成纖維細胞生長因子的21突變蛋白的製作方法

2023-05-02 08:16:46

專利名稱：成纖維細胞生長因子的21突變蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及對具有改良的藥學特性的成纖維細胞生長因子21新突變蛋白的鑑定。
背景技術：
成纖維細胞生長因子21是在發育及成熟組織中廣泛表達的大型多肽(Baird等，Cancer Cells，3239-243，1991)，在包括血管生成、有絲分裂、圖式形成、細胞分化、代謝調節及組織創傷修復等多重生理功能中具有重要作用(McKeehan等，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.59135-176，1998)。根據已發表文獻，FGF家族目前包括至少二十三個成員，FGF-1到FGF-23(Reuss等，Cell Tissue Res.313139-157(2003))。
據報導，成纖維細胞生長因子21(FGF-21)優選表達於肝臟(Nishimura等，Biochimica et Biophysica Acta，1492203-206，(2000)；WO01/36640和WO01/18172)，可作為缺血性血管疾病、創傷癒合、與肺、支氣管或肺泡功能損失相關疾病及很多其他不適的治療手段。最近證實FGF-21能夠促進小鼠3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取(不論胰島素存在與否)，並可以劑量依賴性的方式降ob/ob/ob和db/db小鼠以及8周大ZDF大鼠餐後及空腹時血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平，因而提供了FGF-21用於治療糖尿病和肥胖症(WO03/011213)的基礎。此外，已證實FGF-21能夠有效降低重症病人的死亡率和發病率(WO03/059270)。
研製諸如FGF-21的蛋白質藥物製劑的巨大挑戰是處理其物理及化學不穩定性。蛋白質的組成多樣性和特性決定了其特定行為，如摺疊、構象穩定性及解摺疊/變性。在研發利用水性蛋白質溶液的藥物製劑條件時，必須針對這些特性來穩定蛋白質(Wang，W.，Int.J.of Pharmaceutics，18，(1999)。
具體而言，在藥用蛋白質研製中，如苯酚、m-甲酚、甲基對苯甲酸、間苯二酚及苯甲醇之類的抗微生物防腐劑是旨在成為無菌、多用途製劑的腸胃外藥物製劑所必需的。遺憾的是，這些化合物常會對蛋白質產品的穩定性產生不良影響，會引發其交聯和聚集(Maa等，Int.J.of Pharmaceutics140155-168(1996)；Lam等，Pharm.Res.14(6)725-729(1997))。
FGF-21很可能作為多用途無菌藥物製劑使用。然而，已經明確防腐劑(即m-甲酚)在這些條件下對其穩定性有不良影響。顯然需要研製出治療用FGF-21蛋白的穩定水性蛋白質製劑。本發明的FGF-21突變蛋白在藥物製劑條件下比野生型FGF-21更穩定，從而克服了其物理不穩定性的巨大障礙。因此，本發明的FGF-21突變蛋白提供了可用於治療2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群以及降低重症病人的死亡率和發病率的穩定藥用蛋白質製劑。
發明概述首先，本發明提供人成纖維細胞生長因子21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用帶電荷的和/或極性但不帶電荷的胺基酸替換以下一個或多個胺基酸甘氨酸42、谷胺醯胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺醯胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172，其中胺基酸編號依據SEQ ID NO1。
其次，本發明提供人成纖維細胞生長因子21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用半胱氨酸替換以下兩個或多個胺基酸精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺醯胺27、谷胺醯胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、穀氨酸50、谷胺醯胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺醯胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、穀氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬醯胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中胺基酸編號依據SEQ IDNO1。
第三，本發明提供人FGF-21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用任何帶電荷的和/或極性但不帶電荷的胺基酸替換任一個本發明第一個實施方案中指出的胺基酸位置，同時用半胱氨酸替換本發明第二個實施方案中指出的兩個或多個胺基酸位置。
其他實施方案涉及編碼第一、第二及第三實施方案中突變蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的載體以及攜帶所述載體的宿主細胞。另一個實施方案涉及生產多肽、生產能夠產生所述多肽的細胞以及生產含有編碼所述多肽DNA的載體的方法。
此外，另一實施方案則涉及治療具有肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中一項或多項表現的病人的方法，包括對所述需要該類治療的病人施用治療有效量的實施方案一、二或三中的人FGF-21突變蛋白或其藥物組合物。
發明詳述為說明此處公開及要求權利的本發明，定義下列術語如下「FGF-21」為包括27個胺基酸前導序列的長為208個胺基酸的多肽。人FGF-21與小鼠FGF-21具有～79％的胺基酸同一性，與大鼠FGF-21具有～80％的胺基酸同一性。人FGF-21為本發明突變蛋白優選的多肽模板，但可以理解，本領域技術人員能夠很容易地在另一種哺乳動物的FGF-21多肽序列基礎上製備突變蛋白。根據下示181個胺基酸的成熟人FGF-21多肽(SEQ ID NO1)，確定本發明中突變蛋白的胺基酸位置1 10 20His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val Arg Gln Arg Tyr30 40Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr50 60Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro70 80Gly Val Ile Gln Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly90 100Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg Glu Leu Leu Leu110 120Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly130 140Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro150 160Gly Leu Pro Pro Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val170 180Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser Pro Ser Tyr AlaSer編碼該181胺基酸的成熟人FGF-21多肽的相應DNA序列為(SEQ IDNO2)CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAA
TGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCC蛋白質表達領域的技術人員會意識到可以將甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列引入該成熟序列(SEQ ID NO1)的N-末端，以便在大腸桿菌E.coli中表達，這也為本發明所設想。
可以利用三字母密碼子定義胺基酸或者利用標準的一字母密碼子定義。利用三字母密碼子表示原胺基酸，加上該胺基酸編號，再加上替換胺基酸的三字母密碼子來表示突變。每一突變蛋白的編碼數字是基於成熟野生型人FGF-21的181胺基酸序列而定。例如，用帶負電荷胺基酸穀氨酸(Glu)替換139位的亮氨酸(即Leu139)，表示為Leu139Glu或L139E。與之相似，用帶負電荷胺基酸穀氨酸(Glu)對152位的異亮氨酸和163位的絲氨酸(Ile152，Ser163)進行雙重替換，表示為Ile152Glu/Ser163Glu、I152E/S163E或I152E-S163E。
人FGF-21突變蛋白指其含有人FGF-21，其中至少一個野生型成熟蛋白的胺基酸被另一個胺基酸所替換。一般而言，突變蛋白具有某些野生型蛋白結構或功能上的性質改良。例如突變蛋白在濃縮溶液中的物理穩定性可能得到增強或改善(例如，更少發生疏水介導的聚集)，同時還保留其有利的生物活性特點。突變蛋白與藥物防腐劑(如m-甲酚、苯酚、苯乙醇)的相容性可能有所提高，因而能夠製備可在保存期間維持該蛋白生理化學特性及生物學活性的保存型藥物製劑。因此，與野生型FGF-21相比藥物穩定性增加的突變蛋白，在生理及保存型藥物製劑條件下的濃縮溶液中的物理穩定性均有所改善，同時還保持其生物學效力。此處所用的這些術語並無限制性，某一給定突變蛋白完全有可能具有一種或多種野生型蛋白質的改良特性。
「生物活性肽」是指保持本發明突變蛋白改良特性和生物學效力的本發明突變蛋白肽。
「治療有效量」為對病人產生治療益處所需的活性劑的最小劑量。例如，對於表現患有或易感2型糖尿病、肥胖症或代謝症候群的患者或為預防其發病的病人而言，「治療有效量」是指能夠誘導、改進或者造成與上述紊亂相關或因與之對抗所致的病理症狀、疾病進展、生理情況改善的劑量。本發明中「個體」或「病人」優選為人，但也可為動物，更具體而言為同伴動物(如狗、貓等)、農場動物(如牛、羊、豬、馬等)以及實驗室動物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
「2型糖尿病」的特徵在於胰島素存在時仍有過量葡萄糖生成；由於葡萄糖清除不足，循環中的葡萄糖水平過高。
「葡萄糖不耐受」可定義為對葡萄糖的異常敏感性。
「高血糖症」是指血中糖(葡萄糖)過量。
「低血糖症」也稱為低血糖，發生於血中葡萄糖水平過低而無法提供機體活動所需的足夠能量時。
「高胰島素血症」是指血中胰島素水平高於正常。
「胰島素抵抗」是指正常量胰島素產生低於正常的生物學反應的狀態。
「肥胖症」，對於人個體而言是指體重超過給定人群理想體重的20％(R.H.Williams，Textbook of Endocrinology，1974，904-916頁)。
「代謝症候群」是指具有以下至少三種症狀的症候群腹部脂肪——對於大多數男性為腰圍40英寸或以上；高血糖——空腹至少為110毫克每分升(mg/dl)；高甘油三酯——血中含量至少150mg/dl；低高密度脂蛋白(HDL)——低於40mg/dl；以及血壓為130/85或更高。
本發明中的重症病人一般都處於不穩定的高代謝狀態。該不穩定代謝狀態是由底物代謝改變所致，而這一改變可能會導致某些營養素的相對不足。一般而言脂肪和肌肉的氧化都有所增加。
此外，重症病人優選為那些全身炎症反應症候群或呼吸窘迫的病人。發病率的降低是指降低了重症病人發生其他疾病、狀況或症狀的可能性，或降低了發生其他疾病、狀況或症狀的嚴重度。例如降低發病率可能指降低菌血症或敗血症或多器官衰竭相關併發症的發生率。
此處所用的「全身炎症反應症候群(SIRS)」描述了與大量臨床狀況相關的炎症過程，包括(但不僅限於)出現以下一項以上的臨床表現(1)體溫高於38℃或低於36℃；(2)心率大於每分鐘90次；(3)呼吸急促(表現為呼吸速率大於每分鐘20次)，或通氣過度(表現為PaCO2小於32mmHg)；以及(4)血白細胞計數改變，如計數大於12,000/cu mm、計數小於4,000/cu mm，或出現多於10％的未成熟中性粒細胞。當沒有其他已知原因(如化療、誘導產生的中性粒細胞缺乏症及白細胞缺乏症)可解釋這些異常時，這些生理性改變反映了基線水平上的急性改變。
此處所用的「敗血症」定義為感染引發的SIRS。SIRS的非感染性病因可以包括胰腺炎、缺血、多重創傷和組織損傷(即重度損傷或嚴重燒傷)、出血性休克、免疫介導的器官損傷以及外源性施用此類炎症過程的公認介質，如腫瘤壞死因子及其他細胞因子。
敗血症性休克以及多器官功能障礙是ICU科室(ICU setting)發病率和死亡率的主要成因。敗血症與很多宿主防禦機制的活化相關並由之介導，這些機制包括細胞因子網絡、白細胞和補體級聯反應，以及包括內皮在內的凝血/纖溶系統。與多種器官微血管系統的內纖維蛋白沉積相關的彌散性血管內凝血(DIC)及其他程度的消耗性凝血病是敗血症/敗血症性休克的表現。宿主防禦反應對靶器官的下遊作用是多器官功能障礙症候群(MODS)發展的重要中介，也是敗血症、嚴重敗血症及並發休克的敗血症病人預後差的原因之一。
此處所用的「呼吸窘迫」是指病人由於某種類型的肺功能障礙出現呼吸困難的情形。通常這些病人會表現出程度不等的低氧血症，補充氧治療可能有效也可能無效。
呼吸窘迫可能發生於因直接肺損傷導致肺功能受損的病人，也可能由於間接肺損傷(如在全身疾病過程中)而發生。此外，多重易患(predisposing)疾病的存在極大地增加了發病風險；如長期酗酒、慢性肺疾病及低血清pH值之類的次級因素的存在也是如此。
直接肺損傷的一些原因包括肺炎、胃內容物吸入、肺挫傷、脂肪栓塞、近乎溺死、吸入性損傷、高海拔以及肺移植或肺栓子切除術後再灌注性肺水腫。間接肺損傷的一些原因包括敗血症、伴休克及多次輸血的嚴重創傷、心肺分流術、藥物過量、急性胰腺炎以及血製品輸注。
