萊姆氏結合組合物及其用途的製作方法

2023-05-01 20:27:46

專利名稱：萊姆氏結合組合物及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及萊姆(Lyme)氏疏螺旋體病(布氏疏螺旋體抗原)組合物，尤其是結合組合物及製備和應用該組合物的方法，特別是用於獸醫。除了一種或多種布氏疏螺旋體抗原外，此組合物可包括一種額外的病原體抗原如犬、貓或馬病原體，例如來自下列至少之一的抗原狂犬病毒、犬瘟熱病毒、腺病毒、冠形病毒、副流感病毒、細小病毒、FeLV、貓皰疹病毒、馬流感病毒、馬皰疹病毒等。當此組合物施用於宿主時，它們優先誘導針對萊姆氏疏螺旋體病(布氏疏螺旋體)感染及組合物中其它抗原的免疫反應。組合物在包括馬和狗的動物內誘發針對萊姆氏疏螺旋體病布氏疏螺旋體的長期免疫反應(應答)並對動物提供保護或誘發免疫反應。結合組合物中無效能干擾。
本發明進一步涉及製備和應用這樣的組合物的方法。
本發明另外涉及由此組合物誘發的，從動物或細胞培養物中分離到的用於製備診斷試劑盒的抗體，用於檢測布氏疏螺旋體抗原或萊姆氏疏螺旋體病或另一種病原體抗原或另一種抗原的實驗。
背景技術：
萊姆氏疏螺旋體病是由Ixodes ricinus複合體的蜱傳播的多系統疾病。螺旋體布氏疏螺旋體sensu lato是萊姆氏疏螺旋體病的病原體，該病是美國最常見的節肢動物傳播的疾病並在中歐流行(Barbour等，1993)。儘管在早期可通過抗生素療法治療，若任其發展，則出現心臟、神經和關節異常。現在正進行萊姆氏疏螺旋體病人疫苗的研究。布氏疏螺旋體的外表面脂蛋白OspA是目前發展疫苗最重要的候選分子。已知重組OspA脂蛋白(rOspA)可在小鼠內針對布氏疏螺旋體攻擊誘發保護性免疫反應(Fikrig等，1990；Erdile等，1993；USSN08/373,455)。在美國OspA目前作為皮下施用的疫苗正進行人體實驗(Keller等，1994)。
上文引用的申請WO93/08299和PCT/US92/08697涉及重組OspA(rOspA)疫苗，尤其是脂化的rOspA以及表達編碼OspA的DNA並分離脂化rOspA的方法。上文引用的美國專利5,582,990和5,523,089及申請WO90/04411涉及編碼OspA的DNA、包括rOspA及其脂化形式OspA的胺基酸序列、包括rOspA及其脂化形式的合成OspA、含OspA或合成OspA的組合物及使用該組合物的方法。並且，其它上文引用的申請涉及編碼其它疏螺旋氏體或其它OspA的DNA、編碼有用的OspA或其它Osp片段的DNA、其胺基酸序列、包含這樣片段或其它Osp的組合物以及使用這些組合物的方法。來自此處引用的涉及布氏疏螺旋體文件的DNA可用美國專利5,582,990和5,523,089或PCT/US92/08697的方法製備用於本發明的OspA，其它疏螺旋氏體抗原或Osp或其片段。用於本發明的DNA和抗原也參照分子微生物學(1989)；3(4)，479-486。
本領域的具體問題涉及由於蜱叮咬引起的家畜的布氏疏螺旋體感染。例如，狗和馬很容易受蜱叮蛟引起萊姆氏疏螺旋體病，其主人在太晚的時候才意識到感染(由於皮毛，蜱叮咬傷口周圍說明問題的圓環不被察覺、狗和馬不能抱怨由感染引起的關節疼痛等，或主人注意不到動物的症狀。另外，擔憂它可能傳播給人。
本領域進一步的問題涉及接種策略。更具體地，當接種家畜時，優選地在一個「雞尾酒」或多價組合物中施用多種抗原，例如減少注射和看獸醫的次數。
目前沒有或未聽說過萊姆氏疏螺旋體結合或「雞尾酒」或多價疫苗或免疫性或免疫原性組合物(在一種組合物中結合布氏疏螺旋體抗原和其它抗原，具體地對於犬的)。
本領域的進一步的問題，尤其是關於多價組合物涉及「效能干擾」，即結合組合物中的一種或多種抗原不能維持或獲得效能。據認為由於其它抗原的存在，導致了當施用時，幹擾了抗原在宿主如狗體內的刺激免疫的、抗原的、抗體或保護反應。例如，與其它抗原結合的狂犬病毒抗原受到了或幹擾了此組合物中其它抗原免疫的、抗原的、抗體或保護反應，尤其是當組合物施用於狗時。更具體地，諸如狂犬病毒抗原和鉤端螺旋體抗原與其它一種或多種抗原共同施用時將幹擾由這些抗原誘發的反應。鉤端螺旋體確實能干擾OspA。然而，對於其它宿主，如貓，有已知的結合疫苗。也許，不希望被任何理論約束，「效能干擾」產生的原因是犬生物系統的獨特性或由目前已知的抗原或由其結合引起的貓生物系統反應。
不管這些理論，據本發明人所知，以前沒有已知的含其它抗原組合物的，尤其是用於犬且不表現出效能干擾的萊姆氏疏螺旋體病結合。需要尤其是犬用的萊姆氏疏螺旋體病結合。如果製備在犬中無效能干擾的萊姆氏疏螺旋體病結合(與其它抗原)，確實令人驚奇，意想不到且不明顯，尤其因為如目前知識和效能干擾所顯示的，不可能簡單地合併「抗原組合物」來製備有用的結合或「雞尾酒」組合物。
另外，如果這樣的萊姆氏疏螺旋體病抗原雞尾酒組合物給犬提供長期保護；以及通過母源性免疫給小狗提供對萊姆氏疏螺旋體病保護，將是有益的。如熟練技術人員所知的，母源性免疫是新生一出生從母體獲得或通過護理獲得的免疫，這種免疫經過一段時間後從新生幾體內消逝，從而使新生兒易感。而且，新生兒體內存在母源性抗體使新生兒接受抗原組合物如，疫苗時不獲得保護反應，這意味著在考慮施用抗原或疫苗組合物前，新生兒必需進入一段無免疫或免疫很少的時期，即對危險的易感性。至於母源性免疫，參照1994年8月16日授予的美國專利5,338,683，在此引用作為參考。
因此，選擇性接種策略是可取的。
如果用於在犬中無效能干擾的結合「雞尾酒」組合物的、可用於其它宿主如貓、馬等的組合物並且在狗中及儘管母源性免疫在小狗中也能提供長期保護的布氏疏螺旋體抗原是重組抗原，將更有利、更令人驚奇、更意想不到。
具體地，據認在本領域以前沒有教過或建議過給對萊姆氏疏螺旋體病易感的哺乳動物細胞-尤其是家畜如狗、貓或馬施用含布氏疏螺旋體抗原如尤其如在此公開的OspA結合組合物。發明目的和概述通過抗體產生速度和對布氏疏螺旋體感染的保護評估，表明用單價萊姆氏疏螺旋體病(布氏疏螺旋體)疫苗(命名為Ly)接種狗是安全有效的。
研究表明，含有10μg/ml OspA的萊姆氏疫苗(根據WO93/08299及美國專利5,582,990和5,523,089製備的，在此引用作為參考)給狗提供了針對蜱攻擊的明顯保護，這是通過螺旋體增殖減少和臨床疾病的阻止評估的。而且當接種後五至六周攻擊時，疫苗誘導的免疫反應仍然明顯。已證明單價疫苗十分安全，用高劑量的OspA疫苗重複接種有萊姆氏疏螺旋體病臨床病症的狗，疾病不會惡化。
然而，本領域更為顯著的進展是提供了安全有效的結合萊姆氏疫苗。與另一種犬抗原同時施用時，OspA疫苗無幹擾是更為顯著的進展。此處的結果表明間隔進行的皮下接種導致顯著的抗體產生。被接種疫苗者體內誘導的抗體水平與接受單價疫苗的狗中的相似；此水平可以保護被接種疫苗者，包括長期的對抗疏螺旋體感染的蜱攻擊。
因為證據表明馬對布氏疏螺旋體感染天然易感，提供在馬中產生明顯的針對布氏疏螺旋體抗原如OspA的抗體的馬萊姆氏疫苗是顯著的進展。
本發明的一個目標是提供結合布氏疏螺旋體如OspA疫苗或免疫性的或抗原組合物，尤其是此組合物在狗，馬或其它家畜中誘導保護。
本發明的另一個目標是提供組合萊姆氏疏螺旋體病疫苗或免疫性或抗原組合物，其中結合中的抗原不產生明顯的效能干擾。
本發明進一步的目標是提供一施用給狗、馬或其它家畜就產生血清反應的萊姆氏疏螺旋體病疫苗或免疫性的或抗原組合物。
相應地，本發明提供含分離純化的布氏疏螺旋體抗原、至少一種額外的布氏疏螺旋體以外的哺乳動物病原體抗原的以及最佳地藥學或獸醫學上接受的載體的免疫性抗原或疫苗組合物。
在組合物中，分離純化的布氏疏螺旋體抗原包含分離純化的OspA。
進一步地，組合物中的分離純化的OspA是基本上不含脂多糖和其它細菌蛋白的分離純化的，脂化的重組OspA。
組合物可以不含任何免疫原性的增強佐劑。
組合物中額外的抗原選自群體犬病原體抗原、馬病原體抗原和貓病原體抗原。
在某些優選的實施方案中，組合物中額外的抗原是犬病原體或馬病原體抗原。
額外的抗原可選自群體，狂犬病毒抗原、犬瘟熱病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原、細小病毒抗原及其混合物。
在組合物的某些優選實施方案中，額外的抗原是狂犬病毒抗原；或額外的抗原含犬瘟熱病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原和細小病毒抗原。
額外抗原可以是修飾的或減毒的活病毒，如，減毒的CDV、CAV和CAV2，冠形病毒、副流感病毒和/或細小病毒。
