黑色素生成抑制組合物的製作方法

2023-05-02 11:17:16 2

專利名稱：：黑色素生成抑制組合物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及具有抑制由於光照射等導致的發病的皮膚變黑的作用的黑色素生成抑制組合物，更詳細的是，涉及以醋酸菌的細胞內容物作為有效成分的黑色素生成抑制組合物以及使用這種組合物的美白方法。
背景技術：
：一直以來已知的是，為了防止由於紫外線等導致的皮膚變黑(曬黑)，防止斑點'雀斑的皮膚色素沉積，以及促進皮膚美白和美膚效果等，抑制皮膚表皮中黑色素的生成十分重要。黑色素的生成是由於色素細胞的活性化而顯著促進了黑色素產生能力而產生的，其機制並不完全清楚，但據推測這是通過酪氨酸酶的作用由酪氨酸變成二羥基苯丙氨酸(DOPA)，再由二羥基苯丙氨酸變成D0PA苯醌後，經過各種中間體產生的。其結果是提出了很多用於抑制黑色素生成的化妝品，例如，以往廣泛使用了混合了過氧化氳，過氧化鈉，過硼酸鋅，過硼酸鎂和過硼酸鈉等過氧化物的化妝品。但是，這些過氧化物在保持性，物理或化學穩定性等方面存在問題。近年來，開發了混合有半胱氨酸，羥基醌，曲酸，抗壞血酸(維生素C)等天然物質的化妝品。但是，實際狀況是，它們無論如何，都難以具有能夠充分滿足的保存性，穩定性和美白效果。而且，上述天然物質中的曲酸是通過醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡糖桿菌屬(Gluconobacter)等醋酸菌產生的物質，儘管有人提出了混合有曲酸生產性的醋酸菌的培養液(除去了醋酸菌)的具有美白效果和防止曬黑效果的美白化妝品(例如，參照專利文獻1)，但需要開發出安全性更高，效果更強的黑色素生成抑制組合物。專利文獻l:特開昭53-6432號公報
發明內容發明要解決的課題本發明的目的在於提供內用(經口攝取、注射等)和/或外用(皮膚塗布，貼布等)時安全性高且效果更強的黑色素生成抑制組合物，而且還在於提供使用這種黑色素生成抑制組合物的防止曬黑的方法。用於解決課題的方法鑑於上述課題，本發明人著眼於一直作為釀造制醋菌等使用的認識到高安全性的醋酸菌。此外，已知醋酸菌自古以來就與人們的飲食生活深深相關，在食醋製造之外，例如歐洲的傳統食品裏海酸奶(Caspianseayogurt)中也含醋酸菌，也有長期的食用歷史。而且，由於醋酸菌在食醋發酵工序中的發酵終止後，經過過濾，再被廢棄，因此可以便宜地獲得。本發明人從在這種醋酸菌的細胞內容物中看到了強黑色素生成抑制作用，確認具有防止曬黑效果，從而完成本發明。也就是說，權利要求l中涉及的本發明提供黑色素生成抑制組合物，其特徵在於含有醋酸菌的細胞內容物作為有效成分。而且，權利要求2中涉及的本發明提供權利要求1所述的黑色素生成抑制組合物，其^皮製備成適於內用。此外，權利要求3中涉及的本發明提供權利要求1所述的黑色素生成抑制組合物，其被製備成適於外用。此外，權利要求4中涉及的本發明提供美白方法，其特徵在於內用和/或外用權利要求l-3任一項所述的黑色素生成抑制組合物。而且，本發明和以往所知具有美白效果的醋酸菌在培養液中產生的曲酸不同，是以醋酸菌的細胞內容物作為有效成分。4發明的效果本發明的醋酸菌的細胞內容物通過內用和/或外用能夠發揮強黑色素生成抑制作用，因此通過本發明能夠提供安全性高、效果強的黑色素生成抑制組合物以及美白方法。圖1:是改良型布羅諾(Bronaugh)擴散腔的模式圖。