一種松材線蟲人工飼養液的製備方法
2023-05-01 18:15:11 3
專利名稱：一種松材線蟲人工飼養液的製備方法
技術領域：
本發明屬於線蟲人工飼養技術領域，具體為一種松材線蟲人工飼養液的製備方法。
背景技術：
松材線蟲Bursaphelenchus xylophiIus屬螺形動物門，線蟲綱，墊刃目，滑刃總科，傘刃屬。線蟲成蟲蟲體細長，體長約1_，雌蟲尾部近圓錐形，末端圓。雄蟲尾部似鳥爪，向腹面彎曲。松材線蟲病又稱松枯萎病，是一種毀滅性病害。國家林業局在2009年第3號公告，松材線蟲病疫區為江蘇、浙江、安徽、江西、山東、福建、湖北、湖南、廣東、重慶、雲南、廣西、重慶、四川等15個省、區、市的193個縣(市、區)。據統計，2008年全國松材線蟲病發生面積96. 42萬畝，病死松樹106. 17萬株。不僅直接破壞了自然景觀及生態環境，給國民經濟造成巨大損失，更對我國松林資源，尤其是對我國南方廣泛栽植的330多萬hm2松林和重要生態區域構成了嚴重威脅，同時，也嚴重地影響著我國外貿出口競爭力。根據植物病理學的經典柯赫氏法則，要對由松材線蟲引起的松材線蟲病進行研究，獲得松材線蟲的培養方法是整個研究的關鍵。因此，要對松材線蟲進行研究，首先就要獲得大量的線蟲。前人對松材線蟲的培養方法歸納起來主要有2大類3種方法①單異活體培養——人工培養基培養松材線蟲，又分為2種，一種是用人工培養基先培養真菌，然後利用真菌培養；另一種則利用植物組織培養技術培養松樹愈傷組織，然後以松樹愈傷組織為食料培養。②無異活體培養——人工合成培養基直接培養松材線蟲。目前無菌松材線蟲的人工培養方法主要有單異活體培養和無異活體法，但也有學者指出這兩種方法的主要缺點是操作過程較為繁瑣，得到的無菌線蟲數量較少，難以滿足研究需要，食料真菌培養法其操作過程較為繁雜，易汙染，難以排除食料真菌或消毒劑對實驗的影響；無異活體培養法其培養周期較長，產量較低，而且長期培養還可能會改變松材線蟲原有的生物學特性。在黑松愈傷組織上培養無菌松材線蟲既克服了食料真菌法的缺點，又較無異活體培養法所用培養周期短，產量要高；但是幾次繼代後的線蟲體型較小，保藏不方便。所以不管是單異活體培養還是無異活體法，建立一套科學完整的松材線蟲人工飼養體系，是以後松材線蟲人工培養的研究方向和關鍵。
發明內容
針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在於設計提供一種松材線蟲人工飼養液的製備方法的技術方案，具有飼養成本低，操作簡便，應用範圍廣，線蟲產量高，同時不會改變松材線蟲原有的生物學特性。所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於包括以下步驟
1)按照松木屑15-20%、黃瓜15-20%、香蕉15-20%、蘋果15_20%、豌豆15_20%、麥芽糖15-20%的比例稱取上述物質，均粉碎至150-200目，備用；
2)將松木屑粉碎物用三層紗布包好放入盛滿清水的漏鬥中，漏鬥下接一段8-15cm長的橡皮管，橡皮管上裝一個截流彈簧夾，13-17h後打開彈簧夾，用離心管接取橡皮管中水樣；靜置15-30 min，然後在轉速1500_2000r/min下離心2_5 min，除去離心管內上層清液後，即獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液，備用；
3)將黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物Ig加水量4-7ml的比例加水，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，真菌的加入重量為粉碎混合物重量的O. 08-0. 2倍，充分攪拌均勻，26 - 30°C下靜置2_3h，然後取步驟I)中的松材線蟲懸浮液1-2滴，接種到上述飼養液中，即得松材線蟲人工飼養液。所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟I)中松木屑的含量為16-18%，黃瓜的含量為16-18%，香蕉的含量為16-18%，蘋果的含量為16_18%，豌豆的含量為16-18%，麥芽糖的含量為16-18%。
所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟2)中橡皮管的長度為10-12 cm，截流彈簧夾夾住的時間為14-16h，靜置時間20-25 min，轉速1600_1800r/min,離心時間3-4 min。所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟3)中黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物在水中浸泡時間3. 5-4. 5h。所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟3)中靜置溫度27 — 29°C，時間為 2. 2-2. 8h。所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟3)中所述的真菌為長喙殼菌、酵母菌、毛殼菌、鐮刀菌、灰葡萄胞菌中的一種或一種以上混合物。上述一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，以松材疫木上分離得到的松材線蟲為培養對象，通過人工飼養，獲得研究所需的合格松材線蟲，其操作過程簡便，長期飼養也不會改變松材線蟲原有的生物學特性。其飼養方法簡單易行，周期短，線蟲產量高，效果好，生產成本低廉，品種優良，能顯著提高松材線蟲飼養的存活率和繁殖率。本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，其它的均為純物質的重量百分含量。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發明作進一步說明，並結合試驗進一步說明本發明的有益效果。實施例I
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各20g，均粉碎至200目，然後加入IOOml的水浸泡5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入長喙殼菌2g，充分攪拌均勻，30°C下靜置3h，然後取松材線蟲懸浮液2滴，接種到上述飼養液中，最後置於溫度為26°C，溼度為85%的恆溫恆溼箱中正常飼養。實施例2
