定量檢測小顆粒低密度脂蛋白的方法
2023-05-01 18:39:56
專利名稱：定量檢測小顆粒低密度脂蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及分級定量檢測小顆粒低密度脂蛋白的方法，其對於動脈硬化的臨床診斷是重要的。
背景技術：
低密度脂蛋白(LDS)在血液中膽固醇運輸中起重要作用並且是動脈硬化的危險因素。公知小顆粒低密度脂蛋白(下文中「小顆粒LDL」)在LDL中顆粒尤其小並且比標準LDL密度更高，並且與正常LDL相比，使動脈硬化的危險性增加數倍。小顆粒LDL的增加是動脈硬化的主要危險因素之一。分級檢測小顆粒LDL在臨床上非常重要。
檢測小顆粒LDL的常規方法使用超速離心、電泳、高速液相層析，等等。超速離心方法通過使用密度的不同分離小顆粒LDL，並檢測其中的膽固醇和蛋白質的量。小顆粒LDL在1.040到1.063之間的密度被分級分離(Atherosclerosis，48，33-49頁，1993Atherosclerosis，106，241-253頁，1994，等)。然而，該方法需要昂貴的設施，並且檢測很耗時。電泳方法使用聚丙烯醯胺凝膠檢測LDL的運動性和顆粒直徑。小顆粒LDL的顆粒大小低於25.5nm(JAMA，260，1917-21頁，1988，等)，並且LDL的相對運動性(從VLDL到LDL的移動距離除以從VLDL到HDL的移動距離)不小於0.4(Domyakukoka(alteriosclerosis)，25，67-70頁，1997)。然而，這些方法用於檢測LDL中小LDL顆粒的程度，並且它們不用於得到定量檢測。而且，一次可以試驗的樣品數受到限制，並且進行檢測耗費很長時間。最近，發明了檢測脂蛋白的方法。在該方法中，電泳後，對瓊脂糖凝膠進行脂質染色，並使用計算機分析染色圖案，並得到脂蛋白的定量檢測(日本專利公開號2000-356641)。這是用於分析變性LDL，如經氧化的LDL、乙醯化LDL、糖基化LDL、MDA-LDL等的方法。通過該方法不能準確檢測小顆粒LDL。因為該分析需要非常昂貴的設備，該方法不適於一般用途。
通常，在HDL的檢測中，公知聚陰離子與二價陽離子的組合可用作分離試劑用以通過凝聚不同於HDL的脂蛋白而分離HDL。例如，使用硫酸葡聚糖-Mg2+(Clin.Chem.28，1379-88頁，1982，等)、肝素-Mn2+(J Lipid Res.19.65-76頁，1978，等)、肝素-Ca2+(Arch.Biochem.Biophys.170，334-40頁，1975，等)和磷鎢酸-Mg2+(Clin.Chem，23，882-84頁，1977，等)的方法等是公知的。此外，已經報導了使用一些分離試劑通過脂蛋白的逐步沉澱計算LDL和VLDL的級分的方法(日本專利公開號7-294532，Rinsho-Byori，特別版21，82，1975，等等)。此外，還報導了使用聚乙二醇分離HDL的方法(Ann.Clin.Biochem.18，177-81頁，1981)。
此外，還有常規方法，如使用多種分離試劑通過脂蛋白的逐步沉澱，基於濁度的不同檢測每種脂蛋白的方法(Rinsho-Byori，特別版21，82，1975，等等)，和根據不同的離子強度懸浮或者溶解小顆粒LDL並通過吸光度的不同檢測小顆粒LDL的方法(日本專利公開號2003-28882)。然而，因為檢測光吸光度，所以特異性和準確度不足。
專利文件1日本專利公開號2000-356641專利文件2日本專利公開號7-294532專利文件3日本專利公開號2003-28882非專利文件1Atherosclerosis，48，33-49頁，1993非專利文件2Atherosclerosis，106，241-253頁，1994非專利文件3JAMA，260，1917-21頁，1988非專利文件4Domyakukoka，25，67-70頁，1997非專利文件5Clin.Chem.28，1379-88頁，1982非專利文件6J Lipid Res.19.65-76頁，1978非專利文件7Arch.Biochem.Biophys.170，334-40頁，1975非專利文件8Clin.Chem，23，882-84頁，1977非專利文件9Rinsho-Byori，特別版21，82，1975非專利文件10Ann.Clin.Biochem.18，177-81頁，1981發明公開本發明的目的是提供分級檢測小顆粒LDL的快速而簡單的方法。
如上所述，已經報導了在脂蛋白混合物中使用分離試劑如聚陰離子、二價陽離子等凝聚不同於HDL的脂蛋白。脂蛋白混合物中主要級分如VLDL、LDL和HDL由於它們的物理性質的不同可以通過分離試劑分離。然而，還沒有嘗試通過更簡單的方法將LDL分離成亞級分。
本發明人已經廣泛研究了分離小顆粒LDL的方法，發現通過用適宜濃度的聚陰離子和二價陽離子的處理試樣可以將小顆粒LDL與其他LDL分離。還通過加入作為離子強度調節劑的一價陽離子實現小顆粒LDL的更好的分離。此外，通過使用PEG代替聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子得到類似效果。