本發明進一步包含了給哺乳動物施用前述的組合物，在對萊姆氏疏螺旋體病和布氏疏螺旋體以外的哺乳動物病原體易感的哺乳動物內誘發免疫反應的方法。
哺乳動物可以是馬，額外抗原是馬病原體的。哺乳動物可以是狗或小狗，額外抗原是犬病原體的。
進一步地，本發明提供了誘發馬針對布氏疏螺旋體免疫反應的方法包括給馬施用含分離純化的布氏疏螺旋體OspA的組合物。
更進一步地，本發明提供了誘發針對布氏疏螺旋體免疫反應的方法，包括給狗或小狗施用含分離純化的布氏疏螺旋體OspA的組合物。
在這些方法中，OspA是基本上不含脂多糖和其它細菌蛋白的分離純化的脂化的重組OspA。並且，在這些方法中，組合物可以不含任何疫原性的增強性佐劑。
本發明也包含製備前述組合物的方法，包括製備冷幹形式的額外抗原、製備液態的布氏疏螺旋體抗原及用布氏疏螺旋體抗原重新水化額外抗原。
用含編碼全長野生型布氏疏螺旋體OspA脂蛋白基因的質粒轉化宿主生物並製備重組布氏疏螺旋體OspA脂蛋白，然後在非變性條件下從該宿主生物的裂解液中純化基本上無其它細菌蛋白和脂多糖的該重組布氏疏螺旋體OspA脂蛋白從而獲得布氏疏螺旋體OspA。
例如，用於本發明的是含純化的、保持脂化的重組布氏疏螺旋體OspA脂蛋的分離的脂蛋白；基本上無其它細菌蛋白和脂多糖，並且純化的重組布氏疏螺旋體OspA脂蛋白是通過包括下列步驟的方法得到的用含編碼全長野生型布氏疏螺旋體OspA脂蛋白基因的質粒轉化宿主生物並製備重組布氏疏螺旋體OspA脂蛋白。
在非變性條件下從該宿主生物的裂解液中純化基本上無其它細菌蛋白和脂多糖的重組布氏疏螺旋體OspA脂蛋白以得到脂化的且當施用於哺乳動物宿主時對其有免疫原性的純化的重組布氏疏螺旋體脂蛋白。
重組布氏疏螺旋體OspA的純化可通過下列步驟進行裂解宿主生物細胞以得到裂解的細胞；用比細菌和其它蛋白更優先選擇性地溶解布氏疏螺旋體OspA脂蛋白並在約35℃至40℃的溫和溫度條件下使去汙劑相分離的表面活性物質處理溶解的細胞以得到經處理的裂解細胞；通過分相將經處理的裂解細胞分成含溶解了布氏疏螺旋體OspA脂蛋白的去汙劑相。含細菌和其它蛋白的液相及含細胞殘渣的固相；將去汙劑相與固相和液相分開；在使布氏疏螺旋體OspA脂蛋白以外的蛋白與層析柱結合的條件下使去汙劑相與層析柱接觸；並且回收含有無結合蛋白的布氏疏螺旋體OspA脂蛋白的經過第一個層析柱的流過液。
通過使去汙劑相與層析柱在約pH7.5時接觸可純化重組布氏疏螺旋體OspA。
選擇性地，通過製備由全長野生型疏螺旋體opsa基因編碼的分離純化重組OspA脂蛋白的方法獲得OspA，它包括從轉化了含OspA基因質粒的宿主生物誘導疏螺旋體OspA脂蛋白，裂解宿主生物細胞，用比細菌和其它蛋白更優先選擇性地溶解布氏疏螺旋體OspA脂蛋白且在溫和條件下使去汙劑相分離的表面活性物質處理裂解的細胞，將相分成含溶解了布氏疏螺旋體OspA脂蛋白的去汙劑相、含細菌和其它蛋白的液相及含細胞殘渣的固相，將去汙劑相與固相和液相分開，並且通過下列方法純化無疏螺旋體OspA脂蛋白以外蛋白和脂多糖的去汙劑相(a)在使用布氏疏螺旋體OspA脂蛋白以外的蛋白與第一個層析柱結合的條件下使去汙劑相與第一個層析柱接觸；並且(b)回收含有無結合蛋白的布氏疏螺旋體OspA脂蛋白的經過第一個層析柱的流過液。
(c)在比流過第二個層析柱的任何殘留的汙染蛋白和脂多糖優先使疏螺旋體OspA脂蛋白與第二個層析柱結合的條件下，使經過第一個層析柱的流過液與第二個層析柱接觸，(d)在從第二個層析柱上洗脫結合的疏螺旋體OspA脂蛋白的條件下用洗脫液與第二個層析接觸，並且(e)收集含有來自所述第二個層析柱的疏螺旋體OspA的洗脫液。
進一步地，在此過程中，在pH5.7以下可實現流過液與第二個層析柱的接觸，pH達到或超過5.7時實現疏螺旋體OspA脂蛋白與帶有洗脫液的第二個層析柱的有效結合併且有效地從第二個層析柱上洗脫結合的疏螺旋體OspA脂蛋白。
並且，更進一步地，在此過程中，約pH7.5時實現去汙劑相與第一個層析柱的接觸，約pH4.2時實現流過液與第二個層析柱的接觸；約pH5.7時實現第二個層析柱與洗脫液的接觸。
本發明進一步包含了由此組合物和方法誘發的抗體。
令人驚奇地是，發明的組合物和方法中未觀察到明顯的效能干擾。
OspA以外添加或替代OspA用於前述的組合物、方法和過程的其它疏螺旋體抗原為尤其是在「相關申請」中用的申請和文件，包括製備這些抗原的方法。
下文詳細描述中公開了其它目標和實施方案或使它們很明顯。
附圖簡述在詳細描述中參照了下圖，在此引用作為參考，其中

圖1表示了將布氏疏螺旋體的B-31、ACA1和Ip90全長OspA基因克隆至pET9a表達載體所用的PCR寡核苷酸；圖2圖解說明將全長OspA基因插入PET9a表達載體以使OspA基因在T7φ10啟動子控制之下以從B31基因構建pOA1、從ACA1基因構建pOA9及從Ip90基因構建pOA10的策略；圖3是預測的質粒pOA1的限制圖譜；圖4表示了質粒pOA1經多種限制性消化結果，表明所有預測的位點都存在(M＝標記(用HaeIII消化φX174)；B＝BamHI；E＝EcoRI；H＝HindIII；N＝NdeI)；圖5表示了將布氏疏螺旋體的B-31、ACA1和Ip90全長OspA基因克隆至pCMB1表達載體所用的pCR寡核苷酸；
圖6圖解說明將全長OspA基因插入pCMB1表達載體以使OspA基因在Trc啟動子的控制之以從B31基因構建pOA5、從ACA1基因構建pOA7及從Ip90基因構建pOA8。
圖7A、7B和7C表示了用IPTG在兩個包含pOA1(圖7A)株系及含pOA5的一個宿主株系(圖7B)和含pOA6的一個宿主株系(圖7C)中誘導OspA的時間進程；圖8A、8B和8C是分別表示根據本發明的一個實施方案從大腸桿菌中製備和純化重組全長OspA的細胞生長和裂解、去汙劑抽提和純化步驟的流程圖；並且圖9圖解說明了質粒pCMB1和pCMB2的製備。
發明詳述如上文所述，本發明提供了尤其是用於家畜如狗、小狗、貓、小貓和馬等的含有布氏疏螺旋體抗原的組合物。此組合物優選的是「雞尾酒」或多價疫苗。即，此組合物優選地包含其它病原體的額外或「其它」抗原。
布氏疏螺旋體抗原可以是目的抗原的表位；並且，此抗原優選地是OspA。優選地，OspA是諸如大腸桿菌重組子的表達產物。優選地，OspA是脂化的；因此，更優選地，OspA是脂化的重組OspA。通過任何適當的方法可得到諸如OspA的布氏疏螺旋體抗原，如從布氏疏螺旋體培養物中分離；或優選地，根據在此引用作為參考的美國專利5,582,990和5,523,089及WO931/08299公開的方法獲得重組脂化的OspA。至於布氏疏螺旋體抗原及其製備方法，用於本發明的參考包括在「相關申請」中引用的文件及其引用的文件。
本發明的組合物，例如免疫學的、抗原的或疫苗組合物或治療性組合物，包括多價、「雞尾酒」或結合組合物的施用方法可通過腸胃外途徑(皮內、肌內或皮下)。這樣的施用導致系統免疫反應。
更為普遍的，根據藥學或獸醫領域技術人員熟知的標準技術可製備本發明的抗原的、免疫學的或疫苗布氏疏螺旋體抗原組合物。綜合考慮具體病人的年齡、性別、體重、種族、病症及施用途徑，用醫學和獸醫領域技術人員熟知的技術按劑量施用這樣的組合物。單獨使用布氏疏螺旋體，或將其與「其它」的抗原或「其它」免疫學的、抗原的或疫苗組合物共同或依次施用，由此提供本發明的「雞尾酒」或結合組合物或施用以及運用它們的方法。「其它」抗原或「其它」免疫學的、抗原的或疫苗組合物可以是目的抗原的一個或多個表位，或含目的抗原一個或多個表位的組合物。
「其它」組合物包含從任何動物病原體分離和/或純化的抗原如家畜病原體抗原如犬、貓、馬等病原體的任何抗原，如下列之一諸如狂犬病毒的犬病原體的一個或多個抗原如狂犬病毒糖蛋白G、犬瘟熱病毒抗原如CDV HA和/或F糖蛋白、犬乙型腺病毒抗原、犬冠形病毒抗原、犬副流感病毒抗原、犬細小病毒抗原、犬鉤端螺旋體，黃疸出血菌苗抗原或這些抗原的任何組合、或貓病原體的一個或多個抗原如貓白血病毒抗原、貓免疫缺陷病毒抗原、狂犬病毒、犬皰疹病毒抗原或這些抗原的任何結合、或馬病原體的抗原如馬流感和/或馬皰疹病毒和/或狂犬病毒抗原。這些「其它」抗原可來自重組體如痘病毒或其它體外載體系統這些抗原的表達；或這樣的「其它」組合物可包含重組體，如體內表達這些抗原的一種或多種痘病毒。