有一類引發呼吸窘迫的肺疾病與所謂的肺原性心臟病(Cor Pulmonale)症候群相關。該類疾病伴有慢性低氧血症，導致稱為肺動脈高血壓的肺循環壓力升高。產生的肺動脈高血壓增加了右心室的工作負荷，從而導致其擴張或肥厚。肺原性心臟病通常表現為右心衰竭，定義為右心室壓力的持續增高以及靜脈回右心血量減少的臨床表現。
「慢性阻塞性肺疾病」(COPD)，包括肺氣腫和慢性支氣管炎，也會引起呼吸窘迫，其特徵在於氣流阻塞。COPD為第四位死因，每年造成超過100,000人死亡。
「急性呼吸窘迫症候群」(ARDS)常為漸進性的，其特徵在於具有明確的分期。該症候群通常表現為具有該狀況危險因素的病人中迅速發作的呼吸衰竭，以補充氧治療難以糾正的動脈低氧血症為特徵。在肺重力低垂區(dependent lung zone)可能存在肺泡充盈、實變及肺不張；然而非低垂區也可能有廣泛的炎症。該症候群可能發展為纖維化肺泡炎，伴有持續低氧血症、肺泡通氣死腔增加以及肺順應性的進一步下降。也可能出現對肺毛細血管床造成損害的肺動脈高血壓。
本發明第一優選的方面包括人FGF-21突變蛋白，其中替換是指用任何帶電荷的和/或極性但不帶電荷的胺基酸取代至少一個以下胺基酸甘氨酸42、谷胺醯胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺醯胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172，其中胺基酸編號依據SEQ ID NO1。帶電荷胺基酸是指攜帶正電荷或負電荷的胺基酸。帶正電荷的胺基酸包括組氨酸、賴氨酸、精氨酸及它們非天然存在的類似物(例如γ氨基丁酸、鳥氨酸等)。帶負電荷胺基酸包括天冬氨酸、穀氨酸及它們非天然存在的類似物(例如氨基己二酸)。極性但不帶電荷的胺基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺及它們非天然存在的類似物。實施方案一中最優選的突變蛋白為Gln54Glu、Leu139Glu、Ala145Glu、Leu146Glu、Ile152Glu、Gln156Glu、Ser163Glu及Ile152Glu-Ser163Glu。
本發明其次提供人FGF-21的突變蛋白或其生物活性肽，包括用半胱氨酸替換以下兩個或多個胺基酸精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺醯胺27、谷胺醯胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、穀氨酸50、谷胺醯胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺醯胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、穀氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、；脯氨酸119、天冬醯胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中胺基酸編號依據SEQ ID NO1。
本領域技術人員也會認識到天然半胱氨酸(半胱氨酸75和半胱氨酸93)也可用作引入可能改善性質的新二硫鍵的位點。特別設想在絲氨酸85或苯丙氨酸73分別引入半胱氨酸替換，伴隨改變半胱氨酸93或半胱氨酸75，其中後兩個位點可用任意其他胺基酸取代。
天然二硫鍵(如半胱氨酸殘基所提供)一般能夠提高蛋白質的熱力學穩定性。T4溶酶體酶(Matsumura等，PNAS 866562-6566(1989))和芽孢桿菌RNA酶(Johnson等，J.Mol.Biol.268198-208(1997))的多重二硫鍵突變體是熱力學穩定性提高(以熔解溫度升高衡量)的成功實例。本發明的一個方面認為通過二硫鍵限制FGF-21的118-134胺基酸環靈活性能夠增加FGF-21在防腐劑中的物理穩定性，推想這可能是由於限制防腐劑進入該蛋白質的疏水核心所致。
含有除Cys75-Cys93處天然存在的二硫鍵之外的人工二硫鍵的FGF-21突變蛋白如下Gln76Cys-Ser109Cys、Cys75-Ser85Cys、Cys75-Ala92Cys、Phe73Cys-Cys93、Ser123Cys-His125-Cys、Asp102Cys-Tyr104Cys、Asp127Cys-Gly132Cys、Ser94Cys-Glu110Cys、Pro115Cys-His117Cys、Asn121Cys-Asp127Cys、Leu100Cys-Asp102Cys、Phe95Cys-Tyr107Cys、Arg19Cys-Pro138Cys、Tyr20Cys-Leu139Cys、Tyr22Cys-Leu137Cys、Arg77Cys-Asp79Cys、Pro90Cys-Ala92Cys、Glu50Cys-Lys69Cys、Thr23Cys-Asp25Cys、Ala31Cys-Gly43Cys、Gln28Cys-Gly43Cys、Thr23Cys-Gln28Cys、Val41Cys-Leu82Cys、Leu58Cys-Val62Cys、Gln54Cys-Leu66Cys、Ile35Cys-Gly67Cys、Gly67Cys-Arg72Cys、Ile35Cys-Gly84Cys、Arg72Cys-Gly84Cys或Arg77Cys-Ala81Cys，其中胺基酸編號依據SEQ ID NO1。優選含以下人工二硫鍵的突變蛋白Tyr22Cys-Leu139Cys、Asp24Cys-Arg135Cys、Leu118Cys-Gly132Cys、His117Cys-Pro130Cys、His117Cys-Ala129Cys、Leu82Cys-Pro119Cys、Gly80Cys-Ala129Cys、Gly43Cys-Pro124Cys、Gly42Cys-Arg126Cys、Gly42Cys-Pro124Cys、Gln28Cys-Pro124Cys、Gln27Cys-Ser123Cys、Ala26Cys-Lys122Cys或Asp25Cys-Lys122Cys。最優選含導入二硫鍵的突變蛋白為Leu118Cys-Ala134Cys、Leu21Cys-Leu33Cys、Ala26Cys-Lys122Cys、Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys。
本發明的第三方面提供了人FGF-21突變蛋白或其生物活性肽，包括用任何帶電荷的和/或極性但不帶電荷的胺基酸替換任一個本發明第一個實施方案中指出的胺基酸位置，同時用半胱氨酸替換本發明第二個實施方案中指出的兩個或多個胺基酸位置。
本領域眾所周知在研製蛋白質藥物的中一大挑戰在於對付蛋白質的物理和化學不穩定性。當蛋白質藥物製劑用作多用途的可注射製劑而需要穩定、濃縮及防腐的溶液，同時還保持其有利生物活性特徵時，這一挑戰更為突顯。野生型FGF-21詳細的生物物理學特徵決定了當濃縮的蛋白質溶液(＞5mg/ml)處於應激條件下(如高溫或低pH)時會加速其交聯和聚集(即較差的物理穩定性和生物製藥學特性)。FGF-21濃縮蛋白質溶液暴露於藥物防腐劑(如m-甲酚)也會對其物理穩定性產生負面影響。