具體實施例方式作為本發明中使用的醋酸菌，沒有特別限制，例如，可以例舉屬於葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter)，葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，醋桿菌屬(Acetobacter)，Asaia屬或Acidomonas屬等的醋酸菌。更詳細的是，首先，作為葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸菌，可以例舉漢氏葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterhansenii)，重氮營養葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)，Gluconacetobacterintermedius，Gluconacetobactersacchari，木糖葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterxylinus)，歐洲葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobactereuropaeus)，月良從葡萄酸醋桿菌(Gluconacetobacteroboediens)等。接著，作為葡糖酸醋桿菌屬(Gluconacetobacter)的醋酸菌，可以例舉弗氏葡萄桿菌(Gluconacetobacterfrateurii)，蠟狀葡糖桿菌(Gluconacetobactercerinus)等。此外，作為醋桿菌屬(Acetobacter)的醋酸菌，可以例舉Acetobactertropicalis，Acetobacterindonesiensis,Acetobactersyzygii，Acetobactercibinongensis，Acetobacterorientalis，巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)，Acetobacterorleanensis，Acetobacterlovaniensis，醋化醋桿菌(Acetobacteraceti)，果實醋桿菌(Acetobacterpomorum),Acetobactermalorum等。此夕卜，作為Asaia屬的醋酸菌，可以例舉Asaiabogorensis,Asaiasiamensis等。而且，作為Acidomonas屬的醋酸菌，可以例舉Acidomonasmethanolica等。此外，作為醋酸菌，除上述外，還可以適當使用可以在食醋製造或酸奶等發酵食品中使用的醋酸菌，從自然界分離的並且已經在微生物保藏機構中保藏的可以發放的保藏菌林等。而且，由於醋酸菌可以在醋酸發酵中使用而且在椰果(Natadecoco)，裏海酸奶，紅茶菌等中有食用歷史，因此認為其安全性高，尤其是，由於在食醋發酵工序中在發酵後通過過濾而被分離，再被廢棄，因此還可以大量便宜地獲得。權利要求1中涉及的本發明中，使用從上述醋酸菌中取出的細胞內容物構成黑色素生成抑制組合物，細胞內容物的製備，可以使用例如通過對清洗的醋酸菌進行破碎處理使細胞內容物漏出，以懸浮狀態含有破碎細胞片的懸浮液(以下有時也稱為懸浮液)等，而且，也可以使用通過用離心分離機等使該懸浮液離心分離，除去細胞殘渣獲得的上清液(以下有時也稱為上清液)。而且，還可以有效利用對這些懸浮液和上清液進行濃縮，使之乾燥後的物質。醋酸菌的破碎處理可以按照常規方法，例如在將醋酸菌懸浮於蒸餾水，磷酸緩衝液，檸檬酸援衝液等各種緩衝液等後，用超聲波式破碎才幾，法式沖床(Frenchpress)等高壓式石皮碎機來實施。