaagc agcattcgca60gcatacaagg aagctgttaa ggctgaattg aaggcagcag gtgctagcga cttctacacc120aaraagattg actctgccaa cacagttgac ggtgttaaga cactcagaga aatgatctta180gactcaattg ctaagccaga ggttgaacca gaggctaagc ctgaacctaa gccagaacca240aaacctgagc caaaaccaga acctaaacca gaacctaaac cagaacctaa gccagagcca300aaaccagaac ctaagcctga gcctaagcca gaaccaaaac cagaacctaa gccaaaacct360caacctaaac cagctccagc tccaaaacct gaagctarga aggaagagaa gaaagcagcg420cctaagcaag acgccaacaa attgccatca acaggtgaag ctacaaatcc attcttcacc480gagctcgaac aggtaacatc agaatcacca cttttggctg gtcttggtca aaaagagttg540gctaaaactg aagatgcaac tcttgcaaaa gctatagagg atgctcaaac aaaacttgca600gcagctaagg caattttggc tgactcagaa gcaactgttg agcaagttga agcgcaagtc660gcagcggtta aagtagccaa cgaggcgcta gggaatgaat tgcaaaaata cactgtagat720ggtctcttga cagcggctyt tgatacagta gcacctgata caactgcatc aacattgaaa780gttggtgatg gcgaaggtac ccttctagat agcactacaa cagcaacgcc ttcaatggct840gagccaaatg gtgcagcaat tgctccacat acacttcgaa ctcaagatgg aattaaagcg900acatcagagc caaattggta tacttttgaa tcgtacgatt tgtactcata taataaaaat960atggctagct caacttataa aggagctgaa gttgatgcct acattcgtta ctctt 10152104
211338212PRT213融合蛋白220
221misc_feature222(133)..(133)223第133位的′Xaa′為Arg或Lys.
220
221misc_feature222(247)..(247)223第247位的′Xaa′為Leu或Phe.
4004Phe Ala Gly Val Glu Glu Lys His Ala Gln Ala Met Ala Ala Phe Glu1 5 10 15Ala Ala Phe Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Val Lys Ala Glu Leu Lys Ala20 25 30Ala Gly Ala Ser Asp Phe Tyr Thr Lys Lys Ile Asp Ser Ala Asn Thr35 40 45Val Asp Gly Val Lys Thr Leu Arg Glu Met Ile Leu Asp Ser Ile Ala50 55 60Lys Pro Glu Val Glu Pro Glu Ala Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro65 70 75 80Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro85 90 95
Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro Lys Pro Glu Pro100 105 110Lys Pro Glu Pro Lys Pro Lys Pro Gln Pro Lys Pro Ala Pro Ala Pro115 120 125Lys Pro Glu Ala Xaa Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ala Pro Lys Gln Asp130 135 140Ala Asn Lys Leu Pro Ser Thr Gly Glu Ala Thr Asn Pro Phe Phe Thr145 150 155 160Glu Leu Glu Gln Val Thr Ser Glu Ser Pro Leu Leu Ala Gly Leu Gly165 170 175Gln Lys Glu Leu Ala Lys Thr Glu Asp Ala Thr Leu Ala Lys Ala Ile180 185 190Glu Asp Ala Gln Thr Lys Leu Ala Ala Ala Lys Ala Ile Leu Ala Asp195 200 205Ser Glu Ala Thr Val Glu Gln Val Glu Ala Gln Val Ala Ala Val Lys210 215 220Val Ala Asn Glu Ala Leu Gly Asn Glu Leu Gln Lys Tyr Thr Val Asp225 230 235 240Gly Leu Leu Thr Ala Ala Xaa Asp Thr Val Ala Pro Asp Thr Thr Ala245 250 255
Ser Thr Leu Lys Val Gly Asp Gly Glu Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr260 265 270Thr Thr Ala Thr Pro Ser Met Ala Glu Pro Asn Gly Ala Ala Ile Ala275 280 285Pro His Thr Leu Arg Thr Gln Asp Gly Ile Lys Ala Thr Ser Glu Pro290 295 300Asn Trp Tyr Thr Phe Glu Ser Tyr Asp Leu Tyr Ser Tyr Asn Lys Asn305 310 315 320Met Ala Ser Ser Thr Tyr Lys Gly Ala Glu Val Asp Ala Tyr Ile Arg325 330 335Tyr Ser210521126212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(26)223
4005gttggatcct ttgctggagt tgaaga 26
210621126212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(26)223
4006gtagagctcg gtgaagaatg gatttg 26210721126212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(26)223
4007gtagagctcg aacaggtaac atcaga 26210821127212DNA213人工序列220
221引物222(1)..(27)223
4008gagaagctta agagtaacga atgtagg2權利要求
1一種用於預防和/或治療豬鏈球菌疾病的重組蛋白疫苗，其中含有由馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)類M蛋白片段和豬鏈球菌2型(Streptococcus suistype 2)溶菌酶釋放蛋白片段融合而形成的融合蛋白，以及藥物學上可接受的載體、稀釋劑和/或佐劑。
2.權利要求1所述重組蛋白疫苗，其中類M蛋白片段位於融合蛋白的氨基端，豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白片段位於融合蛋白的羧基端。
3.權利要求2所述重組蛋白疫苗，其中所述的融合蛋白具有SEQ ID NO4所示的胺基酸序列。
4.權利要求1-3中任一項所述重組蛋白疫苗，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種為馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株。
5.權利要求1-3中任一項所述重組蛋白疫苗，其中所述的豬鏈球菌2型為豬鏈球菌2型CGMCC NO.1446株。
6.權利要求1所述重組蛋白疫苗，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白片段的編碼基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
7.權利要求1所述重組蛋白疫苗，其中所述的豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白片段的編碼基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
8.權利要求1所述的重組蛋白疫苗，其中所述融合蛋白的編碼基因具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
9.上述權利要求中任一項所述重組蛋白疫苗在製備用於預防和/或治療豬鏈球菌疾病藥物中的用途。
10.一種豬鏈球菌2型菌株，其保藏號為CGMCC NO.1446。
全文摘要
本發明提供了一種疫苗組合物及其製備方法，其中所述疫苗組合物中包括由馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp zooepidemicus)類M蛋白片段和豬鏈球菌(Streptococcussuis)2型溶菌酶釋放蛋白片段融合而形成的融合蛋白，該融合蛋白具有良好的免疫原性，可有效防制豬鏈球菌病。本發明還提供了編碼該融合蛋白的基因。
文檔編號C12N15/62GK1833723SQ200610075969
公開日2006年9月20日 申請日期2006年4月25日 優先權日2006年4月25日
發明者範紅結, 陸承平, 姚火春 申請人:範紅結, 陸承平, 姚火春