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各15g，均粉碎至170目，然後加入IOOml的水浸泡4h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入酵母菌2g，充分攪拌均勻，30°C下靜置2. 4h，然後取松材線蟲懸浮液I滴，接種到上述飼養液中，最後置於溫度為24°C，溼度為79%的恆溫恆溼箱中正常飼養。
實施例3
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各16g，均粉碎至190目，然後加入IOOml的水浸泡3. 5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入長喙殼菌O. 4g、酵母菌O. 4g、毛殼菌O. 4g、鐮刀菌O. 4g、灰葡萄胞菌O. 4g，充分攪拌均勻，29°C下靜置2. 8h，然後取松材線蟲懸浮液2滴，接種到上述飼養液中，最後置於溫度為26°C，溼度為85%的恆溫恆溼箱中正常飼養。實施例4
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各17g，均粉碎至160目，然後加入IOOml的水浸泡4. 5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入毛殼菌2g，充分攪拌均勻，28°C下靜置2. 5h，然後取松材線蟲懸浮液I滴，接種到上述飼養液中，最後置於溫度為24°C，溼度為78%的恆溫恆溼箱中正常飼養。實施例5
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各18g，均粉碎至180目，然後加入IOOml的水浸泡5h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入鐮刀菌、灰葡萄胞菌各lg，充分攪拌均勻，27°C下靜置2. 2h，然後取松材線蟲懸浮液2滴，接種到上述飼養液中，最後置於溫度為25°C，溼度為80%的恆溫恆溼箱中正常飼養。實施例6
稱取松木屑、黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖各20g，均粉碎至150目，然後加入IOOml的水浸泡3h，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入酵母菌、灰葡萄胞菌各lg，充分攪拌均勻，26°C下靜置2h，然後取松材線蟲懸浮液I滴，接種到上述飼養液中，最後置於溫度為23°C，溼度為75%的恆溫恆溼箱中正常飼養。以下通過試驗說明上述松材線蟲飼養方法的良好效果。表I實施例1-6對松材線蟲在不同飼養天數下存活率的試驗結果
權利要求
1.一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 1)按照松木屑15-20%、黃瓜15-20%、香蕉15-20%、蘋果15_20%、豌豆15_20%、麥芽糖15-20%的比例稱取上述物質，均粉碎至150-200目，備用； 2)將松木屑粉碎物用三層紗布包好放入盛滿清水的漏鬥中，漏鬥下接一段8-15cm長的橡皮管，橡皮管上裝一個截流彈簧夾，13_17h後打開彈簧夾，用離心管接取橡皮管中水樣；靜置15-30 min，然後在轉速1500_2000r/min下離心2_5 min，除去離心管內上層清液後，即獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液，備用； 3)將黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物Ig加水量4-7ml的比例加水，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，真菌的加入重量為粉碎混合物重量的O. 08-0. 2倍，充分攪拌均勻，26 - 30°C下靜置2_3h，然後取步驟I)中的松材線蟲懸浮液1-2滴，接種到上述飼養液中，即得松材線蟲人工飼養液。
2.如權利I所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟I)中松木屑的含量為16-18%，黃瓜的含量為16-18%，香蕉的含量為16-18%，蘋果的含量為16_18%，豌豆的含量為16-18%，麥芽糖的含量為16-18%。
3.如權利I所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟2)中橡皮管的長度為10-12 cm，截流彈簧夾夾住的時間為14-16h，靜置時間20-25 min，轉速1600-1800r/min,離心時間 3-4 min。
4.如權利I所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟3)中黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物在水中浸泡時間3. 5-4. 5h。
5.如權利I所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟3)中靜置溫度 27 — 29°C，時間為 2. 2-2. 8h。
6.如權利I所述的一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，其特徵在於步驟3)中所述的真菌為長喙殼菌、酵母菌、毛殼菌、鐮刀菌、灰葡萄胞菌中的一種或一種以上混合物。
全文摘要
一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，屬於線蟲人工飼養技術領域。其特徵在於包括以下步驟1)按照比例稱取原料粉碎備用；2)獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液；3)部分粉碎混合物加入水中浸泡過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，充分攪拌均勻，26－30℃下靜置2-3h，然後再加入松材線蟲懸浮液1-2滴，即得松材線蟲人工飼養液。上述一種松材線蟲人工飼養液的製備方法，以松材疫木上分離得到的松材線蟲為培養對象，通過人工飼養，獲得研究所需的合格松材線蟲，其操作過程簡便，長期飼養也不會改變松材線蟲原有的生物學特性。其飼養方法簡單易行，周期短，線蟲產量高，效果好，生產成本低廉，品種優良。
文檔編號A23K1/18GK102613406SQ20121008508
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者胡加付, 蘇秀, 郭愷, 黃小娟 申請人:浙江農林大學