製備表達，用於本發明的OspA或其目的抗原、或「其它抗原」或其目的表位的載體或重組體的方法可以根據或參照下列文獻公開的方法；美國專利4,603,112、4,769,330、5,174,993、5,505,941、5,338,683、5,494,807、4,722,848、paoletti」將痘病毒載體用於接種最新進展「美國國家科學院院報9311349-11353，1996年10月；Moss，「用於重組基因表達的遺傳工程痘病毒、接種和安全性」，美國國家科學院院報9311341-11348，1996年10月；Smith等，美國專利4,745,051(重組杆狀病毒)，Richarolson，C.D.(編輯)；分子生物學方法39，「杆狀病毒表達方案」(1995 Human Press Inc.)、Smith等，「在感染了杆狀病毒表達載體的昆蟲細胞中製備人β幹擾素」，分子和細胞生物學，1983年12月，第3卷12期第2156-2165頁；Pennock等，「在感染了杆狀病毒載體的昆蟲細胞中強而調控表達大腸桿菌β-半乳糖苷酶，」分子和細胞生物學，1984年3月，第4卷第3期第399-406頁；EPA0370573、1986年10月16日提交的美國專利申請920,197、歐洲專利公開265785、美國專利4,769,331(重組皰疹病毒)、Roizman，「單純皰疹病毒基因的功能用於新型載體遺傳工程的引物」，美國國家科學院院報9311307-11312，1996年10月、Andreansky等，「將遺傳工程單純皰疹病毒用於治療實驗性腦瘤，」美國國家科學院院報9311313-11318，1996年10月、Robertson等「向B淋巴細胞進行基因轉運的Epstein-Barr病毒載體；」美國國家科學院院報9311334-11340，1996年10月、Frolov等，「以甲病毒為基礎的表達載體策略和應用」，美國國家科學院院報9311371-11377，1996年10月、Kitson等，病毒學雜誌65,3068-3075，1991、美國專利5,591,439、5,552,143、Grunhans等，1992，「作為克隆載體的腺病毒」病毒學研討會(第3卷)第237-252頁，1993、Ballay等，歐洲分子生物學組織雜誌；第4卷第3861-65頁、Graham，Tibtech 8，85-87，1990年4月、Prevec等，普通病毒學雜誌70，429-434、PCT WO91/11525、Felgner等(1994)，生物化學雜誌269，2550-2561，科學2591745-49，1993、McClements等「用編碼糖蛋白D或糖蛋白B的DNA疫苗單獨或結合免疫誘導單純皰疹病毒2型疾病動物模型的保護免疫反應」美國國家科學院院報9311414；11420，1996年10月及尤其涉及DNA表達載體的美國專利5,591,639、5,589,466和5,580,859。
同樣，全面考慮具體病人的年齡、性別、體重、種族和病症及施用途徑，確定施用的成分和方式(順序或同時施用)以及劑量。至於這一方面，在下列參考中提及美國專利5,503,834、5,529,780、5,482,713及5,494,807，它們公開了犬、貓和馬病原體抗原、表達這些抗原的重組子及包含這些重組子的組合物，還有共同未決的1995年3月29日提交的申請08/413,118，它針對犬皰疹病毒抗原核苷酸和胺基酸序列，產生它們的重組子及其用途；1994年4月6日提交的申請08/224,657和1995年4月5日提交的08/416,616，它們針對痘病毒犬瘟熱病毒(CDV)重組子及利用這些重組子的組合物和方法；1996年7月3日提交的申請08/675,556，針對表達盒、啟動子和重組子，包括獸用的腺病毒重組子；1996年11月14日提交的申請08/746,668，包括表達目的貓免疫缺陷病毒表位的重組子；以及，1995年6月7日提交的申請08/486,969，針對重組痘病毒-狂犬病毒組合物，包括結合組合物及其應用。將這些專利和申請中的每一個引用作為參考，尤其是在這些申請中公開的重組子、從中產生的表達及編輯核酸可用於本發明的「雞尾酒」、多價或結合組合物或施用或其重組子。
例如，犬瘟熱-2型腺病毒-冠形病毒-副流感-細小病毒XL，修飾的活病毒(產品號1491.21)是一種產物。如果將布氏疏螺旋體抗原，如OspA和此產物包含在一個單位包裝，即，作為結合組合物，或一次看獸醫將OACPiPxl和布氏疏螺旋體抗原施用於適當的宿主哺乳動物，是非常有益的。
本發明組合物的例子包括用於口的、鼻的、肛門、陰道、口服的、胃內服用的液體製劑、懸浮液、糖漿或配劑一類的施用方法及用於腸胃外、皮下，皮內、肌內或靜脈給藥(如注射給藥)的製劑如無菌懸浮液或乳濁液。在這樣的組合物中，抗原與合適的載體、稀釋劑，或賦形劑，如無菌水，生理鹽水、葡萄糖等形成混合物。可將組合物冷凍乾燥，依給藥途徑和希望的製劑，組合物中可包含輔助物質如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝劑、佐劑、凝膠或粘性增強劑、防腐劑、調味劑、色素等。標準教科書，如「REMINGTON’s PHARMACEUTICAL SCIENCE」，第17版，1985，在此引用作為參考，可用作製備適當製劑的參考，這樣可免去不必要的實驗。根據下文的實施例確定適當的劑量。典型的犬布氏疏螺旋體抗原劑量為5-25μg/ml，如13μg/mlOspA，典型的馬布氏疏螺旋體抗原劑量為15-150μg/劑，如單獨100μg/劑OspA，單獨30μg/劑OspA，或30μg/劑OspA與諸如狂犬病毒的另一種抗原結合(Imrab是商業上可以得到的可與布氏疏螺旋體抗原結合的狂犬病毒疫苗)。
如上所述，抗原的、免疫性的或疫苗組合物通常包含佐劑和抗原以誘發希望的反應。在某些應用中，鋁(磷酸鋁或氫氧化鋁)是常用的佐劑。皂苷及其純化組分QuilA、弗氏完全佐劑和其它佐劑用於獸藥。
然而，不需添加佐劑，脂化的重組OspA可誘發保護反應。可用化學上確定的製劑如胞壁醯二肽、Goodman-Snitkoff等在免疫學雜誌147-415(1991)(在此引用作為參考)中描述的單磷脂A、Miller等在實驗醫學雜誌1761739-1744(1992)(在此引用作為參考)中描述的在蛋白脂質體中製成膠囊的蛋白以及在脂小泡中NovasomeTM脂小泡(Micro Vescular Systems，Inc.，Nashua，NH)中製成膠囊的蛋白。
本發明組合物可以單個劑量包裝以通過腸胃外(即，肌內、皮內或皮下)給藥或口給藥，如perlingual(即口內)、胃內、黏膜包括口內、肛門內、陰道內等給藥進行免疫。同樣，給藥的有效劑量和途徑是由組合物的性質及已知因素如宿主的種族、年齡、性別、體重、病症和性質、LD50及其它已知不需要過多實驗的篩選方法決定的。劑量通常從幾微克至幾百微克，如每種抗原為5-500μg。其它適當的載體或稀釋劑可以是有或無防腐劑的水或緩衝鹽溶液。抗原可以是冷凍乾燥的，在給藥時懸浮或存在於溶液中。
載體也可以是高分子緩慢釋放體系。合成的高分子對製備控制釋放的組合物尤其有用。其中較早的例子是甲基丙烯酸甲酯聚合成直徑小於1微米的球以形成所謂的納顆粒，由Kreuter J.報導，醫學和藥物學中的微膠囊和納顆粒，M-Donbrow(編輯)，CRC出版社，第125-148頁。
已將微膠囊用於注射微膠囊化的藥物以產生控制的釋放。多種因素對選擇微膠囊化的具體高分子有影響。高分子合成和微膠囊化過程的重複性、微膠囊化材料和過程的成本、毒理學狀況、可變釋放動力學的需求及高分子和抗原的物理化學相容性都是必需考慮的因素。有用的高分子例子是聚碳酸酯、聚酯、聚氨基甲酸乙酯、Polyorthoesters及聚醯胺，尤其是那些可生物降解的。
最常用的藥物載體及最近用作抗原的載體是聚(d，1-lactide-co-glycolide)(PLGA)。它是生物可降解的聚酯，很久以來用於可腐蝕的縫合絨、骨板和其它臨時假器官，沒有任何毒性。多種藥物包括肽和抗原被製成PLGA微膠囊。很多證據表明PLGA適用於抗原的控制釋放，例如，如Eldridge，J.H等在Current Topics in Microbiologyand Immunology 1989，14659-66中所述的。抗原包載於直徑1-10微米的PLGA微球中通過口腔用藥時有很大的佐劑效應。用油包水乳濁劑的分相加工PLGA微膠囊。目的化合物製備或水溶液而PLGA溶解在諸如甲叉氯化物和乙酸乙酯的適當有機溶劑中。高速攪動使這兩種不能混合的溶液共同乳化。然後加入高分子的非溶劑，使高分子沉降在水滴周圍形成胚性微膠囊。收集並用試劑(聚乙烯醇(PVA)、明膠劑、藻酸鹽、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纖維素)之一穩定微膠囊，通過真空乾燥或溶劑抽提除去溶劑。
如上所述的微膠囊、緩慢釋放體系和膠囊技術用於希望使結合組合物中的一個或多個抗原緩慢呈遞於免疫系統。