因此，本發明的一個實施方案是在生理及儲存製劑條件下保持化學穩定性和生物學效力的同時，增加濃縮溶液的物理穩定性。據認為交聯和聚集可能是疏水相互作用所致，因為在給定的蛋白質濃度下，溫度及離子強度對物理穩定性具有相當的影響。大部分情況下，目標定位於非保守的、推定存在於表面的胺基酸殘基。分析這些殘基的局部環境，並選擇誘變那些被認為不具結構重要性的殘基。引發具體變化的方法之一是通過引入穀氨酸殘基(「穀氨酸掃描」)進一步降低蛋白質的pI。有假說認為帶電荷替換胺基酸的引入會通過電荷-電荷相斥抑制疏水介導的聚集，並能改善防腐劑相容性。此外，本領域技術人員也會認識到，通過足夠程度的誘變引入正電荷、伴隨或不伴隨負電荷的同時減少，可以將pI遷移至基本pH範圍內，從而使能夠產生電荷-電荷排斥。
儘管本發明的實施方案涉及在生理及儲存藥物製劑條件下的物理和化學穩定性，保持該突變蛋白相對於野生型FGF-21的生物學效力也是考慮的重要因素。因此，本發明突變蛋白的生物學效力是指突變蛋白影響葡萄糖攝取(如體外3T3-L1細胞測定(實施例4)所測量)，和/或降低血漿葡萄糖水平以及血漿甘油三酯(如ob/ob小鼠測定(實施例5)所測量)的能力。
根據本發明施用的FGF-21突變蛋白可以通過本領域已知的任何方法產生和/或分離。最優選產生該突變蛋白的方法是本領域技術人員公知的重組DNA方法。此類方法描述於《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley Sons，Inc.)，其在此處引用作為參考。
此外，優選實施方案包括此處所述突變蛋白來源的生物活性肽。該肽含有至少一個前述替換，且該突變蛋白具有生物學活性。可以通過本領域技術人員已知的任何及所有方法產生該肽，其實例包括但不僅限於酶消化、化學合成或重組DNA方法。
本領域已經明確某些成纖維細胞生長因子的肽段具有生物學活性。見例如Baird等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)852324-2328(1988)以及J.Cell.Phys.Suppl.5101-106(1987)。因此，根據本領域公知的標準選擇突變蛋白的片斷或肽。例如，已知二肽基肽酶IV(DPP-IV)為滅活神經肽、內分泌肽及細胞因子所涉及的絲氨酸型蛋白酶(Damme等.Chem.Immunol.7242-56，(1999))。FGF-21的N末端(HisProIlePro)含有是DPP-IV潛在底物的兩個二肽，可產生從N-末端截去4個胺基酸的FGF-21片斷。出人意料的是，已經證實野生型FGF-21的該片斷保留有其生物活性(表1)，因此，從N-末端截去本發明突變蛋白的至多4個胺基酸，是本發明的實施方案之一。
本發明也包括RNA形式或DNA形式的編碼上述突變蛋白的多核苷酸，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成DNA。DNA可以為雙鏈或單鏈。編碼本發明突變蛋白的編碼序列可由於冗餘或遺傳密碼的簡併而有所不同。
編碼本發明突變蛋白的多核苷酸可包括以下僅該突變蛋白的編碼序列、突變蛋白編碼序列及額外的編碼序列(如功能多肽，或前導或分泌序列或前蛋白質序列)；突變蛋白的編碼序列及非編碼序列(如內含子，或突變蛋白編碼序列5』和/或3』端的非編碼序列)。因此術語「編碼突變蛋白的多核苷酸」所指的多核苷酸可能不僅含有突變蛋白的編碼序列，還含有包括額外編碼序列和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及編碼含上述替換的多肽的片斷、類似物及衍生物的所述多核苷酸變體。多核苷酸變體可能為天然存在的人FGF-21序列等位基因變體、非天然存在的變體，或如上所述的截短變體。因此，本發明也包括編碼上述突變蛋白的多核苷酸，還包括該多核苷酸的變體，所述變體編碼公開突變蛋白的片斷、衍生物或類似物。這類核苷酸變體包括缺失變體、替換變體、截短變體以及添加或插入變體，只要其中存在至少一個實施方案一或二中指出的胺基酸替換。
將本發明的多核苷酸與表達控制序列進行有效連接(即定位可確保其功能)後，於宿主中表達。這些表達載體通常可以附加體或宿主染色體DNA整合部分的形式在宿主生物中進行複製。一般而言，表達載體含有選擇標記(如四環素、新黴素及二氫葉酸還原酶)以允許檢測被目的DNA序列轉化的細胞。在適當的啟動子控制下，FGF-21突變蛋白可以在哺乳動物細胞、昆蟲、酵母、細菌或其他細胞中表達。也可利用本發明DNA構建體衍生的RNA、通過無細胞翻譯系統產生所述蛋白質。
大腸桿菌為原核宿主，尤其適用於克隆本發明的多核苷酸。其他適用的微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)以及沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的多個種，但也可以選擇使用其他宿主。也可以在這些原核宿主中製備表達載體，其中通常含有與宿主細胞相容的表達控制序列(如複製起點)。此外，還可能具有眾多公知啟動子中的任一種，如乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或噬菌體λ或T7來源的啟動子系統。通常這些啟動子會控制表達(可選通過操縱子序列)，且具有核糖體結合位點序列等，以便起始和完成轉錄及翻譯。
蛋白表達領域技術人員會意識到可以將甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列引入該成熟序列(SEQ ID NO1)的N-末端，以便在大腸桿菌E.coli中表達，且這也是本發明所考慮的。因此除非另有說明，在大腸桿菌中表達的本發明突變蛋白N-末端引入了甲硫氨酸序列。
如酵母或真菌等的其他微生物也可用於表達。優選的酵母宿主實例為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以及嗜甲醇畢赤酵母(Pichiaangusta)，同時需要合適的具有表達控制序列的載體，所述序列如啟動子(包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶)，以及複製起點、終止序列等所需序列。真菌宿主的實例為黑麴黴(Aspergillus niger)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllum commune)，但也可選擇使用其他真菌。
哺乳動物組織細胞培養也可用於表達和產生本發明的多肽。實際上優選真核細胞，因為本領域已經研製出一些能夠分泌完整突變蛋白的合適宿主細胞系，包括CHO細胞系、多種COS細胞系、NS0細胞、敘利亞地鼠(Syrian Hamster)卵巢細胞系、HeLa細胞或人胎腎細胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點、啟動子、增強子以及必要的加工信息位點(如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉錄終止序列)。優選的表達控制序列為SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒、Raus肉瘤病毒等來源的啟動子。優選的聚腺苷酸化位點包括SV40及牛生長激素來源的序列。
可以通過公知的方法將含有目的多核苷酸序列(如FGF-21突變蛋白以及表達控制序列)的載體轉移到宿主細胞內，所採用的方法取決於細胞宿主的類型。例如，對原核細胞通常採用氯化鈣轉染法，而對於其他細胞宿主可以使用磷酸鈣處理或電穿孔法。