本發明人已經詳細研究了聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子聯合使用時這些離子的濃度，還研究了使用PEG時PEG的濃度。通過建立所要使用的一系列濃度，他們發現這樣的條件，在該條件下通過凝聚不同於小顆粒LDL的LDL將小顆粒LDL與LDL顆粒分離。通過該反應，不同於小顆粒LDL的LDL形成凝結塊，其將通過離心或者過濾從反應混合物除去。凝膠塊除去後，通過將檢測LDL膽固醇的試劑、檢測LDL中甘油三酯的試劑，或者抗人脫輔基蛋白質B抗體，可以定量檢測小顆粒LDL中膽固醇、甘油三酯或者蛋白質，從而完成了本發明。
與利用離子強度的不同懸浮或者溶解小顆粒LDL後基於吸光度的不同檢測小顆粒LDL的上述方法(日本專利公開號2003-28882)相比，本發明在特異性和準確度都更優，因為在分離後檢測小顆粒LDL中膽固醇、甘油三酯和蛋白質。
本發明提供了下面的方法和試劑盒(1)定量試樣中小顆粒低密度脂蛋白的方法，其包括第一步將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離，和第二步檢測所分離的小顆粒低密度脂蛋白中膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
(2)根據(1)的方法，其中在第一步中用聚陰離子和二價陽離子將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離。
(3)根據(1)或者(2)的方法，其中在第一步中還用一價陽離子將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離。
(4)根據(2)或者(3)的方法，其中用於第一步的聚陰離子選自肝素、磷鎢酸和硫酸葡聚糖。
(5)根據(2)到(4)任一項的方法，其中用於第一步的二價陽離子選自Mn2+、Mg2+和Ca2+。
(6)根據(3)或者(5)的方法，其中用於第一步的一價陽離子選自Na+、K+和Li+。
(7)根據(4)到(6)任一項的方法，其中當將聚陰離子加入試樣中時，該聚陰離子的終濃度對於肝素為10-250U/mL，對於硫酸葡聚糖為0.02-1.25％，對於磷鎢酸為0.02-1.25％。
(8)根據(5)到(7)任一項的方法，其中當將二價陽離子加入試樣中時，該二價陽離子的終濃度對於Mn2+為2.5-35mmol/L，對於Mg2+為2.5-125mmol/L，對於Ca2+為1-75mmol/L。
(9)根據(6)到(8)任一項的方法，其中當將一價陽離子加入試樣中時，該一價陽離子的終濃度為0-50mmol/L。
(10)根據(1)的方法，其中在第一步中用PEG將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離。
(11)根據(10)的方法，其中當將PEG加入試樣中時，PEG的終濃度為2-5％。
(12)根據(1)到(11)任一項的方法，其中使用用於定量檢測低密度脂蛋白中的膽固醇並且不需要分級分離的試劑實施第二步中膽固醇的檢測。
(13)根據(1)到(11)任一項的方法，其中使用用於定量檢測低密度脂蛋白中的甘油三酯並且不需要分級分離的試劑實施第二步中甘油三酯的檢測。
(14)根據(1)到(11)任一項的方法，其中通過使用抗人脫輔基蛋白質B抗體實施第二步中蛋白質的檢測。
(15)從試樣分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其包括通過向所述試樣中加入聚陰離子和二價陽離子沉澱不同於小顆粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步驟。
(16)根據(15)的方法，其包括還通過向所述試樣中加入一價陽離子沉澱不同於小顆粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步驟。
(17)根據(15)或(16)分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中聚陰離子選自肝素、磷鎢酸和硫酸葡聚糖。
(18)根據(15)到(17)任一項分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中二價陽離子選自Mn2+、Mg2+和Ca2+。
(19)根據(15)到(18)任一項分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中一價陽離子選自Na+、K+和Li+。