因此，預期包括通過注射或其它給藥方式的液體，以及固體，包括含液體的固體、液體及凝膠(包括「凝膠帽」)組合物。
進一步地，本發明組合物可直接用於刺激動物的免疫反應。它可以是抗體反應，所以，通過本領域熟知的技術，可從這些抗體中製備單克隆抗體，這些單克隆抗體可用於熟知的抗體結合實驗、試劑盒或測定以檢測特定抗原的存在與否。這些單克隆抗體也可用於免疫吸附層析以回收或分離抗原。
本領域的技術人員已熟知製備單克隆抗體和運用單克隆抗體的方法。它們也可用於檢測方法、試劑盒、測定或實驗以及通過免疫吸附層析或免疫沉澱回收物質。
單克隆抗體是由雜交瘤細胞產生的免疫球蛋白。單克隆抗體與單一的抗原決定簇反應且比傳統的、來自血清的抗體特異性更大。而且，篩選大量的單克隆抗體可選擇具有希望的特異性、親合力和同種型抗體。雜交瘤細胞系提供了恆定的、廉價的化學上同一的抗體源並且製備這樣的抗體很容易標準化。製備單克隆抗體的技術為本領域技術人員熟知，如1989年4月1日授予Koprowski，H.等的美國專利4,196,265，在此引用作為參考。
已知單克隆抗體的用途。其中之一是用於診斷方法，如，1983年3月8日授予David，G.和Greene，H.的美國專利4,376,110；在此引用作為參考。單克隆抗體也用於通過免疫吸附層析回收物質，如，Milstein C.1980，科學的美國人24366，70，在此引用作為參考。
相應地，本發明組合物有此處所述的幾種用途。本發明的實施例中也有其它用途。
通過下列解釋性的實施例，可以更好地了解本發明及其優點。實施例實施例1-重組OspA的製備根據美國專利5,523,089和5,582,990，WO93/08299、PCT/US92/08697和Erdile等，1993描述的製備重組OspA。簡言之如圖1所示，克隆的布氏疏螺旋體株系的OspA基因(如上文所述的WO90/04411所述)(N-末端區SEQ ID NO1，C-末端區，SEQ IDNO2。序列的剩餘部分示於WO90/04411)用作模板(pTRH44；Howe等，1986，感染和免疫，54207-212)並且特別設計的寡核苷酸引物(PET-IN[CO1][SEQ ID NO3)和pET-273C[CO3](SEQ ID NO4))用於聚合酶鏈反應(PCR)以擴增野生型OspA基因全長。
相似地，如圖1所示，克隆的布氏疏螺旋體株ACAL和Ip90(如Johnsson等1992，感染和免疫601845-1853-ACA1和Ip90的N末端區是SEQ ID NO1；ACA1的C末端區SEQ ID NO5；Ip90的C末端區；SEQ ID NO6)與分別位於N和C-末端區的寡核苷酸引物對(a)OspN2(SEQ ID NO7)和BZ1(SEQ ID NO8)及(b)OspN2(SEQ ID NO7)和pK4(SEQ ID NO9)進行PCR反應以形成適當的擴增片段。
用寡核苷酸引物擴增所需的靶核酸序列的基本方法為本領域眾所周知並在美國專利4,683,202和4,800,159中得到描述。可參照這些專利有關所用技術的描述。
如圖2所示，得到的片段克隆到質粒載體pET9的NdeI和BamHI位點以將ospA基因置於T7啟動子及噬菌體T7有效翻譯起始信號控制下。pET9和pLysS質粒、克隆用細菌宿主、生長培養基及T7RNA聚合酶指導克隆基因表達的方法曾在美國專利4,952,496中有所描述，其中有關此類描述可用作參考。T7啟動子系統是本發明的一種優選表達系統，用與宿主生物相容的其它表達系統可實現全長ospA基因的表達。
採用pET9表達載體因為它用kan基因而不是bla基因作為選擇標記。所以，細胞生長過程中不使用氨苄青黴素，也就不會形成免疫原性ampicilloyl/OspA靶蛋白偶聯物。這種偶聯物是青黴素過敏反應的主要抗原決定簇並可能使免疫學研究複雜化。
含布氏疏螺旋體B31、ACAl和Ip90株ospA基因的質粒分別被命名為pOA1、pOA9和pOA10。pOA1質粒幾乎與Dunn等，1990，蛋白質表達和純化；1159-168中描述的pET9-preOspA質粒完全一致，只是這兩種情況下用於pCR反應的寡核苷酸不同。質粒pOA1預測的限制性圖譜示於圖3，而圖4包括質粒pOA1的各種限制性消化的結果，表明所有預測的位點都存在。
為了製備蛋白，質粒pOA1、pOA9和pOA10轉化到大腸桿菌表達株系中，根據前述的美國專利4,952,496，優選的大腸桿菌株系是大腸桿菌T7表達株。具體地，此株系可以是根據上述的大腸桿菌表達株BL21(DE3)(pLysS)或大腸桿菌株HMS174(pLysS)。培養轉化的宿主並用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白表達。IPTG加入後，從質粒pOA1誘導OspA的時間進程示於圖7A。用pOA9和pOA10得到了與pOA1相同的結果。誘導後約1小時從質粒pOA1的OspA蛋白合成終止，暗示了蛋白對大腸桿菌有一定的毒性。然而，蛋白生產處於可接受水平，約10mg/L細胞培養物。
除了提供了質粒pOA1、pOA9和pOA10及在大腸桿菌用T7啟動子表達OspA脂蛋白外，進一步構建了含在不同啟動子控制下全長B31、ACA1和Ip90 ospA基因的質粒並表達了脂蛋白。將從B31株pCR擴增的ospA片段克隆到質粒表達載體pCMB1和pCMB2的NcoI和BamHI位點製備了質粒pOA5和pOA6，將從ACA1株(pOA7)和Ip90株pCR擴增的OspA片段克隆到表達載體pCMB1的NcoI和BamHI位點製備了質粒pOA7和pOA8(見圖6的pOA5、pOA7和pOA8)。
從圖5看出，布氏疏螺旋體株B31、ACAL和Ip90克隆的OspA基因是分別用位於各自基因N-和C-未端的寡核苷酸引物對(a)PK3(SEQ ID NO10)和CO3(SEQ ID NO3)；(b)PK3(SEQ ID NO10)和BZ1(SEQID NO8)及(c)PK3(SEQID NO10)和PK4(SEQ ID NO9)通過PCR反應擴增以形成合適的擴增片段。
通過消化質粒pTrc99a(Pharmacia目錄號27-5007-01)和卡那黴素抗性基因(Pharmacia目錄號27-4897-01)、連接得到的片段，構建質粒pCMB1和pCMB2(圖9)。質粒pTrc99a為4197bp，包含與多克隆位點相鄰的強啟動子，多克隆位點後是強轉錄終止信號(rrnB)。用宿主細胞RNA聚合酶表達靶基因，使其用於多種大腸桿菌中。載體上的乳糖抑制基因(lacIq)緊密控制表達。無IPTG時，乳糖阻抑物蛋白阻止靶基因轉錄。卡那黴素抗性基因是1282bp的含來自轉座子Tn903基因的線性雙鏈DNA片段，其兩側有限制性酶位點並編碼賦予對卡那黴素和新黴素抗性的氨基糖苷3』磷酸轉移酶。
pCMB1長5.5kb，包含的卡那黴素基因轉錄方向與Trc啟動子起始的方向一致，pCMB2包含的卡那黴素抗性基因起始方向相反，使得抗性基因的轉基與Trc啟動子控制下目的基因的轉錄形成會聚的轉錄物。用SmaI、HindIII和BamHI+NcoI限制性酶消化pCMB1和pCMB2顯示預測的精確大小的片段。
將質粒pOA5和pOA6轉化大腸桿菌表達株或其它適當的生物，優選地是DH5α感受態細胞。培養轉化的宿主，用IPTG誘導蛋白。pOA5誘導的時間進程(圖7B)與pOA1的(圖7A)相似，而pOA6(圖7C)產生的OspA低幾倍。用pOA7和pOA8得到與pOA的結果相同。
圖8A-8C以圖解方式表示了重組全長OspA製備和純化步驟。下列實施例中描述了特定的操作條件。
細胞生長和蛋白誘導後(圖8A)，凍融裂解細胞。用比裂解液中其它細菌蛋白優先的、選擇性溶解OspA蛋白的去汙劑處理裂解液。Triton X-114選擇地溶解31kd蛋白，免疫印跡證明此蛋白是OspA。
本發明並非限制使用Triton X-114，也清楚地包括其它有相似的OspA選擇溶解性及在下文所述的溫和條件下有相似分相特徵的物質。
加入選擇性去汙劑後，將混合物加熱到約35°至40℃，此時隨著分相的出現，溶液成為絮狀的。
離心絮亂混合物則使混合物分成三相，即含50％或更多OspA蛋白及少量(約5wt％)細菌蛋白的去汙劑相、含細菌蛋白的水相及細胞殘渣的固體沉澱。從水相和固體沉澱中分離去汙劑相。
通過用OspA的選擇去汙劑處理隨後的去汙劑相分相，OspA基本上與細菌蛋白完全分開。仍然需要從去汙劑相殘留的細菌蛋白中最終純化OspA。
