一種與抗病性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-01 17:55:41 2

專利名稱：一種與抗病性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種與抗病性相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
在自然界中，植物在生長過程中經常處在生物逆境和非生物逆境這兩種不良的外在環境中，前者包含真菌，細菌，植物菌質，病毒，擬病毒等微生物或線蟲，昆蟲的侵襲，後者像是寒害，鹽害，光害等逆境。平均而言，每一種農作物都會被上百種或更多的病原菌 (pathogens)所感染，所以各種植物都有其特殊的病害問題。不同的植物病原菌可利用不同的分子機制去感染植物並引發病害，而相對地植物在面臨這些生物性逆境時，會啟動防禦機制以保護自身免於遭受病原菌的感染。植物的抗病反應是多基因控制的複雜調控過程。參與植物抗病反應的基因可以分為兩類(1)抗病(主效)基因，又成為R(Resistance)基因和( 抗病相關基因。根據目前人們對植物抗病反應的認識，認為植物與病原菌相互作用是由來自於植物的抗病 R(resistance)基因與相應的來自於病原菌的無毒avr (avirulence)基因相互作用所決定的。經過十多年的研究，人們已經從不同的植物中選殖了多種抗病基因。這些抗病基因編碼的蛋白質產物一般具有亮氨酸富集重複序列域(leucine rich r印eats，簡稱LRR)，絲胺酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,簡稱STK)，核苷酸結合位點(nucleotide binding site，簡稱NBS)，亮氨酸拉鏈(leucine zippers，簡稱LZs)和介白素_1受體類似結構(Toll/interleukin-1 receptor simility，簡稱TIR)等一種或多種保守結構，在植物抗病中可能介導抗病訊息的識別、產生和傳遞過程。植物抗病相關基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應的基因，它們的編碼產物參與合成植物體內抗病信號分子、參與信號傳導、阻止信號傳導或參與防禦反應等。這類基因的共同特點是植物受病原誘導後其表達水平明顯升高或降低。經過近十多年的研究，人們通過大規模篩選抗病或感病突變體以及根據植物受病原感染前後基因表達水平的改變等方法已經篩選得到了很多植物抗病相關基因。但人們對所篩選得到的這些植物抗病相關基因的作用機制認識還有限。目前人們得到的一個普遍認識就是這些抗病相關基因單獨作用時其抗病能力低於植物抗性基因的作用。 但由於在植物體內大多數抗病相關基因參與的抗病基因沒有抗原特異性，因此這些基因是具有廣譜抗性的基因資源。所以，開發並研究這些與植物抗病相關基因的生物功能在植物育種過程中具有重要應用價值。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國重要的糧食作物，常年播種面積和總產量均佔糧食作物的首位。病蟲害是造成水稻減產和品質降低的主要因素之一，開發並研究新的水稻抗病相關基因對提高植物對病蟲害的抗性，有利於利用高效途徑培育新型水稻品種，控制病害發生，改善和提高植物的產量和品質。水稻的稻瘟病和白葉枯病是水稻的兩大主要病害。稻瘟病是主要的真菌病害，嚴重影響了水稻產量、品質等性狀。由於稻瘟病菌有很強的環境適應能力，使稻瘟病在全球各個水稻種植區內廣泛發生。白葉枯病是主要的細菌病害，該病一旦發生，將對水稻生產造成嚴重影響。一般減產10% 20%，重病田可減產50%以上，甚至絕收。近10年來對水稻的稻瘟病和白葉枯病的抗病基因的研究已取得了不少成果。但由於單個抗病基因所介導的抗病性具有高度專化性，只能抗有限的小種，抗病譜比較窄，以致病原菌群體發生變化時，就面臨抗性喪失的風險。因此，利用現代的基因突變技術，構建新的突變體庫，篩選新型的與植物抗病相關的基因具有重要的理論意義與應用價值。葉片衰老(leaf senescence)是植物葉片生長發育的最後階段，它的顯著特徵是葉綠素減少、細胞內成分降解，但這並不代表生命的完結，因為這些降解的成分作為營養物質被轉移到生殖器官種子中，因此，葉片衰老也是一個主動的細胞程序性死亡過程 (Programmed cell death)。葉片衰老是植物發育過程中不可或缺的一個發育時期，是植物發育的最後階段。因此，葉片衰老發生的時間受植物發育年齡的調節。