而且，在上述懸浮液和上清液的製備中，除了水和各種緩衝液之外，還可以聯合使用丙酮，乙醇，甲醇，丙醇，異丙醇，丁醇等各種親水性有機溶劑。而且，權利要求1涉及的本發明中的黑色素生成抑制效果，可以通過下述試驗法進4於確認。也就是說，可以利用對從人取出的皮膚切片進行UVA照射使黑色素沉澱的試驗系統。該試驗系統在設想為內用時，可以通過對從人取出的皮膚切片正下方添加評價物質來驗證效果。此外，在設想為外用時，可以通過對從人取出的皮膚切片表面添加評價物質來驗證效果。使用醋酸菌的細胞內容物的黑色素生成抑制組合物可以按照常規方法，例如如前所述將醋酸菌懸浮於蒸餾水等中後，通過離心分離經超聲波破碎處理的懸浮液，製備出除去細胞殘渣的上清液。而且，還可以根據需要對該上清液進行濃縮。這些上清液和濃縮物可以直接作為黑色素生成抑制組合物來使用，而且還可以通過液相色鐠法或逆流分布法等分離純化黑色素生成抑制物質，並且收集這些物質，將其作為黑色素生成抑制物質使用。權利要求1涉及的本發明的黑色素生成抑制組合物的形態，可以作為溶解於水、醇、含水醇等中的溶液的形態，以及通過對其進行乾燥獲得的粉末的形態，或者通過將其成形獲得的片劑的形態等來使用。權利要求2涉及的本發明是被製備成適於內用的權利要求1記栽的黑色素生成抑制組合物。內用時，可以是美容輔助食品，食品，藥品等(口服劑，注射劑等)等，其形態沒有特別限制。例如，作為內用時的食品形態，具體可以例舉混合於以西紅柿，胡蘿蔔等作為原料的蔬菜汁，蘋果，菠蘿，葡萄柚，橙子，桃等為原料的果汁，或者蔬菜汁和果汁的混合品，醇飲料，牛奶，酸奶等乳製品，運動飲料，咖啡，紅茶，綠茶，烏龍茶等茶製品，或者黑醋，穀物醋，米醋，玄米醋，黑醋，醇醋，蘋果醋和葡萄醋等以水果作為原料的水果醋，含有蔬菜作為原料的蔬菜醋等的食醋製品，糖果，口香糖，果凍，冰洪淋，小甜餅等點心類；主食麵包，米飯，面等主食等中。權利要求3中涉及的本發明是被製備成適於外用的權利要求1中記載的黑色素生成抑制組合物。外用時，其形態可以是貼布劑，塗布劑等，其形態沒有特別限定。例如，作為外用時的塗布劑的形態，具體可以例舉混合在分別混合了丙三醇，纖維素等賦形劑，羥甲基纖維素，阿拉伯樹膠等增稠劑以及聚環氧乙烷，山梨聚糖脂肪酸酯等表面活性劑的化妝水，化妝乳劑，乳液，美容塗敷劑(pack)等基礎化妝品，粉底等彩妝化妝品，洗髮液，護髮素，沐浴液等化妝用品，入浴劑(bathagent)等中。通過以上述形態聯合使用本發明的黑色素生成抑制組合物，含有其它天然物來源的功能成分，可以預期累加效應乃至協同效應。作為本發明的黑色素生成抑制組合物的醋酸菌的細胞內容物的給藥量，根據該細胞內容物中活性成分的濃度等而不同，一般在內用時，成人每天為0.OOlmg~100g,優選在0.lmg~10g。在外用時，每100cm2皮膚為0.001mg~100g,優選在0.01mg~10g。在內用和外用同時給藥時，內用為成人每天0.001mg~lOOg，並且，外用為每100cii^皮膚為0.001mg~lOOg，優選內用為成人每天0.01mg~10g，並且，夕卜用為每100cm2皮膚為0.Olmg-lOg。權利要求4涉及的本發明為美白方法，其特徵在於內用和/或外用權利要求l-3任一項記載的黑色素生成抑制組合物。當防止曬黑進行美白時，能夠內用或者外用權利要求l-3任一項記載的黑色素生成抑制組合物，還能夠兩種方式一起使用。在內用或者外用時，醋酸菌的細胞內容物的給藥量等如上所述。權利要求4涉及的本發明中，能夠通過內用或者外用權利要求1-3任一項記栽的黑色素生成抑制組合物，可以防止曬黑。