蛋白的最終純化是在選擇性地結合細菌蛋白而非OspA的層析柱上實現的，具體是DEAE-Sephacel、DEAE-Sepharose或其它相當的材料。將去汙劑相加在柱上，收集包含所有純化的OspA蛋白的流過液。結合的組分包含去汙劑相所有的細菌蛋白。經S-Sepharose或相當的層析柱進一步純化後，除了不汙染蛋白外，流通物基本上還應沒有脂多糖(LPS)，這是通過鱟變性細胞溶解物(LAL)確定的缺乏致熱性顯示的。
更特別地，按照上文所述製備質粒pOA1並用於轉化大腸桿菌株BL21(DE3)(pLysS)(pOA1)和HMS174(DE3)(pLysS)(pOA1)。以每升製備物12ml培養物的比例將轉化的大腸桿菌接種到含25μg/ml硫酸卡那黴素和25μg/ml氯黴素的LB培養基中。培養物在搖瓶中37℃培養過夜。
第二天早上，將10ml過夜培養物轉移至含25μg/ml硫酸卡那黴素的1升LB培養基中，培養物在搖瓶中37℃培養約3小時至OD＝0.6(儘管可達OD＝1.5)。
向培養基中加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5mM，培養基在約37℃繼續培養2小時。然後使培養物4℃冷卻並以10000xg離心10分鐘。棄去上清，以1/10體積的PBS懸浮細胞沉澱。將細胞懸浮液在液氮中冷凍，然後可在-70℃無限期貯存。
細胞懸浮液冷凍後，在室溫下融化細胞(約20°-25℃)，使細胞裂解。向融化的材料中加入終濃度為1μg/ml的DNaseI，室溫下溫育混合物30分鐘，這可使材料的粘性降低。
將溫育的材料置於冰上使溫度到10℃以下，然後加入貯存溶為10wt％的Triton X-114使終濃度為0.3-1wt％。將混合物在冰上放置20分鐘。然後將混合物加熱至約37℃並於37℃放置10分鐘。
隨著分相的出現，溶液變成絮狀。然後以12,000xg於20℃離心絮狀混合物10分鐘，這使混合物分成較低的去汙劑相、上層清亮的水相及固體沉澱。不觸動沉澱的情況下，將去汙劑相與其它兩相分開並冷卻至4℃。將緩衝液A，即50mM Tris，pH7.5，2mMEDTA和10mM NaCl加入到冷卻的去汙劑相中使體積回復到原來的1/3。冷凍得到的溶液並貯存以後來按下文所述進行處理或立即進行這樣的處理。
以1ml/10ml去汙劑相的比例準備DEAE-Sepharose CL-6B柱，用2體積緩衝液C，即，50mM Tris pH7.5 2mMEDTA、1M NaCl、0.3wt％Triton X-100洗滌柱，然後用4體積緩衝液B，即50mM Tris pH7.5，2mM EDTA、0.3wt％Triton洗滌柱。
將去汙劑相加到柱上並收集含OspA的流過液。用1體積的緩衝液B洗滌柱再次收集流過液。合併的流過液是純化的OspA水溶液，可冷凍貯存。
用2體積緩衝液C洗脫柱以使柱上無細菌蛋白從而可以再利用。
通過S-Sepharose快流速層析進一步並最終純化來自DEAE-Sepharose柱的流過液。加入0.1M檸檬酸使從DEAE-Sepharose柱的流過液酸化至pH4.2。用以檸檬酸調節至pH4.2的緩衝液C充分洗滌S-Sepharose快流柱。
用以檸檬酸調節至pH5.7的緩衝液C從柱上洗脫高度純化的OspA。加入2M Tris鹼使洗脫液立即回復到pH7.5。
用考馬斯亮蘭染膠分析經兩個層析步驟得到的高度純化的OspA水溶液，證實它含高度純化形式的OspA。由後一種層析步驟得到的產物的純度比由前一種層析步驟得到的高，有很低水平的內毒素。
根據上文所述製備質粒pOA5和pOA6並用以轉化大腸桿菌株DH5α。重複實施例1中所用的蛋白表達步驟，pOA5的OspA脂蛋白表達時間進程與pOA1的相同，而pOA6表達OspA比pOA5的低幾倍(圖7B和7C)。只在表達pOA5的細胞中繼續純化OspA蛋白。
用與實施例1中所述的方法相同的步驟純化用這種方式由Trc表達系統產生的B31 OspA脂蛋白，不同之處在於收穫後細胞沉澱中加入0.1mg/ml溶菌酶，冷凍前在室溫下懸浮細胞30分鐘。
DEAE-Sepharose柱流過液中含高度純化形式的OspA脂蛋白。
根據上文所述，重複製備質粒pOA1(pET啟動子)和pOA5(TRC啟動子)的步驟，克隆來自布氏疏螺旋體亞洲株(Ip90)的OspA基因以形成含此基因的質粒pOA8(Trc啟動子)和pOA10(pET啟動子)。對這些質粒進行限制性消化證明所有預測的位點都存在。
再次重複此步驟以將布氏疏螺旋體歐洲株(ACA1)的OspA基因克隆形成含此基因的質粒pOA7(Trc啟動子)和pOA9(pET啟動子)。對這些質粒進行限制性消化證明所有預測的位點都存在。
pOA7和pOA8表達株的培養和誘導與pOA5株的相同，pOA9和pOA10表達株的培養和誘導與pOA1株的相同。
通過這些操作獲得的ACA1和Ip90 OspA脂蛋白的純化與上文所述的B31(pOA1)OspA脂蛋白的相同。DEAE-Sepharose柱流過液含高度純化形式的OspA脂蛋白。
如上文製備的重組脂化的B31 OspA用於下列實施例中的製劑；然而，此處公開的其它株的OspA也可特別用於歐洲或亞洲地區的家畜。實施例2-重組OspA對狗有保護作用如在Appel等，1993，傳染病雜誌167651-64中重複的，狗對萊姆氏疏螺旋體病易感，人們擔憂它可從狗傳播給人，由此希望對狗接種針對萊姆氏疏螺旋體病(布氏疏螺旋體)的疫苗。
最初效率研究14隻狗用於此研究，4隻接種低濃度的菌苗(107)、4隻接種高濃度的菌苗(109)、4隻接種有佐劑的OspA製劑，2隻作為對照。用天然感染的蜱攻擊狗。所有接種的狗完全受到保護未受感染並表現出抗布氏疏螺旋體、抗-OspA、ELISA抗體以及生長抑制抗體。兩隻對照皆受到感染。表1 通過狗中攻擊研究效能-基本組織
在攻擊前1周從Westchester Country(New-York)森林地區通過拖白旗收集Ixodes daminni。這個地區收集的蜱中60％以上都受到感染。
根據階段和年齡對蜱分類，用前一直保持在98％相對溼度下。攻擊時，將15隻成年雌蜱和7隻成年雄蜱放在用彈性膠帶維持位置一周的塑料帽下並放在每隻狗剃去毛的左肋部位。這段時間足以使蜱飽食。
樣品收集攻擊後一、二和三個月及屍體剖檢時從蜱吸附位點獲得皮膚活體解剖(4mm穿孔活體解剖塊)並進行培養以獲得布氏疏螺旋體。
從D0至攻擊(D42)每周取血樣一次，然後至屍體剖檢時每兩周取一次血樣。根據下文所述檢測血清抗體。
約100天時(攻擊後97-109天)進行屍體剖檢。從左、右後腿膝蓋關節、前部肌肉、後部肌肉、肘、和啟收集肌肉和關節囊並進行培養以獲得布氏疏螺旋體。
培養方法在BSKII中研磨樣品並將其接種在含BSKII的試管中。試管在34℃培養6周。用暗視野顯微術每周檢測每管中的樣品以檢測布氏疏螺旋體的存在。觀察到布氏疏螺旋體則為陽性。
血清學方法RM ELISA這是間接ELISA。抗原是從法國蜱中分離的布氏疏螺旋體株的洗滌過的超聲物。偶聯物是山羊抗犬IgG。底物是四甲基聯苯胺(TMB)。用樣品稀釋100倍時450nm和620nm處的差別吸光值表示滴度。
Cornell ELISA此檢測根據Appel等上文所描述的進行。它是間接ELISA。此抗原是從Westchester County收集的I.dammini低代數的布氏疏螺旋體的洗滌的氟氏壓碎器裂解液。偶聯物和底物與上文相同。以動力ELISA單位表示滴度。
OspA ELISA這是用rOspA作為包被(plate)抗原的間接ELISA。偶聯物是鹼性磷酸酶山羊抗犬IgG。底物是Signa 104磷酸酶底物(NA0200)。用在405nm處O.D.大於0.1的最高稀釋高的對數表示滴度。
生長抑制實驗根據SADZIENE等(傳染病雜誌，1993，167165-172)描述的進行此實驗。在兩個溶血單位的新鮮豚鼠補體存在的情況下，系列稀釋血清並與布氏疏螺旋體生物溫育62-66小時。到那時，有螺旋體的孔BSKII生長培養基中的酚紅指示劑由粉紅變成黃色。用暗視野顯微術檢測這一點兩側的三個孔以證實活細胞減少90％的稀釋度。用此稀釋度的對數表示滴度。
結果皮膚活體解剖結果列於表2。在所有樣品中對照狗是陽性的。在12個接種疫苗的狗中未見陽性。表2
*接種後每周檢查培養物，共6周。*攻擊時進行的活體解剖。
屍體剖檢-培養結果結果詳細列於表3。兩隻對照狗每側各種器官培養物皆是陽性。分離的比率在左側(攻擊側)不比右側頻繁。表3萊姆氏疏螺旋體病疫苗通過狗中攻擊研究效能來自屍體解剖時收集的組織的培養結果
血清學
RM-ELISA結果示於表4。用OspA疫苗或菌苗接種後，第二次接種後產生明顯的增強效應使滴度明顯增加。
攻擊後，接種狗的滴度保持穩定，而對照狗的滴度在兩個月期間逐漸升高。
表4萊姆氏疏螺旋體病疫苗通過狗中攻擊研究效能RM ELISA血清學(滴度表示為1/100時的血清O.D.)