然而，衰老過程包括衰老的速度和分子特徵等會受到外部環境因素和內部激素水平的影響。影響植物葉片衰老的環境因素包括逆境、乾旱、營養缺乏和病原菌侵染等。通過比較植物在逆境反應和葉片衰老過程中的基因表達模式，發現這兩個生物過程存在著相當的交叉反應。例如，在植物衰老過程中受誘導的43個轉錄因子中有觀個基因的表達也受逆境誘導。但到目前為止，我們還不是很清楚環境因素誘導葉片衰老的詳細機制。一個廣泛的認識是激素信號途徑介導或影響了環境因素對植物發育的調節過程。在植物葉片衰老過程中，有多種激素信號傳導途徑參與了調節過程。其中，細胞分裂素被認為是調節植物衰老的最重要的激素之一。研究表明，外源施加細胞分裂素可以有效地延緩葉片的衰老；通過衰老特異表達基因SAG12的啟動子驅動細胞分裂素合成過程中的關鍵基因-異戊烯基轉移酶(IPT)基因的表達，提高內源提高細胞分裂素的水平也可以顯著地延緩轉基因植物的衰老過程。儘管細胞分裂素在延緩葉片衰老過程中有顯著效果，但其調節葉片衰老的詳細機制目前還不是很清楚。近期的研究表明，擬南芥中細胞分裂素的受體之一組氨酸激酶3(HiStidine Kinase 3，AHK3)在細胞分裂素介導的葉片壽命的調節過程中具有重要作用。通過分析AHK3基因的功能獲得型突變體orel 2-1，發現orel 2_1突變體具有明顯晚衰的表型。該研究的結果還證明了 AHK3的下遊組分Arabidopsis response regulator 2 (ARR2)的磷酸化在AHK3調控的葉片衰老過程中具有非常重要的作用。磷酸化的ARR2是如何進一步調控了衰老相關基因的表達，目前還不是很清楚。葉片衰老是一個細胞結構及細胞內部生理、生化和基因表達都發生有序改變的過程，該過程除了受環境因素和各種激素信號傳導途徑的影響外，在很大程度上是受特異基因嚴格控制的。1989年，Davies等首先報導了與葉片衰老相關基因。2003年，G印stein 等利用mRNA差異顯示技術，篩選到800多個衰老過程中上調的基因，被稱為衰老相關基因(SAGs :senescence-associated genes)，其中有70多個基因以前沒有報導過，這說明了葉片衰老過程涉及新的蛋白的合成。與SAG相反，在衰老期間，某些基因則在衰老開始後，表達量明顯下調，因此這些基因被稱之為衰老下調基因(Senescence Down-regulated Genes，SDk)，例如與光合作用有關的基因。儘管研究發現了調節葉片衰老的基因，但調控葉片衰老的機理還不是很清楚，仍然有很多問題。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種蛋白及其編碼基因。
本發明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白質a)、由SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)、將SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具相同功能的由a)衍生的蛋白質。所述編碼基因為如下1)或2)或3)或4)或5)或6)所示1) SEQ ID NO 3 所示 DNA 分子；2) SEQ ID NO 3中第33-1994位核苷酸所示DNA分子；3) SEQ ID NO 1 所示 DNA 分子；4) SEQ ID NO :1中第2360-6020位核苷酸所示DNA分子；5)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。擴增上述任一所述基因全長或其任意片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。所述引物對如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、重組病毒、轉基因細胞系或表達盒也屬於本發明的保護範圍。本發明的另一個目的是提供一種改變植物抗病性的方法。本發明所提供的改變植物抗病性的方法，是向出發植物中導入上述任一所述編碼基因，得到抗病性高於所述出發植物的轉基因植物。上述改變植物抗病性的方法中，所述抗病性為抗稻瘟病。上述改變植物抗病性的方法中，所述稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) ZB15 或稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) Z8-10-14 引起的；上述改變植物抗病性的方法中，；所述出發植物為單子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發明最後一個目的是提供一種改變植物抗衰老性能的方法。本發明所提供的改變植物抗衰老性能的方法，是向出發植物中導入上述任一所述編碼基因，得到抗衰老性能低於所述出發植物的轉基因植物。上述改變植物抗衰老性能的方法中，所述出發植物為單子葉植物；所述單子葉植物為水稻。實驗證明，本發明的基因具有增強植物的抗病性和降低植物的抗衰老性的功能。 本發明基因在植物的遺傳育種領域具有廣闊的應用前景。