可以使用多種蛋白質純化方法，此類方法為本領域公知且其描述見如Deutscher，Methods in Enzymology 18283-9(1990)及Scopes，《ProteinPurificationPrinciples and Practice》，Springer-Verlag，NY(1982)。選用的純化步驟取決於如生產FGF-21突變蛋白所用方法的性質。
含FGF-21突變蛋白的組合物應當根據有效醫療實踐的需要，考慮病人的臨床情況、FGF-21突變蛋白組合物的遞送位點、施用方法、施用時間安排以及操作者已知的其他因素，來製成劑型並確定劑量。因此，用於此處目的的FGF-21突變蛋白「治療有效量」取決於上述考慮。
可以通過能達到一般目的(即治療2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群或重症病人)的任何方法施用本發明的FGF-21突變蛋白藥物組合物。此處所用的術語「腸胃外」是指包括靜脈內、肌內、腹腔內、胸骨內、皮下及關節內注射和輸注在內的施用模式。施用的劑量則取決於年齡、健康狀況及受者的體重、目前接受的治療(如果有)、治療頻率以及所期望的效果。本發明範圍內的組合物包括所有組合物，其中含有能有效達到所需醫療效果的劑量的FGF-21突變蛋白，所述醫療效果包括治療2型糖尿病、肥胖症或代謝症候群。雖然病人間的個體需求可能存在差異，普通臨床醫師仍然能夠確定所有成分治療有效量的最佳範圍。
本發明的FGF-21突變蛋白可以根據已知方法配製以製備可藥用組合物。理想的製劑應當為能夠通過適當稀釋劑復原的穩定凍乾產品，或為可選含有可藥用載體、防腐劑、賦形劑或穩定劑的高純度液體溶液[Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版(1980)]。本發明的突變蛋白可以與可藥用緩衝液組合，並調整其pH以提供一定的穩定性以及可施用的pH值。
在一個實施方案中，一般將一種或多種FGF-21突變蛋白按所需純度與可藥用載體(即在使用劑量和濃度內對受者無毒並與製劑其他成分相容的載體)混合為單位注射劑型(溶液、懸浮液或乳濁液)來製備為腸胃外施用的FGF-21突變蛋白。可優選添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。苯酚、m-甲酚及苯甲醇為優選的可藥用抗微生物劑。
可選加入一種或多種可藥用鹽來調節離子強度或張力。可加入一種或多種賦形劑進一步調節製劑的等張性。甘油、氯化鈉及甘露醇為等張調節賦形劑的實例。
本領域技術人員根據良好的醫療實踐及病人個體的臨床情況，能夠很容易地最優化含有FGF-21突變蛋白的治療組合物的治療有效量及其施用方案。本發明FGF-21突變蛋白的一般成人劑量範圍為每天約0.01mg至每天約1000mg不等。優選的劑量範圍為每天約0.1mg至每天約100mg，更優選為約1.0mg/天至約10mg/天。最優選的劑量為約1-5mg/天。施用合適劑量的FGF-21突變蛋白能夠降低血中葡萄糖水平，並通過更快更有效地利用葡萄糖增加能量消耗，因此可以用於治療2型糖尿病、肥胖症和代謝症候群。
此外，由於在營養支持的重症病人中常見高血糖症和胰島素抵抗，一些ICU施用胰島素以治療進食重症病人的過度高血糖。實際上，最近的研究證明無論病人是否有糖尿病史，使用外源性胰島素保持血糖水平不高於110mg/dl都能夠降低外科重症監護病房重症病人的發病率和死亡率(Vanden Berghe等.N Engl J Med.，345(19)1359，(2001))。因此，本發明的FGF-21突變蛋白獨特地適用於協助代謝不穩定的重症病人恢復代謝穩定性。FGF-21突變蛋白的獨特之處在於它們刺激葡萄糖攝取並增加胰島素敏感性，但不會誘導低血糖。
本發明另一方面設想提供作為藥物用於治療2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群或重症病人的FGF-21突變蛋白。
至此已對本發明進行了詳細描述，參照以下實例能夠對之有更清楚的理解，所述實例僅為說明目的而並不旨在對本發明進行限制。
引用的所有專利及出版物均在此處明確引用作為參考。
實施例1在大腸桿菌中表達和純化FGF-21突變蛋白本實施例使用細菌表達載體pET30a進行細菌表達(Novagen，Inc.，Madison，Wisconsin)。pET30a編碼卡那黴素抗生素抗性基因，含有細菌複製起點(「ori」)、強T7噬菌體-IPTG誘導啟動子、核糖體結合位點(「RBS」)以及帶有多個特異限制性內切酶裂解位點的合適MCS。為便於純化，該載體可編碼用於N-末端肽融合的His-及S-標籤，以及C-末端His-標籤融合。然而，為達本發明的目的，將編碼FGF-21變體的cDNA分別插入限制性位點NdeI和BamHI之間，所產生的構建體不使用任何上述標籤。
利用PCR寡核苷酸引物(退火為開放閱讀框的5』和3』末端)，從cDNA克隆中擴增編碼FGF-21突變蛋白的核酸序列，所述序列缺少前導序列但以甲硫氨酸殘基替代之。將含有限制性酶NdeI和BamHI識別位點的額外核苷酸分別添加到該5』和3』序列中。
根據本領域已知的方法，所述5』正向及3』反向PCR引物含有與FGF-21突變蛋白編碼核酸編碼序列的一部分對應或互補的核苷酸，以進行克隆。本領域常規技術人員會理解多核苷酸序列中引物的起始位點可以有所變化。
用限制性酶NdeI和BamHI消化擴增的核酸片斷和載體pET30a，隨後將純化的消化DNA片斷連接起來。向限制性切割的pET30a載體中引入FGF-21突變蛋白編碼DNA，使包括其相應終止密碼子的FGF-21突變蛋白多肽編碼區位於IPTG-誘導啟動子的下遊，並處於以起始密碼子ATG起始的讀碼框內。相聯的終止密碼子TAG阻斷了插入點下遊6-組氨酸密碼子的翻譯。
利用如《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley Sons，Inc.)中所述的標準方法將連接混合物轉化入感受態大腸桿菌細胞。
在LB/卡那黴素平板上進行轉化反應，過夜生長轉化體後，挑取轉化株以製備質粒或原位裂解用於PCR篩選。通過限制性分析及隨後的DNA序列分析確定含有所需FGF-21變體插入的陽性重組質粒。然後使用這些質粒轉化表達株並生產蛋白質。
使用大腸桿菌株BL21(DE3)、BL21(DE3)STAR或BL21(DE3)RP表達FGF-21突變蛋白。這些菌株僅是許多適於表達FGF-21突變蛋白中的一些，它們可以分別通過商業渠道自Novagen，Inc.，Invitrogen及Stratagen獲得。利用轉化體在含有卡那黴素的LB平板上的生長能力可將其鑑別出來。
使含有所需構建體的克隆在含有卡那黴素(30μg/ml)的LB培養基中液體培養過夜生長(o/n)。利用該o/n培養物接種大型的培養物，稀釋比為約1∶25至1∶250。待這些細胞生長至600nm處光密度為0.6(「OD600」)後，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(「IPTG」)使其最終濃度為1mM，以通過失活lacI阻遏物誘導乳糖抑制子敏感性啟動子的轉錄。隨後再孵育細胞3至12小時。隨後通過離心收穫細胞，用50mM Tris緩衝液洗滌沉澱，於pH8.0及-20℃下貯存至純化。FGF-21突變蛋白表達進不溶性級分(即大腸桿菌包含體(或顆粒))中。儘管變異株之間的表達水平可能有所差異，一般檢測到的野生型(WT)FGF-21蛋白質水平為50mg/L。此後的純化步驟起始於這些顆粒的溶解以及經過四個層析步驟後的變體重摺疊。