Cornell ELISA結果示於表5。
抗體升高的方式幾乎與RM FLISA得到的相同。
所有的被接種者在第一次注射後及第二次加強接種後滴度明顯增加。攻擊後，滴度保持穩定。
在3個月期間對照的滴度逐漸增加。
表5 萊姆氏疏螺旋體病疫苗通過狗中攻擊研究效能RM ELISA血清學(滴度表示為K ELISA單位)
>*D0，D21 接種**D42 攻擊的第一天ND未做
OspA ELISA結果示於表6。
兩種菌苗誘導的抗OspA抗體水平相似。
OspA疫苗誘導顯著的同源抗體反應。
其方式與整個細胞裂解物ELISA相似一次注射後，增加二次注射加強。
生長抑制結果示於表6。
菌苗和OspA疫苗在所有接種狗中誘導高水平布氏疏螺旋體抑制抗體。表6萊姆氏疏螺旋體病疫苗通過狗中攻擊、OspA ELISA和生長抑制研究效能(滴度表示為終點稀釋度的log10)<
攻擊所用的以布氏疏螺旋體針施用為基礎的攻擊方法比其它發表的攻擊方法有很多優點。
*攻擊載體和途徑模擬自然狀況。
*通過皮膚活體解剖體內跟蹤感染。
進一步地，對於兩個菌苗(法國株)來說，攻擊(美國起源的蜱)是異源的。
缺乏臨床病症是局限，但根據Appel等所述，在這個年齡的狗中完全是意料之中的。
在這些條件下，結果-即所有對照被感染；12個被接種者無一被感染-表明低或高濃度的菌苗以及OspA疫苗完全保護狗免受攻擊。血清學用所有的方法使用三種疫苗得出相似的結果第一次注射後增加，第二次注射的加強效應。
儘管用於抗原生產的株系和結果表達不同(表3)，應注意所用的兩種裂解物ELISA(RM ELISA，Cornell ELISA)之間有很高程度的相關性(r2＝0.86，F＝935 α＝0.001)。
也應重視由接種誘發的抗體*與布氏疏螺旋體的主要外膜蛋白OspA強烈反應，*強烈抑制布氏疏螺旋體生長。結論含低劑量(107)或高劑量(109)死布氏疏螺旋體細胞的菌苗完全保護狗免受天然途徑(蜱暴露)攻擊。
用含有佐劑的OspA疫苗得到相同的結果。
所有疫苗誘發識別OspA脂蛋白和抑制布氏疏螺旋體生長的抗體滴度顯著而相似的增加。免疫反應研究的持續將33隻小獵兔犬分成兩組。第一組(20隻狗)以3或4周的接種間隔接受兩劑皮下注射的單價疫苗(如實施例1製備的10μg/劑的重組B31 OspA。第二組未受處理(13隻)。第二次接種後5-6個月用蜱攻擊所有的狗。通過ELISA在有規律的間隔測定抗體。在攻擊後1或2個月重新分離螺旋體以評估疫苗效能。也監測狗的犬萊姆氏疏螺旋體病(LD)的臨床病症。總結安全性注射疫苗後未見局部或全身副反應。
單價萊姆氏疏螺旋體OspA疫苗*誘發由螺旋體再分離和臨床病症評估的對犬萊姆氏疏螺旋體的保護。*這種保護反應在接種後至少5個月有效。*天然攻擊後對螺旋體感(90％)和臨床病症有保護。
動物33隻幼小獵兔犬(兩種性別皆可；9-10周齡；萊姆氏疏螺旋體和鉤端螺旋體接種陰性)來自Ridglan Farms(Mount Horeb，WI)。將小狗隨機分成兩組接種。
疫苗製備稀釋按實施例1製備的B31 OspA純化蛋白貯存液製備OspA單價疫苗(命名為Ly)。貯存液的濃度為465μg OspA/ml。用無菌稀釋液將貯存液稀釋成10μg/ml OspA並將此疫苗分裝在單用和多用小瓶中(分別為1ml和10ml)，檢測疫苗確實無菌。
接種方案狗以三周(第1組)或四周(第2組)間隔接受皮下給藥的兩劑疫苗(1ml/劑)。注射後最初15分鐘內監測過敏反應，包括呼吸困難、癢和水腫。另外，接種後第1個小時內連續觀察狗，然後每次注射後的14天在規則的時間間隔觀察。監測的病症包括腫脹、疼痛、脆弱和抓注射位點。在第二個注射位點給藥時，第二個接種位點由於腫脹和脆弱而悸動。
血清學在每次接種時及隨後的每個月取血測定滴度。用ELISA測定OspA滴度。
攻擊根據Appel等的攻擊方法，用天然感染的蜱以布氏疏螺旋體攻擊所有的狗。末次接種和攻擊之間的間隔在第1組為24周，在第2組為21周。在流行萊姆氏疏螺旋體病的Westchester county，N.Y.收集蜱並根據Appel等的方法進行攻擊。這些蜱感染布氏疏螺旋體的比率為60％。
皮膚活體解剖和螺旋體再分離攻擊後一個和兩個月對所有的狗進行活體解剖。剃光蜱吸附位點周圍的皮膚、用Betadine手術刷進行手術前準備、用2％lidocanne進行麻醉、皮下注射、用Baker Skin Punch進行打孔活體解剖。將皮膚樣品放在含培養基(含熱滅活兔血清和抗生素的BSK培養基)的試管中並送到實驗室。向試管中補加額外的培養基並將其放在燭罐中。將罐培養6周。用暗視野顯微術每周檢查試管中螺旋體的存在。用40×物鏡檢查至少10個視野後才能認為樣品為陰性。
臨床病症和症狀由於疾病性質可變，感染後見不到犬萊姆氏疏螺旋體病(LD)的臨床病症，所以主要通過從皮膚活體解剖樣品中再分離布氏疏螺旋體評估疫苗的效能。然而，監測所有狗中LD病症的出現。要監測的病症有疼痛和脆弱、體溫、瘸、共濟失調、沮喪和厭食。據估計只有10-15％天然感染了布氏疏螺旋體的狗表現出臨床病症。結果
疫苗安全性接種後的第一個15分鐘及每次接種後兩周監測所有接種狗的副反應(包括過敏反應)。每次接種萊姆氏疏螺旋體單價疫苗後的任何時間都未見副反應。另外，每次接種後的兩周內未見注射位點腫脹、疼痛、脆弱或癢。
抗體滴度(見表7)用ELISA測定抗OspA抗體。表7列舉了ELISA值。在蜱攻擊時，大多數接種了單價疫苗(10μg OspA)的狗仍表現出有效的OspA抗體滴度。一隻狗，FAS＜未表現出針對OspA的有效的抗體反應。螺旋體再分離(同表7)攻擊後一個和兩個月對所有的狗進行皮膚活體解剖。培養活體解剖組織六周並檢查螺旋體再分離。第一次活體解剖時從12隻對照狗中的7隻再分離到螺旋體(58％)。由於汙染，一個樣品在培養5周後丟失而不可讀。所有13個對照狗的樣品在第二次活體解剖時均為螺旋體陽性(100％)。
結果表明只有兩隻接種了單價萊姆氏疏螺旋體疫苗(HVT和DXT)的狗為螺旋體陽性；再分離率為10％。
犬萊姆氏疏螺旋體病的臨床病症(同表6和7)攻擊後5個月，13隻未接種對照中的5隻(39％)經歷了由LD引起的事件，兩隻狗(HXT和JCT)中發生了多個事件。20隻被接種狗中的一隻(5.0％)經歷了瘸這一事件。討論通過測定疫苗在短時期內阻止螺旋體擴散和臨床病症的能力及免疫實驗持續時間評估疫苗效能。LD在狗中不一定導致臨床疾病出現(Levy和Magnarelli，1992，JAVMA，200344-347)，所以除了報導臨床病症外，疫苗效能基於實驗製劑阻止螺旋體增殖的能力。這是通過從皮膚活體解剖中再分離螺旋體評估的。當評估疫苗效能時，螺旋體再分離是最重要也是最穩定的參數。如果接種使這種擴散減弱或消除，動物則不會出現臨床病症。如上所述，Ly疫苗可保護90％以上的受體在短期效能實驗中不出現螺旋體繁殖。在此免疫反應(DOI)研究期間，接種後5-6個月攻擊的狗，100％未處理對照在第二次活體解剖時為螺旋體陽性。相反，只有在兩個被接種者中再分離到螺旋體(10％)。
也觀察了狗中由於感染引起的臨床病症。不知每隻狗接種狀況的動物技術人員報告了觀察到的現象。在上述短期效能研究中，25％未處理對照表現出了犬萊姆氏疏螺旋體病(LD)的典型病症，主要是瘸，而被接種者中未觀察到病症。在這項DOI研究中，狗中的六隻有這樣的病症；五隻是未被接種的對照(39％)，一隻狗是被接種者(5％)。約攻擊後兩個月第一次觀察到瘸；自那以後兩隻未受處理的狗(JRT和IAT)表現出重複發生的事件。
一個被接種者，HPS在攻擊後約兩個月時在前右腳有腫脹和輕微的瘸。儘管在觀察那隻狗的培養物特別留意了其瘸的現象，從來未從中分離到螺旋體。這也許不是犬LD的結果，而是由其它原因引起(外傷，等)。然而，將這隻狗列為臨床病症陽性以提供儘可能嚴格的試驗。
抗體滴度結果表明除了一隻(FAS)以外其它的接種了此單價疫苗的狗在接種後產生了抗體，這是通過放血前和攻擊前至少兩個稀釋度滴度的差異測定的。這代表了抗體產生率95％。至攻擊時，除了兩隻(FAS和HVT)以外其它所有的被接種者仍然有有效的滴度。對照狗中沒有一隻有OspA抗體水平的持續升高，儘管三隻對照(HXT、JBT和JIT)的確在攻擊前血中有低水平的抗體。
此實驗結果也顯示了Ly單價疫苗的安全性。接種時和每次注射後的兩周內未觀察到副反應。所有的小狗都可忍耐10μg OspA/劑。因為該疫苗不含佐劑，未出現大多數有佐劑製劑接種時特徵性的溫和和瞬時的肉芽腫反應。結論含10μg OspA/劑的單價疫苗*對於9-10周齡的小狗是安全的。
*抗原性強，使95％受體產生抗體。
*接種後5-6個月誘發保護被接種者免受螺旋體(90％)感染的免疫反應和臨床病症，蜱攻擊後，100％對照表現出螺旋體感染且39％表現出臨床病症。
此實施例也表明發明性疫苗對於整個萊姆氏疏螺旋體病季節都有保護作用。表7在免疫試驗期間(DOI)針對OspA的抗體滴度、螺旋體再分離和臨床病症的結果<
在攻擊後1、2和3月對所有狗進行活體解剖(acc材料和方法)。皮膚樣品在BSK培養基(加有抗生素和10％兔血清)中培養6周；每周用暗視野顯微空間檢查試管。在認為樣品為陰性前至少檢查10個視野。±由於汙染丟失的樣品。表8攻擊5個月的犬萊姆氏疏螺旋體病的臨床病症