圖1為easl突變體的篩選及其表型分析。圖2為OsEASl基因的圖位克隆。OsEASl定位於第3號染色體上，位於標記RM81 和RM489之間。圖3為easl突變體的互補實驗。圖4為easl突變體的抗稻瘟病實驗。圖5為easl突變體的抗白葉枯實驗。
圖6為easl突變體葉片的暗誘導試驗。圖7為轉基因水稻抗稻瘟病結果。圖8為轉基因水稻抗衰老檢測結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、基因的發現所用弓丨物及探針均由北京奧科生物公司合成。一、easl突變體的篩選及其表型分析。(一 )利用EMS誘變粳稻背景的日本晴水稻種子，通過2代自交繁殖得到M2的穩定遺傳材料。田間觀察在苗期即表現出提前衰老的水稻為候選材料。根據調查結果，發現 easl在自然生長條件下，葉片表現出明顯的早衰表型，具體表現為突變體植株後期表現為葉尖枯死，葉片出現褐色斑點等早衰的表型(圖1A)。同時，easl突變體表現出天然免疫喪失的特徵，葉片呈現假病斑(圖1B)，育性下降，分櫱減少的表型，嚴重時甚至在苗期時easl 即致死。通過和秈稻背景水稻93-11的雜交及和日本晴回交的遺傳實驗，確定easl的表型受單基因控制，表現為隱性突變。圖1中，A圖為在自然條件下生長35天的水稻，圖片中左邊植物為野生型水稻，右邊植物為easl突變體；B圖為A圖中水稻的葉片，左邊為野生型水稻葉片，右邊為easl突變體葉片。二、OsEASl基因的圖位克隆通過實驗一中構建的定位群體，F2得到58株有表型的材料。利用現有的水稻資料庫(GRAMENE，TIGR, NCBI)挑選分子標記用於OsEASl的初定位，總共選用了 184個分布在水稻12條染色體上的SSR標記，將OsEASl定位於第3號染色體上，位於標記RM81和 RM489之間，分別有8個和4個交換株。進一步發展F3精細定位群體，得到680株有表型的材料。在R1K46和R1C82之間設計新的SSR標記，將OsEASl定位在標記EAS1-4和EAS1-6 之間，分別有3個和11個交換株，這兩個標記的物理距離為99739bp，包含有10個0RF，其中0s03g05310為候選基因(圖幻。經過3次生物重複的測序實驗，發現0s03g05310中的第1139位核苷酸由胞嘧啶(C)突變為胸腺嘧啶(T)，從而導致第380位的蘇氨酸(T)突變為異亮氨酸(I)。RM81F GAGTGCTTGTGCAAGATCCARM81R CTTCTTCACTCATGCAGTTCRM489F :ACTTGAGACGATCGGACACCRM489R TCACCCATGGATGTTGTCAGEAS1-4F CTTGACATCATTGCCTCTGAAEAS1-4R GAAAATGTTGCTTTACCCTGGEAS1-6F GGTATTCTAGCTGGTTGCAGTEAS1-6R CAGTACAGTACCCCATCCATT圖2為OsEASl基因的圖位克隆。OsEASl定位於第3號染色體上，位於標記RM81和RM489之間。在R1K46和RM282之間設計新的SSR標記，將OsEASl定位在標記EAS1-4 和EAS1-6之間，分別有3個和11個交換株，這兩個標記的物理距離為99739bp，包含有10 個0RF，其中0s03g05310為候選基因。測序實驗發現0s03g05310中的第1853(從ATG開始數)位核苷酸由胞嘧啶(C)突變為胸腺嘧啶(T)，從而導致第380位的蘇氨酸(T)突變為異亮氨酸(I)。三、easl突變體的抗病實驗在水稻抽穗一周後，通過針管注射的方法從水稻莖基部分別接菌稻瘟病菌觀15 和Z8-10-14，每個單株接菌3個分櫱以上，每個病菌接菌10個單株以上，接菌一周後觀察野生型和突變體easl的感病情況，結果顯示easl對稻瘟病表現出更高的敏感性(圖4)。圖 4為easl突變體的抗稻瘟病實驗。