實施例接下來，通過實施例更詳細地說明本發明，本發明的範圍不受這些實施例的任何限制。實施例l(懸浮液以及上清液的大量製備)作為醋酸菌林，使用木糖葡糖酸醋桿菌NBRC15237(GluconacetobacterxylinusNBRC15237)林。該菌林保藏於獨立行政法人製品評價技術基礎機構生物技術本部生物遺傳資源部門(千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，是可以發放的醋酸菌。用高速離心機(8000rpm，20分鐘)對使用該醋酸菌的醋酸發酵中的IO千升醋酸發酵液收集菌體，獲得了10kg溼菌體。將獲得的10kg溼菌體懸浮於35升水中，用法式衝床壓力式細胞破碎機，在10000psi的破碎壓力破碎後，製成懸浮液。然後，用高速離心機(8000rpm，20分鐘)除去荻得的40kg懸浮液的細胞殘渣，獲得30kg上清液。實施例2(設想內用時的黑色素生成抑制效果)為了驗證作為內用劑的效果，按照下述(l)-(4)的順序，評價實施例1中製備的懸浮液或上清液的黑色素生成抑制效果。(1)將從人取出的皮膚切片(informedconsent完成)裝入改良型布羅諾擴散腔(概略示於圖1)。在皮下側的培養液中按預定濃度添加實施例1中製備的懸浮液或上清液。(2)添加懸浮液或上清液後，3小時後，按20J/cm2的強度對皮膚切片照射紫外線A波(UV-A)40秒。而且，將矽酸玻璃夾在燈與試樣之間。(3)對皮膚切片進行器官培養。而且，培養基採用DMEMab培養基(+)10%FBS(胎兒牛血J求)。(4)24小時後，通過對黑色素進行DOPA染色，根據柱狀圖分析評價黑色素生成程度(11=2~3)。此外，黑色素濃度用DOPA染色度pixel/皮膚基底層距離mm表示。以上結果示於表1和表2。其結果是，在設定內容的試驗系中，可以在懸浮液和上清液中確認存在抑制黑色素生成的作用。9表l設想內用時的懸浮液的黑色素生成抑制效果試驗tableseeoriginaldocumentpage10表2設想內用時的上清液的黑色素生成抑制效果試驗tableseeoriginaldocumentpage10實施例3(設想為外用時的黑色素生成抑制效果)為了驗證作為外用劑的效果，按照下述(l)-(4)的順序，評價實施例1中製備的懸浮液或上清液的黑色素生成抑制效果。(1)將從人取出的皮膚切片(informedconsent完成)裝入改良型布羅諾擴散腔(概略示於圖1)。按預定濃度將實施例1中製備的懸浮液或上清液溶解於水中再添加到皮膚表面上。(2)添加懸浮液或上清液後，3小時後，按20J/cm2的強度對皮膚切片照射紫外線A波(UV-A)40秒。而且，將矽酸玻璃夾在燈與試樣之間。(3)對皮膚切片進行器官培養。而且，培養基採用DMEMab培養基(+)10%FBS(胎兒牛血球)。(4)24小時後，通過對黑色素進行DOPA染色，根據柱狀圖分析評價黑色素生成程度(n=2~3)。此外，黑色素濃度用D0PA染色度pixel/皮膚基底層^巨離mm表示。以上結果示於表3和表4。其結果是，不僅在內用而且在外用給藥時，可以在懸浮液和上清液中確認存在抑制黑色素生成的作用。表3設想外用時的懸浮液的黑色素生成抑制效果試驗tableseeoriginaldocumentpage11表4設想外用時的上清液的黑色素生成抑制效果試驗tableseeoriginaldocumentpage11實施例4(設想內用/外用聯合施用時黑色素生成抑制效果試驗)為了驗證作為內用劑和外用劑聯合使用的效果，按照下述(l)~(4)的順序，評價實施例1中製備的懸浮液和上清液的黑色素生成抑制效果。