為從大腸桿菌中純化FGF-21突變蛋白，將顆粒溶解於50mM Tris，pH9.0，7M尿素及1mM DTT中，調節pH至pH為11.0，室溫下振蕩1小時。隨後使用上述的相同緩衝液將蛋白質捕獲於Q-Sepharose柱上，並用線性梯度為0-400mM的NaCl洗脫。在室溫下用10mM DTT處理Q-Sepharose洗脫液2小時以還原所有的二硫鍵。然後將洗脫液稀釋10倍使緩衝液的濃度如下50mM Tris(pH 9.0)、7M尿素、10mM半胱氨酸、1mM DTT，蛋白質濃度為約250-500μg/ml。在還原條件下室溫再孵育2小時以獲得游離二硫鍵形式的蛋白質後，將洗脫液用20mM甘氨酸(pH 9.0)透析約48小時，以便形成正確的二硫鍵。
在Vydac C18柱上以0.1％TFA/0-50％CH3CN為流動相，使用反相HPLC層析法作為純化的起始步驟。該柱用於濃縮FGF-21或FGF-21突變蛋白，並除去汙染的外毒素。
此後的純化步驟是在1X PBS緩衝液(pH7.4)中在Superdex 35/600柱上進行大小排阻層析。在這一步FGF-21突變蛋白純度可達～95％。最後一步涉及在50mM Tris(pH 8.0)中行MonoQ層析，並利用線性梯度為0-300mM的NaCl洗脫，通常可以產生純度＞97％的蛋白質。
將上述四柱步驟純化方案用於所有FGF-21突變蛋白，並生產穩定的製品。
實施例2在HEK293EBNA細胞中表達和純化FGF-21突變蛋白此外，可以在如HEK293EBNA細胞(EdgeBiosystems，Gaiethersburg，MD)的哺乳動物細胞表達系統中生產FGF-21突變蛋白。將FGF-21突變蛋白亞克隆進特有表達載體中，所述載體是商業可得pEAK10在MCS的NheI和XbaI限制性位點間的改良。將編碼成熟FGF-21的cDNA序列與Igκ前導序列於框內融合，以促進目的產物在組織培養培養基中的分泌。該表達受CMV病毒強啟動子的驅動。利用如Fugene(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)的標準轉染試劑和適當數量的重組質粒，在適當的細胞密度下瞬時轉染HEK293EBNA細胞(單層或懸浮培養)。在37℃、5％CO2下的無血清培養基中孵育細胞，每天收集，共計5天。一般而言HEK293EBNA懸浮培養的表達水平為～30mg/L。在哺乳動物細胞中表達人FGF-21能夠產生天然的HPIP N-末端序列，即N-末端不具有甲硫氨酸殘基。已經發現用DPP-IV(豬腎，SIGMA St Louis)酶解處理HEK293EBNA細胞來源的FGF-21會在N-末端截去4個胺基酸。當在小鼠3T3-L1脂肪細胞測定法(見實施例4)中測定時，該FGF-21截短變體刺激葡萄糖攝取的水平與野生型FGF-21相當(表1)。
實施例3在酵母中表達和純化FGF-21突變蛋白還可用於生產FGF-21突變蛋白的表達系統為酵母，如巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)或釀酒酵母。商業可得的系統(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用具有強AOX1(醇氧化酶)啟動子的載體驅動重組蛋白的高水平表達，以在巴斯德畢赤酵母中生產FGF-21突變蛋白。或者可利用使用GAP基因(3-磷酸甘油醛脫氫酶)來源啟動子的載體進行高水平的組成型表達。多重拷貝的巴斯德畢赤酵母表達載體可以獲得將多重拷貝目的基因整合入基因組的菌株。增加重組巴斯德畢赤酵母菌株中目的基因的拷貝數能夠提高蛋白質表達水平。另一種酵母表達系統為釀酒酵母。其表達載體含有GAL1基因啟動子和增強子序列。由於其在乳糖誘導時的強大轉錄活性，GAL1啟動子是使用最為廣泛的酵母啟動子之一。
分析特徵(質譜分析)表明在巴斯德畢赤酵母中表達的FGF-21被截短(N-末端去除了多至4個胺基酸[HisProIlePro]，以下稱為des-HPIP)。當在小鼠3T3-L1脂肪細胞檢測(見實施例4)中測定時，該FGF-21的截短變體刺激葡萄糖攝取的水平可與野生型FGF-21相當(表1)。
實施例4小鼠3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取自美國典型培養物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)獲取3T3-L1脂肪細胞。在含有10％富鐵胎牛血清的Dulbecco′s改良的Eagle′s培養基的生長培養基(GM)中培養細胞。細胞達到匯合(標記為第0天)兩天後將細胞於含10％胎牛血清、10μg/ml胰島素、1μM地塞米松及0.5μM異丁基甲基黃嘌呤的分化培養基(DM)中暴露48小時，進行標準脂肪細胞分化。此後將細胞保存在含有10％胎牛血清和10μg/ml胰島素的分化後培養基中。
葡萄糖轉運測定-通過0.1mM 2-脫氧-D-[14C]葡萄糖積累測定，如下測量己糖攝取利用加熱至37℃且含有0.2％BSA的KRP緩衝液(136mMNaCl、4.7mM KCl、10mM NaPO4、0.9mM CaCl2、0.9mM MgSO4，pH7.4)將12孔平板上的3T3-L1脂肪細胞洗滌兩次，將細胞在含0.2％BSA的Leibovitz′s L-15培養基中於37℃室內空氣中孵育2小時，然後用含0.2％BSA緩衝液的KRP再洗滌兩次，並在不含(僅Me2SO)或含有渥曼青黴素的KRP-0.2％BSA緩衝液中於37℃室內空氣中孵育30分鐘。隨後加入胰島素至最終濃度為100nM，計15分鐘，最後4分鐘時測量2-脫氧-D-[14C]葡萄糖的攝取。從所有測量值中扣除存在10μM細胞鬆弛素B時測得的非特異性攝取。利用Pierce的二辛可寧酸測定來確定蛋白質的濃度。每一實驗常規測定三到四次攝取值。
根據野生型FGF-21的體外活性對體外效力進行標準化，前者標定為1.0並用作陽性對照。表1為本發明FGF-21突變蛋白的體外效力與野生型FGF-21的比較。如表1所示，相對於野生型，本發明的突變蛋白不同程度地保留了生物學效力。
表1

*在N-末端截去4個胺基酸，即des-HPIP**通過DPP-IV在N-末端酶解截去4個胺基酸，即des-HPIP實施例5Ob/ob小鼠模型採用雄性ob/ob小鼠肥胖症模型的一項研究監測了相對於載體組及胰島素對照組，FGF-21治療後的血漿葡萄糖水平和甘油三酯水平。對試驗組的雄性ob/ob小鼠(7周大)進行皮下注射純載體溶液(0.9％NaCl)、或FGF-21突變蛋白(0.125mg/kg)(0.1m1，每日一次)共計7天。於第7天最後一次化合物注射後1小時從鼠尾切口處收集血液，並利用標準方法測定血漿葡萄糖水平。FGF-21突變蛋白相對於載體對照降低血漿葡萄糖水平的能力如表2所示。表2的數據顯示了本發明突變蛋白與載體對照相比降低的血漿葡萄糖水平。FGF-21突變蛋白相對於載體對照降低血漿甘油三酯水平的能力如表3所示。
表2

表3