在水稻抽穗一周後，通過針管注射的方法從水稻莖基部分別接菌稻瘟病菌觀15和Z8-10-14，每個單株接菌3個分櫱以上，每個病菌接菌10個單株以上，接菌一周後觀察野生型和突變體easl的感病情況，結果顯示easl對稻瘟病表現出更高的敏感性。圖中左邊三個葉片為野生型，分別是用水做的負對照，野生型植物接稻瘟病菌 ZB15和Z8-10-14 ；右邊三個葉片為easl突變體，分別是用水做的負對照，野生型植物接稻癌病菌 ZB15 和 Z8-10-14。通過傷口侵染法接菌白葉枯病菌，用沾有白葉枯病菌P6的剪刀裁剪掉水稻葉尖 (5-10釐米)，每個單株全部接菌，接菌10個以上單株，一周後觀察野生型和突變體easl的感病情況，結果顯示easl對白葉枯病表現出更高的敏感性(圖幻。圖5為easl突變體的抗白葉枯實驗。通過傷口侵染法接菌白葉枯病菌，用沾有白葉枯病菌P6的剪刀裁剪掉水稻葉尖(5-10釐米)，每個單株全部接菌，接菌10個以上單株，一周後觀察野生型和突變體 easl的感病情況，結果顯示easl對白葉枯病表現出更高的敏感性。左邊圖片為接菌一周後野生型和突變體easl的感病情況，右邊柱狀圖為菌落生長的統計。easl突變體的黑暗誘導試驗在1/2MS的方皿培養基上播種WT和easl，於28度溫室16小時光照培養1周，取第3-4片葉做黑暗誘導試驗。截取相同長度(5釐米)的葉片置於加有MES緩衝溶液的8 孔培養皿中，用錫箔紙完全包裹達到黑暗的條件，然後置於觀度溫室中暗誘導0天，3天和 5天，3次以上的生物重複，然後分別測量0天，3天和5天時的葉片葉綠素含量，結果表明 easl與WT相比，表現出明顯的晚衰表型(圖6)。圖6為easl突變體葉片的暗誘導試驗。 在1/2MS的方皿培養基上播種WT和easl，於28度溫室16小時光照培養1周，取第3_4片葉做黑暗誘導試驗。截取相同長度(5釐米)的葉片置於加有MES緩衝溶液的8孔培養皿中，用錫箔紙完全包裹達到黑暗的條件，然後置於觀度溫室中暗誘導0天，3天和5天，3次以上的生物重複，然後分別測量0天，3天和5天時的葉片葉綠素含量，結果表明easl與WT 相比，表現出明顯的晚衰表型。左邊為在暗誘導0天，3天和5天的野生型和突變體葉片，右邊為0天，3天和5天時的葉片葉綠素含量測定結果。實施例2、基因OsEASl的功能一、功能互補實驗(一)基因的製備OsEAS 1所在的BAC克隆AC090485 (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/14495364)由中國科學院國
7家基因研究中心提供，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得該BAC克隆。載體pBluescript SK購自默克公司上海辦事處，產品目錄號為ST212205。利用質粒大量提取的方法，得到BAC質粒0SJNBa0067N01(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/14495364 ？ ), ^ B ffl SpeI、EcoRV 兩種限制性內切酶(NEB)進行酶切，在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，用購自鼎國公司的DNA回收試劑盒回收長度約6366bp的目的片段並對其進行純化，將回收片段連接到經Spel、EcoRV酶切的載體pBluescript SK中，再將連接產物用熱激法轉化大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，將其接種於含50mg/L氨苄青黴素的5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養12-16小時，提質粒，並測序驗證，結果在載體 pBluescript SK的SpeI、EcoRV酶切位點間插入的基因序列如SEQ ID NO :1所示，表明構建的質粒正確，將構建正確的重組質粒命名為SK-OsEASlg。將SEQ ID NO :1所示的基因命名為OsEASl，該基因編碼的蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO :2所示，將該蛋白命名為OsEASl。 SEQ ID NO 1 中，ATG 位於 2360 位，TAA 位於 6020 位。