(20)根據(17)到(19)任一項分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將聚陰離子加入試樣中時，該聚陰離子的終濃度對於肝素為10-250U/mL，對於硫酸葡聚糖為0.02-1.25％，對於磷鎢酸為0.02-1.25％。
(21)根據(18)到(20)任一項分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將二價陽離子加入試樣中時，該二價陽離子的終濃度對於Mn2+為2.5-35mmol/L，對於Mg2+為2.5-125mmol/L，對於Ca2+為1-75mmol/L。
(22)根據(19)到(21)任一項分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將一價陽離子加入試樣中時，該一價陽離子的終濃度為0-50mmol/L。
(23)從試樣分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其包括向所述試樣中加入PEG以沉澱不同於小顆粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步驟。
(24)根據(23)的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將PEG加入試樣中時，PEG的終濃度為2-5％。
(25)檢測小顆粒低密度脂蛋白的試劑盒，其含有包括聚陰離子和二價陽離子的分離試劑；和用於檢測低密度脂蛋白的試劑，其中該試劑盒檢測小顆粒低密度脂蛋白中的膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
(26)根據(25)的檢測小顆粒低密度脂蛋白的試劑盒，其中分離試劑還包括一價陽離子。
(27)檢測小顆粒低密度脂蛋白的試劑盒，其含有包括PEG的分離試劑；和用於檢測低密度脂蛋白的試劑，其中該試劑盒檢測小顆粒低密度脂蛋白中的膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
(28)根據(25)或者(26)的試劑盒，其中聚陰離子選自肝素、磷鎢酸和硫酸葡聚糖。
(29)根據(26)或者(28)的試劑盒，其中二價陽離子選自Mn2+、Mg2+和Ca2+並且一價陽離子選自Na+、K+和Li+。
本說明書將日本專利申請號2002-35519的說明書和/或附圖的完整內容併入，日本專利申請號2002-35519是本申請的優先權要求的基礎。
附圖簡述
圖1闡明了本發明的方法的第一步。
圖2闡明了實施例1中本發明的第一步的效果。
圖3闡明了實施例2中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值之間的關係。
圖4闡明了實施例3中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中apoB蛋白質的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中apoB蛋白質的值之間的關係。
圖5闡明了實施例4中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值之間的關係。
圖6闡明了實施例5中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值之間的關係。
圖7闡明了實施例6中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值之間的關係。
圖8闡明了實施例7中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值之間的關係。
圖9闡明了實施例8中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中甘油三酯的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中甘油三酯的值之間的關係。
圖10闡明了實施例9中根據本發明的方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值和通過超速離心方法檢測的小顆粒LDL中膽固醇的值之間的關係。
本發明的最佳實施方式將如下詳細解釋本發明。
本發明的方法包括第一步和第二步。在第一步中，將試樣與含有聚陰離子和二價陽離子的分離液體或者與含有聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的另一種分離液體或者與PEG混合。將混合物反應預定時間後，不同於小密度顆粒的VLDLs和LDLs凝聚並通過離心或者過濾除去。在第二步中，檢測小顆粒LDL中膽固醇、甘油三酯和蛋白質。在第一步中，除去上面提到的脂蛋白後，HDL以及小顆粒LDL保留在溶液中。然而，通過使用針對LDL的LDL膽固醇檢測試劑或者甘油三酯檢測試劑，或者通過應用抗人脫輔基蛋白質B抗體，可以僅對小顆粒LDL組分進行分級檢測。