(l)將從人取出的皮膚切片(informedconsent完成)裝入改良型布羅諾擴散腔(概略示於圖1)。在皮下側(內用)的培養液中按預定濃度添加實施例1中製備的懸浮液或上清液。此外，將實施例1製備的懸浮液按照預定濃度溶解於水中，再添加到皮膚側(外用)。並且，作為聯合施用，按預定濃度在皮下側(內用)的培養液中添加實施例l製備的上清液，將實施例1製備的懸浮液按照預定濃度溶解於水中，再添加到皮膚側(外用)(2)分別添加懸浮液和上清液後，3小時後，按20J/cm"的強度對皮膚切片照射紫外線A波(UV-A)40秒。而且，將矽酸玻璃夾在燈與試樣之間。(3)對皮膚切片進行器官培養。而且，培養基採用DMEMab培養基(+)10%FBS(胎兒牛血球)。(4)24小時後，通過對黑色素進行DOPA染色，根據柱狀圖分析評價黑色素生成程度(n=2~3)。此夕卜，黑色素濃度用DOPA染色度pixel/皮膚基底層距離mm表示。以上結果示於表5。根據表5的結果，懸浮液或上清液的單獨施用中確認存在抑制黑色素生成的作用，與此同時通過聯合施用獲得了更為顯著的黑色素生成抑制效果。tableseeoriginaldocumentpage12實施例5(片劑的製造)用高速離心機(8000rpm，20分鐘)對10千升的醋酸發酵液收集菌體，獲得10kg的溼菌體。將10kg溼菌體懸浮於35千升水中，用法式沖床壓力式細胞破碎機，用10000psi的破碎壓力破碎，破碎形成的物質形成醋酸菌的懸浮液。然後，用高速離心機(8000rpm，20分鐘)除去獲得的醋酸菌的40kg懸浮液的細胞塵(celldebris)，獲得30kg上清液。用大型冷凍乾燥機對獲得的30kg上清液進行冷凍減壓千燥，獲得了約50g的乾燥菌體。加入獲得的乾燥物lg(0.7重量W,結晶纖維素35g(26.9重量％)，乾燥玉米澱粉67g(51.5重量％)，乳糖22g(16.9重量％)，硬脂酸鈣2g(1.5重量。/。)和作為結合劑的聚乙烯吡咯烷酮3g(2.3重量％)，混合粉末化後，填充於硬明膠膠嚢中。可以期待上述製備的片劑作為黑色素抑制組合物可以有效經口攝取。實施例6(果凍的製造)用高速離心機器(8000rpm，20分鐘)對醋酸發酵液10千升的收集菌體，獲得了溼菌體10kg。使獲得的溼菌體10kg分散於等量的蒸餾水。在通過使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通過高壓均化器(20000psi)實施細胞^f皮壞處理獲得懸浮液後，用大型冷凍乾燥機冷凍減壓乾燥，獲得了1.5kg的乾燥菌體粉末。均勻混合獲得的乾燥菌體粉末8g(0.8重量％)，砂糖250g(25重量%)，角叉菜膠1.6g(0.16重量％),刺槐豆膠O.8g(0.08重量％)，黃原膠0.8g(0.08重量％),獲得粉狀混合物。用鍋計量300g的水，溶解黑砂糖30g(3.0重量％)，再混合還原糖漿150g(15重量％),加入先前獲得的粉狀混合物，一邊攪拌使其不成塊狀，再混合。將它們攪拌均勻，加入餘下的水258.8g，加溫。溶液溫度在85。C加熱IO分鐘溶解後，用流水冷卻，獲得了果凍食品。上述製備的果凍可以作為黑色素生成抑制組合物，期待可有效經口攝取。實施例7(飲料的製造)用高速離心機器(8000rpm，20分鐘)對10千升醋酸發酵液收集菌體，獲得了溼菌體10kg。使獲得的溼菌體10kg分散於IOOL食醋中。使分散的醋酸菌分散液3次通過高壓均化器(20000psi),實施細胞破壞處理。將該溶液分注於容積為500ml的瓶中，通過加溫至75'C進行殺菌，獲得了食醋飲料。