( 二 )野生型基因的功能互補驗證取質粒SK-OsEASlg，用限制性內切酶SpeI和EcoRV酶切(購於NEB中國分公司) 得到基因插入片段，用膠回收試劑盒(購自鼎國公司)回收OsEASl基因片段，純化後的片段用iM連接酶(Roche公司)與經過SpeI和EcoRV酶切的pCAMBIAl300 (Cambia)連接，連接產物熱激法轉化大腸桿菌(E. coli)DH5a菌株，抗性個篩選，挑選陽性菌落加入到5ml含 50mg/L卡那黴素的LB液體培養基中，37°C、200rpm培養12-16小時，提取質粒，進行PCR鑑定和酶切鑑定。結果構建的重組質粒正確，記作重組表達載體pl300-0sEASlg。將重組表達載體pl300-0sEASlg電激轉入農桿菌EHA105 (Cambia)，挑選陽性克隆於^°C、200rpm培養12-16小時，利用該菌液進行水稻愈傷侵染實驗(用於侵染的水稻愈傷為實施例1中所述突變體easl的愈傷組織)，侵染後的愈傷置於含有50mg/L潮黴素培養基篩選，得到候選愈傷後轉入到分化培養基，由分化培養基生長所得愈傷置於生根培養基生長，最終得到陽性轉基因Tl代水稻材料(由此侵染愈傷得到的苗是Tl代)。Tl代水稻材料的驗證在OsEASl基因上設計了一條正向引物(位於 2548bp,序列為 5，TCTGCAAGGGCAAGAGAAG3，)，與 pCAMBIA1300 載體上的反向引物 (5 『ATCGGTGCGGGCCTCTTC3』 )進行PCR擴增，能擴增出大小為1. 5kb的特異DNA條帶即為陽性轉基因水稻。結果表明，共獲得了 5個獨立的陽性轉基因株系。將Tl代水稻進行田間種植，自然條件下生長35天後，觀察水稻在田間的生長情況。發現Tl代轉基因水稻的生長與野生性類似，互補了 easl突變體葉片早衰與天然免疫能力喪失的表型(圖3，WT表示野生型植株，easl表示突變體，Comp表示互補植株)。二、野生型基因過表達實驗稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) ZB15和Z8-10-14在文獻《安徽稻區稻瘟病菌生理小種的鑑定》(陳莉，蘇賢巖，丁克堅，《中國農學通報》2007年第23卷第04期)中公開過，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。用TRIZAL試劑(購自hvitrogen公司)並參照試劑盒說明書提取日本晴葉片的總 RNA,然後用 Invitrogen 公司的 SuperScript II Reverse Transcriptase 試劑盒並參照試劑盒說明書反轉錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物0sEASlF(5，AAGCTCCACCACACGACACCCCGCAAAA3，)(SEQ ID NO 4)和 0sEASlR(5，ATCAATCTCAGCATGCACG TAATC3') (SEQ ID NO 5)的引導下進行PCR擴增，反應結束後，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，用購自鼎國公司的DNA回收試劑盒回收長度約1994bp的目的片段並對其進行純化，回收目的片段；用酶EcoRV酶切載體pBluescript SK，將酶切後的載體與回收目的片段連接，再將連接產物用熱激法轉化大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，將其接種於含50mg/L氨苄青黴素的5mL LB液體培養基中，在37°C、200rpm下培養 12-16小時，提質粒，得到含有回收片段的重組質粒，命名為vector-EASl，對其進行測序， 測序結果表明插入pBluescript SK的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。含有35S (caul if lower mosaic virus)啟動子的 pCAMBIA1300 的構建將 35S(cauliflowermosaic virus)啟動子(該啟動子的核苷酸序列如Genbank號EF042581 中第47332-48139位核苷酸所示)插入pCAMBIA1300 (澳大利亞Cambia研究所)的EcoRI 和 KpnI 位點間，得到含有;35S (cauliflower mosaic virus)啟動子的 pCAMBIA1300，記作 PCAMBIA1300-35S。