如上所述，可以將脂蛋白初步分級分離成VLDL、LDL和HDL，並且可以將LDL亞分級成小顆粒LDL和其他亞級分。小顆粒LDL也被稱作SLDL(小LDL)、小緻密LDL或者緻密LDL，不同於小顆粒LDL的LDL有時也被稱作LLDL(大LDL)或者輕LDL。這些級分和亞級分可以基於顆粒大小或者比重區分。顆粒直徑大小對於VLDL為30nm-80nm(30nm-75nm)，對於LDL為22nm-28nm(19nm-30nm)，對於HDL為7nm-10nm，儘管它們可以根據研究人員而變。VLDL的密度低於1.006，LDL的為1.019-1.063，HDL的為1.063-1.21。通過梯度凝膠電泳(GGE)(JAMA，260，1917-21頁，1988)或者NMR(脂蛋白試驗手冊，第二版，Nader Rifai等人編著，609-623頁，AACCPRESSThe Fats of Life Summer 2002，LVDD 15 YEARANNIVERSARY ISSUE，卷AVI號3，15-16頁)可以檢測LDL顆粒的直徑，並且可以基於通過超速離心(Atherosclerosis，106，241-253頁，1994Atherosclerosis，83，59頁，1990)分析確定比重。
本發明中所要檢測的小顆粒LDL通常為LDL級分的亞級分，其直徑為約22.0nm到約25.5nm，其比重為1.040-1.063。為什麼根據顆粒大小將LDL亞分級的原因是LDL中的小LDL需要按級分檢測，因為具有小顆粒直徑的LDL導致更多動脈硬化並且比其他LDL的惡性更高。因為LDL的直徑和比重的分布是連續的，所以不可能確定這樣的比重值，其中在該比重值以上惡性明顯更高。從而，上述1.040-1.063的比重值不是小顆粒LDL的確定特徵，但是它是1.019-1.063的比重範圍的中值點，1.019-1.063被廣泛使用並且確定為LDL的比重。例如，在不同報導中，小顆粒LDL在1.044-1.069的範圍中分級分離(Atherosclerosis106241-2531994)。對於怎樣設定小顆粒LDL的比重範圍在研究人員中存在差異，但是使用任何所選的範圍，都發現小顆粒LDL的存在與臨床惡性有關。
在本發明中，將小顆粒LDL定義為在LDLs中具有低比重並且比其他LDL具有臨床上與動脈硬化更高的關聯的LDL。優選地，小顆粒LDL的比重範圍大於LDLs的比重範圍內的中值點。更優選地，小顆粒LDL是比重在1.040-1.063的LDL。
用於本發明的方法中的試樣為血清或者血漿，優選血清。在第一步中，將適宜體積的樣品與聚陰離子和二價陽離子或者聚陰離子、二.價陽離子和一價陽離子混合，從而陰離子、二價陽離子和一價陽離子的終濃度為預定值。可以在聚陰離子和二價陽離子的存在下將小顆粒LDL與其他LDLs分開，但是通過還存在作為離子強度調節劑的一價陽離子可以實現含有小顆粒LDL和HDL的級分的更好分離。在該步驟中，可以製備含有預定濃度的聚陰離子和二價陽離子的分離溶液，或者含有預定濃度的聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的分離溶液並加入試樣中。還可能單獨製備預定濃度的聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的溶液並將這些溶液單獨加入試樣中。這些單獨的溶液加入試樣中的順序不受限制。用於製備含有聚陰離子和二價陽離子的溶液或者含有聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的溶液的溶劑可以是純化水、生理鹽水和多種緩衝液。分離溶液的pH優選為3-8。
用於第一步中的聚陰離子優選為肝素、磷鎢酸或者硫酸葡聚糖。加入聚陰離子和二價陽離子或者聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子到試樣中後，聚陰離子的優選終濃度對於肝素為10-250U/mL，對於磷鎢酸為0.02-1.25％，對於硫酸葡聚糖為0.02-1.25％。
用於第一步中的二價金屬離子可以是Mn2+、Mg2+、Ca2+，或者Co2+，並且優選為Mn2+、Mg2+、Ca2+。向試樣中加入聚陰離子和二價陽離子後，二價陽離子的優選終濃度為如果用肝素作為聚陰離子，那麼對於Mn2+為7.5-35mmol/L，對於Mg2+為40-125mmol/L，對於Ca2+為50-75mmol/L；如果用磷鎢酸作為聚陰離子，那麼對於Mn2+為2.5-7.5mmol/L，對於Mg2+為2.5-50mmol/L，對於Ca2+為1-30mmol/L；如果用硫酸葡聚糖作為聚陰離子，那麼對於Mn2+為2.5-10mmol/L，對於Mg2+為7.5-30mmol/L，對於Ca2+為5-20mmol/L。
此外，當第一步中使用一價陽離子時，優選使用諸如Na+、K+和Li+的一價金屬離子。一價陽離子的優選終濃度為0-50mmol/L。