用1ml Ly疫苗SQ以三周或四周間隔接種狗。5-6個月時進行攻擊。由不知接種情況的動物技術人員監測狗的臨床病症。實施例3-無效能干擾的結合組合物製劑此實施例表明犬瘟熱病毒-2型腺病毒-冠形病毒-副流感病毒-細小病毒和布氏疏螺旋體抗原OspA之間無效能干擾。縮寫組分 縮寫犬瘟熱病毒、Rockborn(CDVR)或Onderstepoort(CDVo)D犬2型腺病毒(CAV2) A犬冠形病毒，MLV(CCVL) C犬II型副流感病毒(CPi) Pi犬細小病毒(CPVXL) PXL這些組分是從修飾的活病毒(來自Rhonx Merieux，Inc.，Athens，Georgia，U.S.A)製備而來。疫苗為含下列組分的製劑。
此疫苗以兩種獨立的組分製備第一種組分是犬瘟熱病毒-2型腺病毒-冠形病毒-細小病毒XL修飾的活病毒，命名為DACPiPXL，將它冷凍乾燥在一個小瓶中不包含任何佐劑。第二種組分是布氏疏螺旋體。根據實施例1中所述的重組技術製備B31外膜蛋白A(0spA)(稱為Ly)或OspA。
第二種組分是用於使疫苗冷凍乾燥組分在接種前重新水化的液體組分。OspA組分不含任何佐劑。
檢測冷凍乾燥疫苗DACPiPXL的病毒特性和滴度、無菌性、支原體和安全性令人滿意。用含13μg/ml OspA的Ly使冷凍乾燥物重新水化。檢測OspA疫苗的無菌性。
根據the Code of Federal Regulations，9C.F.R.113，35的標準用體外殺病毒實驗測定，OspA稀釋劑對疫苗的冷凍乾燥組分無幹擾。
比較接種了結合疫苗(DACPiPXL+OspA)與單純接種了OspA(見實施例2)狗的血清滴度確定冷凍乾燥的病毒組分對OspA稀釋劑無幹擾。
由於DACPiPXL+OspA是將兩種經過廣泛效率檢驗的獨立疫苗合併的結果，只有小量的狗被攻擊表明疫苗中冷凍乾燥的病毒組分不幹擾由OspA組分誘發的針對萊姆氏疏螺旋體病的保護作用，反之亦然。
根據年齡，種和性別隨機選20隻狗並將其養在一起。十隻狗接種了DACPiPXL+OspA結合疫苗，5隻狗只接種了OspA(按照實施例2)，5隻狗作為未受處理的對照。
根據下列進度表，狗接受了以三周間隔皮下(SC)給藥的兩劑量疫苗(1ml/狗)。
在每次接種(第0和21天)、攻擊前(第35天)和每次活體解剖前取血。通過ELISA檢測OspA特異的抗體。在接受了OspA或DACPiPXL+OspA的狗內檢測到了抗OspA抗體。
接種後立即觀察狗的包括過敏反應的副反應。另外，由動物技術人員每天監測狗的局部和系統副疫苗反應，包括發燒、厭食、嘔吐或昏睡。在第二次注射前，前次接種位點由於不正常的反應，包括肉芽腫形成而悸動。未觀察到副反應。
二次接種後兩周用天然感染了布氏疏螺旋體(見實施例2)的蜱攻擊所有的狗。
攻擊後第1、2和3個月從狗得到皮膚打孔活體解剖。根據實施例2中列出的程序培養活體解剖材料以再分離螺旋體。
比較被接種狗和未處理對照中螺旋體再分離比率，證明結合疫苗冷凍乾燥的病毒組分對OspA稀釋液無幹擾。
為了表明OspA組分對結合萊姆氏疏螺旋體疫苗中冷凍乾燥的病毒成分沒有不利影響，進行了殺病毒實驗。用Ly水化後檢測所有病毒成分的滴度，並將其與用無菌重新水化的病毒成分的滴度比較。
解釋體內和體外結果通過體內實驗血清滴度和螺旋體再分離的結果，體外實驗殺病毒實驗，測定了結合疫苗的效率。比較了接種結合疫苗(DACPiPXL+Ly)、只接種了Ly及未受處理對照狗中的OspA抗體水平和螺旋體再分離的結果。
認為結合疫苗是有效能的，因為(1)接受結合疫苗和單價Ly疫苗的狗中的抗體水平相似。被接種者體內抗體水平比未處理對照的抗體水平明顯高；(2)100％被接種的狗螺旋體再分離陰性，而80％(4/s)的未受處理的對照螺旋體陽性；並且(3)與無菌水相比，Ly稀釋劑重新水化的冷凍乾燥病毒塊的病毒滴度沒有降低。
結果示於表9表9犬結合效能研究抗OspA ELISA水平
*所有的狗以三周間隔接受兩次皮下接種。Ly＝萊姆氏疏螺旋體OspA；DACPiPXL＝犬瘟熱病毒、腺病毒、冠形病毒、副流感病毒和細小病毒修飾的活疫苗。值＞50＝有效的OspA抗體水平。實施例4-OspA疫苗在馬中的效能10匹馬用於此項研究。其號碼為74、75、76、77、93、95、96、97、98和99。
單價疫苗(命名為Ly；100μg/劑OspA和30μg/劑)是根據實施例1(B1)所述的重組技術製備的。結合疫苗(命名為狂犬病毒/Ly)由Imrab)來箱Rhone Merieux，Inc.，Athens，Georgin)和根據實施例1(B31)製備的30μg/ml B31 OspA組成。
根據下列方案，以兩周間隔給馬肌內接種(IM)兩劑疫苗。
組 號 疫苗14狂犬病毒/Ly結合(30μg/ml)24100μg/ml Ly3230μg/ml Ly在每次接種前及二次接種後1、2和3周時取馬血。由ELISA(根據用馬抗血清修飾的)測定血清學結果。因為OspA血清學結果令人鼓舞，檢測了接種結合疫苗的馬中的狂犬病毒抗體滴度。
接種後30分鐘至1小時內觀察了所有馬的過敏反應病症。首次觀察階段後，在第二次接種前，觀察接種位點出現的局部注射反應(腫塊，等)。另外，每日觀察每匹馬副疫苗反應的出現(發燒、沮喪、厭食等)。所有的日常觀察持續至未次接種後的一周。未觀察到副反應。
評價被接種馬中的抗OspA抗體水中並與取血前水平比較而估價疫苗的效能。
結果示於表10。結果顯示單價或多價OspA疫苗可保護馬不受萊姆氏疏螺旋體病侵擾；並且，未觀察到多價疫苗中有效能干擾。表10馬萊姆氏接種實驗抗OspA ELTSA水平
>*所有的馬接受了間隔三周的兩次肌內注射。Imrab＝商業上的含佐劑的滅活的狂犬病毒疫苗。*n.b.＝未取血；值＞50代表有效的OspA抗體水平。實施例5-犬萊姆氏疏螺旋體萊姆結合疫苗的安全性、效能和無幹擾本實施例進一步評價了萊姆結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)的安全性、效能和無幹擾。
將34(34)只小獵兔犬隨機分成兩組(22隻被接種者和12隻對照)。被接種者皮下接受兩劑結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)，而對照只接種病毒成分(recDACPiPXL)。第二次接種後7周用天然感染的蜱攻去所有的狗。用ELISA血清學在規則的間隔檢測狗的OspA抗體。為了證實疫苗針對布氏疏螺旋體攻擊的效能，對狗進行活體解剖且培養皮膚樣品以再分離螺旋體。另外，進行幹擾缺乏實驗和殺病毒實驗以證實OspA稀釋液對病毒疫苗成分無有害的影響。
*安全性注射後的任何時間都未觀察到局部或總體的副反應。
*效能總結表11
*一隻狗未採血*無幹擾殺病毒實驗和無幹擾實驗表明OspA稀釋液對結合疫苗的病毒成分無有害影響。
因此，萊姆結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)*對於8-10周齡小狗是安全的；*抗原性強且在100％被接種狗中誘發OspA抗體產生；*天然蜱攻擊後保護被接種者免受螺旋體感染及其傳播；並且*不幹擾冷凍乾燥的病毒疫苗成分，這是通過體內無幹擾試驗和體外殺病毒實驗測定的。所用的縮寫疫苗成分縮寫布氏疏螺旋體的外表面蛋白A(OspA) OspA(見前實施例)犬瘟熱病毒；金絲雀痘病毒載體(recCDV)D2型犬腺病毒(CAV2) A犬副流感病毒(CPi) Pi犬細小病毒PXLPXL犬冠形病毒(CCV) C能夠接種狗使其不患萊姆氏疏螺旋體病同時提供對其它犬病原體保護的結合疫苗給獸醫提供了重要的預防傳染疾病的替代方法。
本研究是為了測定本發明的結合疫苗的安全性、效能和無幹擾。此結合疫苗含OspA稀釋液(命名為OspA)和包含重組犬瘟熱病毒-2型腺病毒-冠形病毒-副流感病毒-細小病毒(命名為(recDACPiPXL)冷凍乾燥病毒塊。材料和方法動物34隻幼小獵兔犬(兩種性別皆有；8周齡；萊姆氏疏螺旋體(布氏疏螺旋體)和鉤端螺旋體抗體陰性)來自Ridglan Farms(Mount Horeb，WI)。將小狗隨機分成兩組；按下列接種
疫苗製備如實施例1獲得OspA疫苗。以prelicense serial獲得冷凍乾燥的病毒成分。冷凍乾燥塊的滴度如下
疫苗方案狗接受了以三周間隔皮下給藥的兩劑疫苗(1ml/狗)。注射後最初19分鐘監測過敏反應病症，包括困難，癢和水腫。另外，照顧動物人員在接種後第1小時連續觀察狗，然後每次注射後每天觀察一次。監測的病症包括腫脹、疼痛、脆弱和抓注射位點。在第二次注射前，首次接種位點由於腫脹和脆弱悸動。
血清學每次接種前及其後的每個月取血進行血清學實驗。由ELISA測定OspA滴度。
無幹涉實驗為了表明OspA稀釋劑對結合疫苗中的病毒成分無幹撫，測定了血清中和滴度，比較了第I組(接種了recDACPiPLX+OspA)的GMT和第II組(單獨接種recDACPiPXL)的滴度。
體外殺病毒實驗為了表明OspA稀釋液不幹擾結合疫苗中病毒成分的滴度，根據9CFR準則(113.35)進行體外殺病毒實驗。
蜱攻擊為了證實病毒成分不幹擾由結合疫苗中的OspA組分誘發的保護作用，接種後7周用布氏疏螺旋體攻擊所有的狗。此攻擊用在流行萊姆氏疏螺旋體病地區收集的天然感染的蜱。據測定這些蜱中布氏疏螺旋體感染率為60％。