實施例6FGF-21突變蛋白的藥物穩定性在模擬生理及藥物製劑條件下分析本發明FGF-21突變蛋白的穩定性。為了模擬生理條件，在室溫(RT)、目的蛋白質濃度10mg/ml、pH7.4的PBS中分析突變蛋白的穩定性。如果通過大小排阻和/或反相層析法測得製品蛋白質的復原在室溫下可達到＞90％的復原率，則PBS中突變蛋白的溶解性/物理穩定性是符合要求的。表4和5所示的本發明突變蛋白滿足這一標準。
期望本發明突變蛋白的藥物製劑很可以成為為保存型多用製劑，因此，分析其與普通防腐劑間的相容性。為測試製劑相容性，於室溫下向含有約10mg/ml突變蛋白、pH7.4的PBS溶液中加入防腐劑m-甲酚(最終濃度3mg/ml，該濃度在中性pH條件下通常能夠滿足歐洲藥典B的防腐效力標準)。通過室溫下進行反相和大小排阻層析法測定層析主峰的蛋白質復原率，以初步評估防腐劑存在時的物理穩定性。進一步，以m-甲酚存在2小時後微粒相對於野生型FGF-21的平均直徑來表示通過DLS(動態光散射法)在37℃測量的聚集程度。較大的平均直徑對應於較高程度的蛋白質交聯和/或聚集。本發明第一和第二實施方案中突變蛋白相對於野生型FGF-21的防腐劑相容性(表示為顆粒的功能性平均直徑)如表4所示。所有的突變蛋白均在大腸桿菌中表達。
在PBS中穩定且與防腐劑相容的本發明突變蛋白即被認為相對於野生型FGF-21具有增強或改善的藥學性質。如表4所示，本發明相對於野生型FGF-21藥學特性增強的優選突變蛋白為L139E、A145E、L146E、I152E、Q156E、[I152E、S163E]、S163E、Q54E、[L21C-L33C、L118C-A134C]、L21C-L33C、A26C-K122C及L118C-A134C。
表4


*平均顆粒直徑表示目的蛋白濃度為10mg/ml、m-甲酚為3mg/ml，於37℃下孵育2小時後的蛋白質溶液。
序列表110伊萊利利公司120成纖維細胞生長因子21的突變蛋白130X-162801602170PatentIn版本3.32101211181212PRT213人4001His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val1 5 10 15Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His20 25 30Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser35 40 45Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln50 55 60Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly65 70 75 80Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg85 90 95
Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His100 105 110Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro115 120 125Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro130 135 140Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val145 150 155 160Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser165 170 175Pro Ser Tyr Ala Ser1802102211543212DNA213人4002caccccatcc ctgactccag tcctctcctg caattcgggg gccaagtccg gcagcggtac60ctctacacag atgatgccca gcagacagaa gcccacctgg agatcaggga ggatgggacg120gtggggggcg ctgctgacca gagccccgaa agtctcctgc agctgaaagc cttgaagccg180ggagttattc aaatcttggg agtcaagaca tccaggttcc tgtgccagcg gccagatggg240gccctgtatg gatcgctcca ctttgaccct gaggcctgca gcttccggga gctgcttctt300gaggacggat acaatgttta ccagtccgaa gcccacggcc tcccgctgca cctgccaggg360aacaagtccc cacaccggga ccctgcaccc cgaggaccag ctcgcttcct gccactacca420
ggcctgcccc ccgcactccc ggagccaccc ggaatcctgg ccccccagcc ccccgatgtg480ggctcctcgg accctctgag catggtggga ccttcccagg gccgaagccc cagctacgct540tcc 54權利要求
1.人成纖維細胞生長因子21(FGF-21)的突變蛋白或其生物活性肽，其包含用帶電荷的和/或極性但不帶電荷的胺基酸對以下一個或多個胺基酸的替換甘氨酸42、谷胺醯胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、亮氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺醯胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172，其中胺基酸編號依據SEQ ID NO1。
2.權利要求1的突變蛋白，其中帶負電荷的胺基酸選自天冬氨酸、穀氨酸及它們非天然存在的類似物。
3.權利要求1的突變蛋白，其中極性但不帶電荷的胺基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、谷胺醯胺及它們非天然存在的類似物。
4.權利要求1的突變蛋白，其中所述突變蛋白選自Leu139Glu、Ala145Glu、Leu146Glu、Ile152Glu、Gln156Glu、Ser163Glu、Ile152Glu、Ser163Glu及Gln54Glu。
5.權利要求4的突變蛋白，其中所述突變蛋白在N-末端截去多至4個胺基酸。
6.多核苷酸，其編碼權利要求1的突變蛋白。
7.權利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
8.表達載體，其含有權利要求7的DNA。
9.宿主細胞，其含有權利要求8的表達載體。
10.權利要求9的宿主細胞，其中所述宿主細胞為酵母細胞。
11.生產多肽的方法，其包括(a)在權利要求10的宿主細胞中表達所述多肽，並；(b)分離所述多肽。
12.藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求1的FGF-2l突變蛋白和可藥用載體，其中所述組合物用於治療具有肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中一種或幾種表現的病人。