例如，將100μl試樣和100μl含有聚陰離子和二價陽離子的分離試劑，或者含有聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的分離試劑混合。可以調節分離試劑中聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的濃度，從而試樣和分離試劑的混合物中聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的濃度為上述終濃度。分離試劑中聚陰離子的濃度優選對於肝素為20-500U/mL，對於磷鎢酸為0.04-2.5％，對於硫酸葡聚糖為0.04-2.5％。分離試劑中二價陽離子的優選終濃度為如果用肝素作為聚陰離子，那麼對於Mn2+為15-70mmol/L，對於Mg2+為80-250mmol/L，對於Ca2+為100-150mmol/L；如果用磷鎢酸作為聚陰離子，那麼對於Mn2+為5-15mmol/L，對於Mg2+為5-100mmol/L，對於Ca2+為2-60mmol/L；如果用硫酸葡聚糖作為聚陰離子，那麼對於Mn2+為5-20mmol/L，對於Mg2+為15-60mmol/L，對於Ca2+為10-40mmol/L。一價陽離子的優選濃度為0-100mmol/L。
向試樣加入聚陰離子和二價陽離子或者聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子後，攪拌反應混合物導致第一步反應。
優選在2℃到45℃，更優選地20℃-37℃實施第一步反應。
優選實施第一步反應1分鐘到30分鐘，更優選5分鐘到15分鐘。
此外，第一步中聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的最適濃度可以根據所用的聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子的類型的聯合而變並且還取決於試樣的pH、離子強度等等。從而，本發明的第一步反應不一定總是產生相同的比重範圍。具體地，不一定得到比重為1.040-1.063的小顆粒LDL。然而，如果用上述濃度實施第一步反應，那麼可以得到幾乎相等的比重範圍的LDL，並且該LDL包括在上面定義的LDL中。此外，上面的描述基於如下想法小顆粒LDL的比重具有1.040-1.063的固定範圍，並且即使本發明的第一步中所得LDL的比重稍微在該範圍外，差異也不大。該級分仍然含有完整LDLs中的相對的小顆粒LDL。從而本發明的第一步中所得小顆粒LDL的量反應了從其得到試樣的患者的動脈硬化的危險性。
通過向試樣中加入聚乙二醇(PEG)代替聚陰離子和二價陽離子或者聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子實施第一步中含有小顆粒LDL和HDL的級分的分離。這裡所用的PEG的分子量優選為4,000-20,000，PEG的終濃度優選為4-10％。
完成第一步反應後，通過離心並收集上清液可以得到含有小顆粒LDL和HDL的級分。離心條件為9,000g-36,000g下1-30分鐘。
完成第一步反應後，通過將反應混合物過濾得到作為穿過級分的含有小顆粒LDL和HDL的級分。濾器可以是壓力過濾型或者離心過濾型。濾器的孔大小為0.10-0.80微米，例如，可以使用通過商業途徑可得到的Milex，Ultrafree(MILLIPORE，Co.)、Ministart(Sartorius，Co.)、DISMIC(ADVANTEC Co.)、HT Tuffryn Acrodisc注射器濾器(PALL Genman Laboratory Co.)等等。
通過檢測含有第一步中所得小顆粒LDL和HDL的級分中LDL，就可以檢測試樣中小顆粒LDL。
通過檢測LDL中膽固醇、LDL中甘油三酯或者LDL中apoB蛋白質可以實施LDL檢測。
對於第二步，已經報導了不需要分級分離步驟的檢測LDL膽固醇的若干方法(日本專利出版物公開號11-318496、2002-202314、10-080300、09-313200、11-155595、日本專利出版物號3256241，等等)，可以優選使用這些方法。
例如，可以根據日本專利出版物公開號11-318496中描繪的方法如下檢測含有小顆粒LDL和HDL的第一步中所得級分中的LDL。所述試樣是第一步中所得含有小顆粒LDL和HDL的級分，將其在表面活性劑的存在下用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶處理，所述表面活性劑作用於不同於LDL的脂蛋白。除去該反應中產生的過氧化氫。這些反應從試樣(步驟A)除去了不同於LDL的脂蛋白，然後可以檢測試樣中的殘留LDL(步驟B)。作用於不同於LDL的脂蛋白的表面活性劑包括HLB值為13或者更高和15或者更低的聚烷撐氧衍生物。例如，包括聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六醚、聚氧乙烯油烯基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等等，它們是HLB值為13或者更高和15或者更低的化合物。用於步驟A中的上面提到的表面活性劑的優選濃度為約0.1-10g/L，更優選約0.5-5.0g/L。除去過氧化氫的方法包括使用過氧化氫酶將過氧化氫分解為水和氧氣的方法，和使用過氧化物酶的方法，通過過氧化物酶，酚或者苯胺氫供體與過氧化氫反應並被轉化成無色苯醌，但是不限於這些方法。