提取質粒vector-EASl，用限制性內切酶ApaI和)(baI酶切(購於NEB中國分公司)，得到OsEASl基因插入片段，用膠回收試劑盒(購自鼎國公司)回收OsEASl基因片段， 純化後的片段用jM連接酶(Roche公司)與經過ApaI和)(bal酶切的pCAMBIA1300_35S 連接，連接產物熱激法轉化大腸桿菌(E.C0li)DH5a菌株，抗性篩選，挑選陽性菌落加入到5ml含50mg/L卡那黴素的LB液體培養基中，37 °C、200rpm培養12-16小時，提取質粒，進行PCR鑑定和酶切鑑定，PCR鑑定所用的引物為pCAMBIA1300載體上的引物 (5『ATCGGTGCGGGCCTCTTC)和 OsEASl 上的引物(5，TCTGCAAGGGCAAGAGAAG)。PCR 鑑定的結果得到與預計目的大小(928bp) —致的DNA帶；酶切鑑定的結果，利用I^stI酶切得到與預計目的大小(489bp) —致的DNA帶，利用HindIII酶切得到與預計目的大小Q3i;3bp) —致的 DNA帶，說明該構建的重組質粒正確。進一步進行測序驗證，結果在載體PCAMBIA1300-35S 的ApaI和^CbaI酶切位點間插入了 SEQ ID NO 3所示基因(即cDNA)，表明構建的重組質粒正確，記作重組表達載體pCAMBIA1300-;35S-0sEASl。轉化將重組表達載體pCAMBIA1300-35S-0sEASl電激轉入農桿菌EHA105 (澳大利亞Cambia研究所)，挑選陽性克隆於、200rpm培養12-16小時，利用該菌液進行水稻愈傷侵染實驗(用於侵染的水稻為野生型水稻日本晴的愈傷組織)，侵染後的愈傷置於含有50mg/L潮黴素培養基篩選，得到候選愈傷後轉入到分化培養基，由分化培養基生長所得愈傷置於生根培養基生長，最終得到陽性轉基因Tl代水稻材料。Tl代水稻材料的驗證在OsEASl基因上設計了一條正向引物(序列為 5，TCTGCAAGGGCAAGAGAAG3，)，與 pCAMBIA1300 載體上的引物(5 『ATCGGTGCGGGCCTCTTC3，) 進行PCR擴增，能擴增出大小為928bp的特異DNA條帶即為陽性轉基因水稻。結果表明，共獲得了三個獨立的陽性轉基因株系。在轉基因領域，如果獲得3株獨立的株系且各功能相同，則能充分證明是轉入的外源目的基因在宿主中起作用，而不是基因隨著載體上的某些部件在起作用。同時以未經任何處理的野生型水稻作為對照。表型分析T1代轉基因水稻與野生型水稻和突變體材料easl在相同的條件下進行田間栽培，結果Tl代轉基因水稻的生長情況與野生型類似，株高與分櫱數也與野生型水稻類似，轉基因水稻的葉片與野生型水稻葉片一樣沒有表現出明顯的天然免疫能力喪失的表型(天然免疫能力沒喪失的判斷標準水稻葉片是綠色無病斑的；天然免疫能力喪失的判斷標準水稻葉片出現類似病斑的壞死)，三個獨立的陽性轉基因株系的表型無顯著差異。抗病性檢測稻瘟病在水稻抽穗一周後，通過針管注射的方法從水稻莖基部分別接菌稻瘟病菌觀15和稻瘟病菌Z8-10-14，每個單株接菌3個分櫱，每種病菌接菌10個單株，接菌一周後觀察水稻的感病情況。結果突變體easl葉片中病斑面積最大，野生型水稻葉片中病斑面積較大且明顯小於突變體，轉基因水稻葉片中病斑面積最小且明顯小於野生型。說明轉基因水稻表現出較高的抗性，野生型水稻對稻瘟病表現敏感(圖7)。三個獨立的陽性轉基因株系的表型無顯著差異。抗衰老性能檢測方法在水稻抽穗一周後，分別選取WT，easl和 pCAMBIA1300-35S-0sEASl轉基因水稻的旗葉做黑暗誘導試驗。截取相同長度(5釐米)的葉片置於加有MES緩衝溶液的8孔培養皿中，用錫箔紙完全包裹達到黑暗的條件，然後置於 28度溫室中暗誘導0天，3天和5天，3次以上的生物重複，然後分別測量0天，3天和5天時的葉片葉綠素含量。葉綠素的含量多少代表葉片發生衰老的過程，當葉片衰老變黃時葉綠素含量是顯著下降的，其組成成分葉綠素a和葉綠素b都會有顯著的下降。葉綠素含量的檢測方法最經典及常用的丙酮法。1.取新鮮植物葉片，擦淨組織表面汙物，剪碎，混勻。2.稱取剪碎的新鮮樣品0. 2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2 :3ml 80%丙酮，研成均漿。冰上靜置30min。3. 13000rpm 離心 10 分鐘。4.把上清中的葉綠體色素提取液倒入光徑Icm的比色杯內。以80%丙酮為空白， 在波長665nm、649nm下測定吸光度。實驗結果計算將測定得到的吸光值代入下面的式子Ca = 13. 95A665-6. 88A649 ；Cb = 24. 96A649-7. 32A665。據此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度(Ca、Cb :mg/L)，二者之和為總葉綠素的濃度。