13.治療病人的方法，其包括對所述病人施用治療有效量的權利要求1的FGF-21突變蛋白，其中所述病人具有選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症。
14.權利要求13的方法，其中所述病人表現為2型糖尿病。
15.人FGF-21突變蛋白或其生物活性肽，其包含用半胱氨酸對以下兩個或多個胺基酸的替換精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺醯胺27、谷胺醯胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、穀氨酸50、谷胺醯胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺醯胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、穀氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬醯胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中胺基酸編號依據SEQ ID NO1。
16.權利要求15的突變蛋白，其中所述突變蛋白選自Leu21Cys-Leu33Cys/Leu118Cys-Ala134Cys、Leu21Cys/Leu33Cys、Leu118Cys/Ala134Cys或Ala26Cys/Lys122Cys。
17.權利要求16的突變蛋白，其中所述突變蛋白在N-末端截去多至4個胺基酸。
18.權利要求17的突變蛋白，其中所述突變蛋白為des-HPIP-Leu118Cys/Ala134Cys。
19.多核苷酸，其編碼權利要求15的突變蛋白。
20.權利要求19的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
21.表達載體，其含有權利要求20的DNA。
22.宿主細胞，含有權利要求21的表達載體。
23.權利要求22的宿主細胞，其中所述宿主細胞為酵母細胞。
24.生產多肽的方法，其包括(a)在權利要求23的宿主細胞中表達所述多肽，並；(b)分離所述多肽。
25.藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求15的FGF-21突變蛋白和可藥用載體，其中所述組合物用於治療表現選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症的病人。
26.治療病人的方法，包括對所述病人施用治療有效量的權利要求15的FGF-21突變蛋白，其中所述病人表現選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖或代謝症候群中的一種或多種適應症。
27.權利要求26的方法，其中所述病人表現為2型糖尿病。
28.人成纖維細胞生長因子21的突變蛋白或其生物活性肽，其包含用帶電荷的和/或極性但不帶電荷的胺基酸對以下一個或多個胺基酸位置的替換甘氨酸42、谷胺醯胺54、精氨酸77、丙氨酸81、亮氨酸86、苯丙氨酸88、賴氨酸122、組氨酸125、精氨酸126、脯氨酸130、精氨酸131、賴氨酸139、丙氨酸145、亮氨酸146、異亮氨酸152、丙氨酸154、谷胺醯胺156、甘氨酸161、絲氨酸163、甘氨酸170或絲氨酸172；同時還有用半胱氨酸對以下兩個或多個胺基酸位置的替換精氨酸19、酪氨酸20、亮氨酸21、酪氨酸22、蘇氨酸23、天冬氨酸24、天冬氨酸25、丙氨酸26、谷胺醯胺27、谷胺醯胺28、丙氨酸31、亮氨酸33、異亮氨酸35、亮氨酸37、纈氨酸41、甘氨酸42、甘氨酸43、穀氨酸50、谷胺醯胺54、亮氨酸58、纈氨酸62、亮氨酸66、甘氨酸67、賴氨酸69、精氨酸72、苯丙氨酸73、谷胺醯胺76、精氨酸77、天冬氨酸79、甘氨酸80、丙氨酸81、亮氨酸82、甘氨酸84、絲氨酸85、脯氨酸90、丙氨酸92、絲氨酸94、苯丙氨酸95、亮氨酸100、天冬氨酸102、酪氨酸104、酪氨酸107、絲氨酸109、穀氨酸110、脯氨酸115、組氨酸117、亮氨酸118、脯氨酸119、天冬醯胺121、賴氨酸122、絲氨酸123、脯氨酸124、組氨酸125、精氨酸126、天冬氨酸127、丙氨酸129、脯氨酸130、甘氨酸132、丙氨酸134、精氨酸135、亮氨酸137、脯氨酸138或亮氨酸139，其中胺基酸編號依據SEQ IDNO1。
29.多核苷酸，其編碼權利要求28的突變蛋白。
30.權利要求29的多核苷酸，其中所述多核苷酸為DNA。
31.表達載體，其含有權利要求30的DNA。
32.宿主細胞，其含有權利要求31的表達載體。
33.權利要求32的宿主細胞，其中所述宿主細胞為酵母細胞。
34.生產多肽的方法，其包括(a)在權利要求33的宿主細胞中表達所述多肽，並；(b)分離所述多肽。
35.藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求28的FGF-21突變蛋白和可藥用載體，其中所述組合物用於治療表現選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症的病人。
36.治療病人的方法，其包括對所述病人施用治療有效量的權利要求28的FGF-21突變蛋白，其中所述病人表現選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症。
37.權利要求36的方法，其中所述病人表現為2型糖尿病。
38.權利要求28的突變蛋白，其中所述突變蛋白在N-末端截去多至4個胺基酸。
39.權利要求1的FGF-21突變蛋白的用途，用於製造治療選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症的藥物。
40.權利要求15的FGF-21突變蛋白的用途，用於製造治療選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症的藥物。
41.權利要求28的FGF-21突變蛋白的用途，用於製造治療選自肥胖症、2型糖尿病、胰島素抵抗、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、高血糖症或代謝症候群中的一種或多種適應症的藥物。
全文摘要
本發明涉及具有改良的藥學性質的人成纖維細胞生長因子21新突變蛋白，公開了蛋白質及各自的編碼核酸。本發明也包括用於擴增所述核酸序列並產生所述突變蛋白的載體和宿主細胞。同時還公開了治療2型糖尿病、肥胖症、代謝症候群以及降低重症病人的死亡率和發病率的方法。
文檔編號C12N1/19GK1890371SQ200480035794
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月1日 優先權日2003年12月10日
發明者J·M·比爾斯, C·C·弗賴伊, W·格萊斯納, S·李, R·拉特納查拉姆, J·尚, B·A·斯特裡弗勒, R·米卡諾維克 申請人:伊萊利利公司