步驟A的反應混合物中膽固醇酯酶的優選濃度為約0.2-1.0U/mL，假單胞菌屬(Pseudomonas)細菌產生的膽固醇酯酶是有效的。膽固醇氧化酶的優選濃度為約0.1-0.7U/mL，優選使用細菌或者酵母產生的膽固醇氧化酶。此外，過氧化氫酶的優選濃度為約40-100U/mL。此外，過氧化物酶當其用於將過氧化氫轉化成無色苯醌時的優選濃度為0.4-1.0U/mL，酚或者苯胺氫供體的優選濃度為0.4-0.8mmol/L。在步驟B中，檢測試樣中殘留膽固醇。例如，通過加入至少作用於LDL的表面活性劑並檢測膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的作用產生的過氧化氫實施測定法。作用於LDL的表面活性劑包括HLB值為11或者更高和13或者更低的聚烷撐氧衍生物。例如，包括聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯十六醚、聚氧乙烯油烯基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等等，它們是HLB值為11或者更高和13或者更低的化合物。步驟B的優選反應條件類似於步驟A的優選條件。
用於檢測LDL的試劑盒是通過商業途徑可得到的，並且可以使用這些商業試劑盒檢測LDL。例如，可以使用通過商業途徑可得到的LDL-EX(N)(DENKA SEIKEN Co.)。
對於第二步，可以用若干種方法檢測LDL中的甘油三酯，這些方法不需要分級分離(WO公布號00/43537)，並且可以適宜地使用這些方法。
對於第二步，可以用若干種方法應用抗人apoB抗體(日本專利公布號2638137、日本專利公開號02-64458等)，並且可以適宜地使用這些方法。
本發明包括含有用於第一步(其中分離含有小顆粒LDL的級分)的試劑和用於檢測經分離的小顆粒LDL的試劑的試劑盒。該試劑盒可以含有例如，用於檢測LDL的上面提到的試劑試劑盒和聚陰離子和二價陽離子(或者含有聚陰離子和二價陽離子的分離試劑)等等。此外，該試劑盒可以含有離心管和小顆粒LDL的分離濾器。該試劑盒除了聚陰離子和二價陽離子之外可以還含有一價陽離子。在該情況中，該試劑盒可以含有分離試劑，其包括聚陰離子、二價陽離子和一價陽離子。此外，該試劑盒可以含有聚乙二醇，其代替聚陰離子和二價陽離子。
將基於下面的實施方案具體解釋本發明。然而，本發明不限於下面描述的實施方案。
實施例1對已經通過電泳證實主要含有小顆粒LDL的樣品和富含不同於小顆粒LDL的LDLs的其他樣品研究第一步的效率。將50μl血清與50μl含有60U/mL肝素溶液和40mmol/L MnCl2的分離溶液混合，並允許反應在25℃持續15分鐘。然後以18,500g離心混合物15分鐘，回收上清液，並使用通過商業途徑可得到的圓盤型聚丙烯醯胺凝膠黃色素細胞比較反應性。將分離溶液和反應前血清用等體積生理鹽水稀釋後電泳。圖1顯示了本發明的步驟1中的方法，圖2顯示結果。圖2表明僅正常的LDL被選擇性除去。在圖2中，1號泳道闡明了反應前富含不同於小顆粒LDL的LDL的樣品的電泳結果；2號泳道闡明反應前富含小顆粒LDL的樣品的電泳結果；3號泳道闡明了反應後富含不同於小顆粒LDL的LDL的樣品的電泳結果；4號泳道闡明反應後富含小顆粒LDL的樣品的電泳結果。
實施例2根據本發明的方法檢測血清樣品中小顆粒LDL並將檢測值與通過超速離心方法所得值比較。結果在圖3中顯示。
將100μl試樣與100μl含有300U/mL肝素鈉和150mmol/L MgCl2的分離溶液混合併允許在37℃反應10分鐘。反應後，以18,500g離心混合物15分鐘，回收上清液並通過商業試劑盒LDL-EX(N)(DENKASEIKEN Co)使用Autoanalyzer(Hitachi 7170)分析小顆粒LDL中的膽固醇。在超速離心方法中，離心受試血清和密度溶液的混合物以回收密度為1.040-1.063的級分。檢測回收的級分中的膽固醇得到小顆粒LDL中的膽固醇值。如圖3中所示，本發明的結果表明與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例3將100μl血清試樣與100μl含有平均分子量為5000的1.5％硫酸葡聚糖和40mmol/L MgCl2的分離溶液混合併允許在25℃反應10分鐘。