上述製備的飲料可以作為黑色素生成抑制組合物，期待可有效經口攝取。實施例8(化妝水的製造)用高速離心機器(8000rpm，20分鐘)對醋酸發酵液10千升的收集菌體，獲得了溼菌體10kg。使獲得的溼菌體10kg懸浮於35升水中，用法式衝床壓力式細胞破碎機，用10000psi的破碎壓力破碎，破碎形成的物質形成醋酸菌的懸浮液。然後，用高速離心機(8000rpm,20分鐘)除去獲得的醋酸菌的40kg懸浮液的細胞塵，獲得30kg上清液。混合獲得的lg上清液(2.0重量％)，丙三醇1.5g(3.0重量％)，1.3丁二醇2.5g(5.0重量％)，榲梓(PYRUSCYDONIA)籽提取物4.0g(8.0重量%)，純化水37.75g(75.5重量％)，再混合聚氧化乙烯山梨聚糖月桂酸酯0.6g(1.2重量°/),乙醇2.5g(5.0重量％)，對氧基苯曱酸甲酯0.lg(O.2重量％)，香料0.05g(0.1重量％),混合溶液，製成化妝水。可以期待上述製備的化妝水作為黑色素抑制組合物可以有效塗布。實施例9(化妝乳劑的製造)用高速離心機器(8000rpm，20分鐘)對醋酸發酵液10千升的收集菌體，獲得了溼菌體10kg。使獲得的溼菌體10kg分散於等量的蒸餾水。在通過使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通過高壓均化器(20000psi)實施細胞^5皮壞處理獲得懸浮液後，用大型冷凍乾燥機冷凍減壓乾燥，獲得了1.5kg的乾燥菌體粉末。在75度加溫混合獲得的乾燥物lOg(lO.0重量％)，黃原膠0.lg(0.1重量％)，甘油1.0g(1.0重量％)，1,3丁二醇5.0g(5.0重量％)，對氧基苯甲酸甲酯0.2g(0.2重量％)，純化水55.0g(55.0重量％)，再對在75度加溫溶解了荷荷巴油3.0g(3.0重量W，角鯊烯2.0g(2.0重量％)，甲基聚矽氧烷0.5g(0.5重量％)，硬脂醇0.5g(0.5重量％)，三己酸甘油酯12.5g(12.5重量％)，單硬脂酸甘油酯0.5g(0.5重量％)，單硬脂酸二甘油酯1.5g(1.5重量％)，單硬脂酸十甘油酯3.0g(3.0重量％)，對氧基苯曱酸丙酯0.lg(0.1重量％)的溶液進行混合乳化，攪拌的同時冷卻到50°C，添加0.lg(O.1重量％)各種香料，製成化妝乳劑。上述製備的化妝乳劑作為黑色素生成抑制組合物能夠期待可以有效塗布。產業上利用的可能性本發明的醋酸菌的細胞內容物，通過內用和/或外用可以發揮強的黑色素生成抑制作用，因此通過本發明能夠提供安全性高且效果強的黑色素生成抑制組合物以及美白方法。因此，本發明能夠廣泛應用於食品領域，美容領域，化妝品領域等。權利要求1、黑色素生成抑制組合物，其特徵在於含有醋酸菌的細胞內容物作為有效成分。2、權利要求1所述的黑色素生成抑制組合物，其被調製成適於內用。3、權利要求1所述的黑色素生成抑制組合物，其被調製成適於外用。4、美白方法，其特徵在於內用和/或外用權利要求l-3任一項所述的黑色素生成抑制組合物。全文摘要本發明的目的在於提供內用(經口攝取、注射等)和/或外用(皮膚塗布、貼布等)時安全性高且效果更強的黑色素生成抑制組合物，而且還在於提供使用這種黑色素生成抑制組合物的美白方法。本發明提供特徵在於含有醋酸菌的細胞內容物作為有效成分的黑色素生成抑制組合物。而且，本發明還提供特徵在於內用和/或外用前述黑色素生成抑制組合物的美白方法。文檔編號A61K35/74GK101641108SQ20078005199公開日2010年2月3日申請日期2007年3月19日優先權日2007年3月19日發明者立元秀樹申請人:味滋康集團有限公司