總葉綠素含量的檢測結果為(圖8，1表示野生型，2表示突變體，3表示轉基因水稻)暗誘導0天時，各種植株葉綠素含量如下(mg/g) :pCAMBIA1300-35S-0sEASl轉基因水稻1. 9113 ；野生型水稻1. 8796 ；突變體easl 2. 0426 ；暗誘導5天時，各種植株葉綠素含量如下(mg/g) :pCAMBIA1300-35S-0sEASl轉基因水稻0. 1114 ；野生型水稻0. 3252 ；突變體easl 1. 2065。三個獨立的陽性轉基因株系的結果無顯著差異。結果表明pCAMBIA1300-35S_0sEASl轉基因水稻比easl表現出更明顯的早衰表型，比WT也表現出略早的衰老(圖8)。
權利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質a)、由SEQID NO :2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)JfSEQ ID NO :2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具相同功能的由a)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述編碼基因為如下1)或2)或3) 或4)或幻或6)所示1)SEQ ID NO 3 所示 DNA 分子；2)SEQ ID NO 3中第33-1994位核苷酸所示DNA分子；3)SEQ ID NO 1 所示 DNA 分子；4)SEQ ID NO 1中第2360-6020位核苷酸所示DNA分子；5)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；6)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的 DNA分子。
4.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對；或，所述引物對如SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
5.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、重組病毒、轉基因細胞系或表達盒。
6.一種改變植物抗病性的方法，是向出發植物中導入權利要求2或3中所述編碼基因， 得到抗病性高於所述出發植物的轉基因植物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述抗病性為抗稻瘟病；所述出發植物為單子葉植物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述稻瘟病是由稻瘟病菌 (Magnaporthegrisea) ZB15 ^M'M'MM (Magnaporthe grisea) Z8—10—14 弓丨@的-,PJi^E^-^· 葉植物為水稻。
9.一種改變植物抗衰老性能的方法，是向出發植物中導入權利要求2或3中所述編碼基因，得到抗衰老性能低於所述出發植物的轉基因植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述出發植物為單子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
全文摘要
本發明公開了一種與抗病性相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白是如下a)或b)的蛋白質a)、由SEQ ID NO2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；b)、將SEQ ID NO2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具相同功能的由a)衍生的蛋白質。實驗證明，本發明的基因具有增強植物的抗病性和降低植物的抗衰老性的功能。因此，本發明基因在植物的遺傳育種領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01H5/00GK102295690SQ20111004977
公開日2011年12月28日 申請日期2011年3月2日 優先權日2010年6月25日
發明者左建儒, 謝慶軍, 錢前 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所