反應後，以18,500g離心混合物15分鐘，回收上清液並通過濁度免疫測定法(Daiichi Pure Chemicals Co.，ApoB aouto N(Daiichi))使用抗人aopB抗體檢測小顆粒LDL中apoB的量。在超速離心方法中，離心受試血清和密度溶液的混合物以回收密度為1.040-1.063的級分。檢測apoB得到小顆粒LDL中的apoB值。結果在圖4中顯示。如圖4中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例4使用相似試劑根據實施例2實施所有操作，只是用0.3％磷鎢酸鈉和7.5mmol/L CaCl2代替分離溶液並將根據本發明的檢測值與通過超速離心方法所得結果相比較。結果在圖5中顯示。如圖5中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例5使用相似試劑根據實施例2實施所有操作，只是用40U/ml肝素鈉和30mmol/L MnCl2代替分離溶液並將根據本發明的檢測值與通過超速離心方法所得結果相比較。結果在圖6中顯示。如圖6中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例6使用相似試劑根據實施例2實施所有操作，只是用500U/ml肝素鈉和140mmol/L MgCl2和34mmol/L KCl代替分離溶液並將根據本發明的檢測值與通過超速離心方法所得結果相比較。結果在圖7中顯示。如圖7中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例7使用相似試劑根據實施例2實施所有操作，只是用8％PEG(分子量6,000)代替分離溶液並將根據本發明的檢測值與通過超速離心方法所得結果相比較。結果在圖8中顯示。如圖8中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例8將100μl血清試樣與100μl含有150U/mL肝素鈉和90mmol/LMgCl2的分離溶液混合併允許在37℃反應10分鐘。反應後，以18,500g離心混合物15分鐘，回收上清液並使用用於檢測LDL中甘油三酯的量的試劑檢測小顆粒LDL中甘油三酯的量。在超速離心方法中，離心受試血清和密度溶液的混合物以回收密度為1.040-1.063的級分。檢測回收的級分中的甘油三酯得到小顆粒LDL中的甘油三酯值。結果在圖9中顯示，如圖9中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
實施例9將100μl血清試樣與100μl含有150U/mL肝素鈉和90mmol/LMgCl2的分離溶液混合併允許在37℃反應10分鐘。反應後，使用離心濾器(Ultrafree-MC(0.1μm過濾單位)MILLIPORE Co.)以10,000g離心混合物1分鐘。回收濾液後，檢測小顆粒LDL中膽固醇並與通過超速離心方法所得的膽固醇檢測值比較。結果在圖10中顯示，如圖10中所示，如實施例2一樣，本發明的結果表明了與超速離心方法的結果的良好相關性。
本說明書將該說明書中所引用的所有出版物、專利和專利申請完整併入作為參考。
工業應用性根據本發明，使用簡單方法可以將小顆粒LDL與其他LDLs分離，並且可以分級檢測小顆粒LDL中的膽固醇、甘油三酯或者apoB。因此，本發明對於臨床應用非常有用。
權利要求
1.定量試樣中小顆粒低密度脂蛋白的方法，該方法包括第一步將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離，和第二步檢測所分離的小顆粒低密度脂蛋白中膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
2.根據權利要求1的方法，其中在所述第一步中用聚陰離子和二價陽離子將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離。
3.根據權利要求1或者2的方法，其中在所述第一步中還用一價陽離子將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離。
4.根據權利要求2或者3的方法，其中用於所述第一步的聚陰離子選自肝素、磷鎢酸和硫酸葡聚糖。
5.根據權利要求2到4任一項的方法，其中用於所述第一步的二價陽離子選自Mn2+、Mg2+和Ca2+。
6.根據權利要求3到5任一項的方法，其中用於所述第一步的一價陽離子選自Na+、K+和Li+。
7.根據權利要求4到6任一項的方法，其中當將聚陰離子加入試樣中時，該聚陰離子的終濃度對於肝素為10-250U/mL，對於硫酸葡聚糖為0.02-1.25％，對於磷鎢酸為0.02-1.25％。
8.根據權利要求5到7任一項的方法，其中當將二價陽離子加入試樣中時，該二價陽離子的終濃度對於Mn2+為2.5-35mmol/L，對於Mg2+為2.5-125mmol/L，對於Ca2+為1-75mmol/L。