皮膚活體解剖和螺旋體再分離攻擊後的1個和2個月對所有的狗進行活體解剖。剃光蜱吸附位點的皮膚，用Betadine手術刷進行手術前處理，皮內注射2％lidocaine麻醉，用Baker Skin Punch進行穿孔活體解剖。將皮膚樣品放在含培養基(含熱滅活兔血清和抗生素的BSK培養基中)的試管中並將其轉移至實驗室。向試管中添加培養基並將其放在燭罐中。將罐培養6周。用暗視野顯微鏡每周觀察試管中的螺旋體。用40×物鏡檢測至少10個視野才能認為樣品是陰性。
疫苗安全性由PI在接種後的第1個15分鐘內監測所有被接種狗的副反應(包括過敏反應)，每次接後14天由照顧動物的人員監測。用萊姆氏結合疫苗接種後的任何時間都未觀察到副系統反應。另外，在接種後的兩周內在注射點未見腫脹、疼痛、脆弱或癢。
OspA抗體滴度(見表12)用ELISA測定針對OspA的抗體。在第0天(預取血，第1次接種前)；第14天(第二次接受接種前)；第42天(攻擊前)及其每月一次取血。
表12列舉了ELISA值。第一次接種後，23隻被接種者的12隻(57％)產生了抗體，OspA抗體水平增加至少4倍。第二次接種後兩周，所有的22隻(100％)接種了recDACPiPXL有OspA抗體產生。攻擊前大多數被接種者表現出有效的OspA抗體滴度(19/22＝86.4％)。單獨接種了recDACPiPXL的對照中沒有一隻表現出對OspA抗原的血清學反應。
攻擊後兩組中抗體水平升高都很小。只有在感染晚期，萊姆氏疏螺旋體病患者體內才表達OspA抗體，天然感染的犬體內也是如此。
無幹擾實驗(見表13)在第0天(第1次接種前)和接種後第35天獲得血清。在兩個時間檢測每隻狗中結合疫苗中病毒抗原的血清中和抗體。計算單獨接種了recDACPiPXL組的幾何平均滴度(GMT)和標準差，並與接受萊姆氏結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)的GMT比較。
用於此項研究的小狗萊姆氏疏螺體或鉤端螺旋體接種或暴露陰性，但不是在特定的無病原體條件下培養。所以，第0天預取血結果表示了疫苗冷凍乾燥組分中的病毒成分的滴度。如預料的，接種後所有成分的滴度都提高了。
比較(用斯氏t檢驗，p＜0.05則被認為顯著)單個個體的滴度表明接種了recDACPiPXL+OspA的狗與單獨接種了recDACPiPXL的狗血清中和滴度沒有區別。所以OspA稀釋液對疫苗任何病毒成分沒有顯著的幹擾。
體外殺病毒實驗(見表14)在體外殺病毒實驗中，比較了用OspA稀釋液重新水化的病毒疫苗成分的滴度與用無菌水重新水化的疫苗的滴度。這些滴度的比較表明差異在萊姆氏結合疫苗每種病毒成分可接受的限度內(低於滴度差對數值的0.5)。
螺旋體再分離(見表15)攻擊後1個和兩個月對所有的狗進行皮膚活體解剖。培養活體解剖6周並檢測螺旋體再分離。結果表明只有1隻接種了組合萊姆氏疫苗(XBY)的狗為螺旋體陽性(4.5％)，且那隻狗只有在第一次活體解剖時是陽性的。在第二次活體解剖時，23隻接種了recDACPiPXL+OspA的狗中沒有一隻是螺旋體陽性的(0％)。
攻擊後1個月時從12隻對照狗中的3隻活體解剖樣品中再分離到了螺旋體(25％)，第二次活體解剖時9隻對照是陽性的75％)。
由病原螺旋體布氏疏螺旋體導致的萊姆氏疏螺旋體病(LD)是目前人類最常見的蜱傳播疾病。另外，獸醫報導犬LD是最常見的狗感染。
已知布氏疏螺旋體主要外表面蛋白之一OspA是強有力的免疫原並在多種動物中提供對螺旋體感染的保護。以重組技術大量生產的純化OspA蛋白也是兩種正在進行臨床實驗的人類疫苗的基礎。
可以免疫狗對抗萊姆氏疏螺旋體病並同時對其它犬病原體提供保護的結合疫苗給獸醫提供了預防傳染疾病的重要替代方法。
本實施例的目的是測定結合疫苗的效能、安全性和無幹擾。包含重組犬瘟熱病毒-2型腺病毒-冠形病毒-副流感病毒-細小病毒(命名為(recDACPiPXL)冷凍乾燥病毒塊的疫苗由OspA稀釋液重新水化。用結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)接種22隻小狗，用無菌水重新水化的冷凍乾燥病毒塊(recDACPiPXL)接種12隻對照。隔三周皮下接種兩次所有小狗,然後用布氏疏螺旋體感染的蜱攻擊。
天然蜱攻擊模式用於此實施例。攻擊後在1和兩個月對所有的狗進行活體解剖並培養樣品以再分離螺旋體。結果顯示只有1隻接種了萊姆氏結合疫苗的狗瞬時螺旋體再分離陽性，因為這隻狗及其它所有接種了比結合疫苗的小狗在第二次活體解剖時螺旋體傳播為陰性。相反，第二次活體解剖時從75％單獨接種了recDACPiPXL的狗中再分離到了螺旋體。
測定了所有狗中的OspA抗體結果。所有接種了結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)的小狗在接受兩次注射後都產生了抗體，而單獨接種了冷凍乾燥病毒成分的對照中沒有一個的OspA抗體水平升高。
對照動物中的OspA滴度是由活體解剖感染的，蜱攻擊後沒有明顯的升高。已知人體內萊姆氏疏螺旋體病早期不出現OspA抗體；這項研究的結果暗示犬感染的情況也許也是如此。
此項研究也表明了OspA結合疫苗的安全性。接種時或每次接種後的兩周內都未見系統或局部副反應。
本發明的萊姆氏結合疫苗(recDACPiPXL+OspA)*在8-10周齡小狗中是安全的；*抗原性很強並誘導100％被接種狗產生抗體；*由螺旋體再分離表明，天然蜱攻擊後，保護被接種者不受螺旋體感染及其傳播，並且*由體內無幹擾實驗和體內殺病毒實驗表明不幹擾冷凍乾燥病毒疫苗組分。表12針對OspA的抗體滴度的結果
表13血清抗體水平萊姆稀釋液對組合疫苗的病毒成分無影響
1第一次接種的日期GMT幾何平均滴度用無菌稀釋液再水化SD標準差表14 有和無萊姆氏稀釋液的冷凍乾燥病毒成分的滴度(殺病毒效應
1兩次重複的平均2用無菌稀釋液再水化的冷凍乾燥疫苗表15攻擊後OspA抗體產生和螺旋體再分離的結果
一隻狗未取血由此，詳細的優選實施方案中描述了本發明，應當理解由附屬的權利要求書確定的本發明不被上文描述的特定細節限制，因為在不脫離其精神或範圍的情況下可對其進行改動。
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權利要求
1.一種免疫組合物，包含分離純化的布氏疏螺旋體抗原或表達此抗原的載體和額外的除布氏疏螺旋體以外的哺乳動物病原體或表達額外抗原的載體，以及選擇性地藥學或獸醫學上可接受載體。
2.根據權利要求1所述的免疫組合物，其中分離純化的布氏疏螺旋體抗原包括分離純化的OspA。
3.根據權利要求2所述的免疫組合物，其中分離純化的OspA是基本上不含脂多糖和其它細菌蛋白的分離的、純化的和脂化的OspA。
4.根據權利要求3所述的免疫組合物，不含任何免疫原性增強佐劑。
5.根據權利要求3所述的免疫組合物，其中的額外抗原選自犬病原體抗原、馬病原體抗原和貓病原體抗原。
6.根據權利要求5所述的免疫組合物，其中的額外抗原是犬病原體抗原。
7.根據權利要求5所述的免疫組合物，其中的額外抗原是馬病原體抗原。
8.根據權利要求3所述的免疫組合物，其中的額外抗原選自狂犬病毒抗原、犬瘟熱病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原、細小病毒抗原及其混合物。
9.根據權利要求8所述的免疫組合物，其中的額外抗原是狂犬病毒抗原。
10.根據權利要求8所述的免疫組合物，其中的額外抗原包括犬瘟熱病毒抗原、腺病毒抗原、冠形病毒抗原、副流感病毒抗原和細小病毒抗原。
11.根據權利要求10所述的免疫組合物，其中的額外抗原是修飾的活病毒。
12.一種在對萊姆氏疏螺旋體病和除布氏疏螺旋體以外的哺乳動物病原體易感的哺乳動物體內誘發免疫反應的方法，包括給此哺乳動物施用如權利要求1中所述的組合物。
13.一種在狗或小狗中誘發免疫反應的方法，包括施用根據權利要求1-6、8或10中的任意一項所述的組合物，其中的額外抗原是犬病原體的。
14.一種在馬中誘發免疫反應的方法，包括施用根據權利要求1-5、7或9中的任意一項所述的組合物，其中的額外抗原是馬病原體的。
15.一種在馬中誘發針對布氏疏螺旋體的免疫反應的方法，包括給馬施用含有分離純化的布氏疏螺旋體OspA的組合物。
16.一種在狗或小狗中誘發針對布氏疏螺旋體的免疫反應的方法，包括給狗或小狗施用含有分離的、純化的布氏疏螺旋體OspA的組合物。
17.根據權利要求14或15中的任意一項所述的方法，其中OspA是基本上不含脂多糖和其它細菌蛋白的分離的、純化的脂化重組OspA。
18.根據權利要求17所述的方法，其中組合物不含任何免疫原性增強佐劑。
19.一種製備根據權利要求1所述的組合物的方法，包括以冷凍乾燥形式製備額外抗原、以液體形式製備布氏疏螺旋體抗原、並且用布氏疏螺旋體抗原使額外抗原重新水化。
全文摘要
本發明公開和要求權利保護的是含布氏疏螺旋體抗原的組合物以及製備和使用該組合物的方法。抗原可以是OspA。此組合物可包含至少一種額外的來自除布氏疏螺旋體以外的病原體的抗原。此組合物可用於在對萊姆氏疏螺旋體病和除布氏疏螺旋體以外的哺乳動物病原體易感的宿主哺乳動物體內誘發免疫反應。適當的宿主哺乳動物包括狗、小狗、馬,並且額外的抗原可以是犬、馬或貓病原體,例如狂犬病毒、犬瘟熱、腺病毒、冠形病毒、副流感病毒及細小病毒。未觀察到明顯的效能干擾。
文檔編號A61K39/175GK1252730SQ98804390
公開日2000年5月10日 申請日期1998年3月4日 優先權日1997年3月5日
發明者J·傑利克伊－布萊克 申請人:梅瑞爾有限公司