9.根據權利要求6到8任一項的方法，其中當將一價陽離子加入試樣中時，該一價陽離子的終濃度為0-50mmol/L。
10.根據權利要求1的方法，其中在所述第一步中用PEG將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離。
11.根據權利要求10的方法，其中當將PEG加入試樣中時，PEG的終濃度為2-5％。
12.根據權利要求1到11任一項的方法，其中通過使用用於定量檢測低密度脂蛋白中的膽固醇並且不需要分級分離的試劑實施所述第二步中膽固醇的檢測。
13.根據權利要求1到11任一項的方法，其中使用用於定量檢測低密度脂蛋白中的甘油三酯並且不需要分級分離的試劑實施所述第二步中甘油三酯的檢測。
14.根據權利要求1到11任一項的方法，其中通過使用抗人脫輔基蛋白質B抗體實施所述第二步中蛋白質的檢測。
15.從試樣分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，該方法包括通過向所述試樣中加入聚陰離子和二價陽離子沉澱不同於小顆粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步驟。
16.根據權利要求15的方法，其包括還通過向所述試樣中加入一價陽離子沉澱不同於小顆粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步驟。
17.根據權利要求15或16的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中聚陰離子選自肝素、磷鎢酸和硫酸葡聚糖。
18.根據權利要求15到17任一項的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中二價陽離子選自Mn2+、Mg2+和Ca2+。
19.根據權利要求15到18任一項的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中一價陽離子選自Na+、K+和Li+。
20.根據權利要求17到19任一項的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將聚陰離子加入試樣中時，該聚陰離子的終濃度對於肝素為10-250U/mL，對於硫酸葡聚糖為0.02-1.25％，對於磷鎢酸為0.02-1.25％。
21.根據權利要求18到20任一項的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將二價陽離子加入試樣中時，該二價陽離子的終濃度對於Mn2+為2.5-35mmol/L，對於Mg2+為2.5-125mmol/L，對於Ca2+為1-75mmol/L。
22.根據權利要求19到21任一項的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將一價陽離子加入試樣中時，該一價陽離子的終濃度為0-50mmol/L。
23.從試樣分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其包括向所述試樣中加入PEG以沉澱不同於小顆粒低密度脂蛋白的低密度脂蛋白的步驟。
24.根據權利要求23的分離小顆粒低密度脂蛋白的方法，其中當將PEG加入試樣中時，PEG的終濃度為2-5％。
25.檢測小顆粒低密度脂蛋白的試劑盒，其含有包括聚陰離子和二價陽離子的分離試劑；和用於檢測低密度脂蛋白的試劑，其中該試劑盒檢測小顆粒低密度脂蛋白中的膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
26.根據權利要求25的檢測小顆粒低密度脂蛋白的試劑盒，其中分離試劑還包括一價陽離子。
27.檢測小顆粒低密度脂蛋白的試劑盒，其含有包括PEG的分離試劑；和用於檢測低密度脂蛋白的試劑，其中該試劑盒檢測小顆粒低密度脂蛋白中的膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
28.根據權利要求25或者26的試劑盒，其中聚陰離子選自肝素、磷鎢酸和硫酸葡聚糖。
29.根據權利要求26或者28的試劑盒，其中二價陽離子選自Mn2+、Mg2+和Ca2+並且一價陽離子選自Na+、K+和Li+。
全文摘要
本發明的目的是提供用於小顆粒LDL的分級檢測的快速而簡單的方法。定量試樣中小顆粒低密度脂蛋白的方法，該方法包括第一步將小顆粒低密度脂蛋白與其他低密度脂蛋白分離，和第二步檢測所分離的小顆粒低密度脂蛋白中膽固醇、甘油三酯或者蛋白質。
文檔編號G01N33/92GK1745303SQ20038010955
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月5日 優先權日2002年12月6日
發明者伊藤康樹, 平野勉 申請人:電化生研株式會社