可降解pcfc－pei聚合物、製備方法及在藥物傳遞系統中的用途的製作方法

2023-05-23 14:47:51 2

專利名稱：：可降解pcfc－pei聚合物、製備方法及在藥物傳遞系統中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於藥用高分子材料領域，具體涉及一種同時傳輸化療藥物和基因藥物的可降解聚乙烯亞胺交聯聚合物PCFC—PEI及其製備方法和在藥物傳遞系統中用途。
背景技術：
：在腫瘤治療過程中，如果能夠將化學治療與基因治療相聯合，其治療效果將會出現協同或相加的作用，但目前還少有化療藥物和基因藥物的同時傳輸系統，因此開發出新型傳輸系統非常重要。有關聚乙烯亞胺(PEI)作為基因治療載體方面的文獻比較多。其中對PEI的聚乙二醇接枝共聚物(PEI-g-PEG)、水溶性脂聚體、可降解PEI、結合靶向單元的PEI進行了綜述；文獻中也透明質酸接枝聚乙烯亞胺共聚物、聚乙二醇-聚乙烯亞胺、殼聚糖-聚乙二醇-聚乙烯亞胺、聚甲基丙烯酸甲酯-聚乙烯亞胺、可生物降解的交聯聚乙烯亞胺等共聚物的製備，這些聚乙烯亞胺共聚物可作基因傳遞載體，或者藥物傳遞載體，但都未能作為化療藥和基因藥的同時傳輸載體。PEI25KD是轉染效率高的非病毒基因治療載體，但存在毒副作用大、且不可降解的缺點，因此至今未能進入臨床實驗。PCFC為可降解高分子材料，用PCFC自組裝製成的膠束能夠裝載紫杉醇、薑黃素、和厚樸酚等化療藥物，但難以裝載基因藥物。通常聚合物只能通過包裹的方式將DNA裝載到納米粒子的內部，但這一過程需要採用有機溶劑才能完成，通常這會導致基因藥物失活。目前對腫瘤的臨床治療的趨勢是採用兩種方案的協同治療，如果能將化療藥和基因藥同時裝載於一種載體內部，那麼這將會非常大地提高腫瘤治療的療效。本領域目前需要得到的可同時傳遞化療藥和基因治療藥物的載體材料。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種可同時傳遞化療藥和基因治療藥物的可降解載體材料。解決該技術問題的技術方案是提供一種聚乙烯亞胺交聯聚合物。本發明可降解聚乙烯亞胺交聯聚合物是由聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯(PCL—Pluronic—PCL，簡稱為PCFC)偶聯聚乙烯亞胺(PEI)而得到的交聯共聚物。其中，上述可降解PCFC—PEI聚合物中聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯共聚物部分的分子量為3000-IOOOOO道爾頓。其中，上述可降解PCFC—PEI聚合物中聚乙烯亞胺部分的分子量範圍為600-25000道爾頓其中，上述聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯共聚物中泊洛沙姆嵌段的分子量為1100-12500道爾頓。其中，上述可降解PCFC—PEI聚合物中聚乙烯亞胺部分的分子量範圍優選為1800-25000道爾頓。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種藥物釋放納米載體。該藥物釋放納米載體是由上述的PCFC—PEI交聯聚合物所製備而成。本發明所要解決的第三個技術問題是提供上述可降解PCFC—PEI聚合物的製備方法。該方法包括以下步驟a、準備聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯；b、稱量PCFC溶於溶劑中，轉移到惰性氣氛下，然後取甲基丙烯酸縮水甘油酯加入反應體系中，混合均勻，取二甲氨基吡啶溶於溶劑後，轉移到上述反應體系中，反應得GMA-PCFC-GMA;c、取GMA-PCFC-GMA溶於溶劑，轉移到惰性氣氛中，稱取PEI溶於溶劑中，轉移到反應系統中，惰性氣氛下在37。C6(TC下反應得PCFC—PEI交聯聚合物。進一步的，上述方法包括以下步驟a、加入一定量的Pluronic和己內酯，以辛酸亞錫為催化劑，在130。C氮氣保護下反應5h，然後將反應體系抽至真空，1h後，終止反應，待反應體系溫度降至室溫，得PCFC;b、稱量PCFC溶於無水二氯甲烷中，轉移到氮氣環境下，然後取GMA加入反應體系中，混合均勻，取DMAP溶於無水二氯甲烷後，轉移到上述反應體系中，室溫反應得GMA-PCFC-GMA;c、取GMA-PCFC-GMA溶於無水二氯甲烷，轉移到充滿氮氣的三頸瓶中，準取PEI溶於一定量的無水甲醇中，轉移到反應系統中，氮氣保護下在37'C6(TC下反應572小時，最後將產物凍幹，密封保存，即得。本發明所要解決的第四個技術問題是提供上述可降解PCFC—PEI聚合物在製備藥物組合物中的用途。本發明所要解決的第五個技術問題是提供一種藥物組合物。該藥物組合物是由上述的可降解PCFC—PEI聚合物作為載體材料包封藥物有效成分所製備而成。其中，上述藥物組合物中同時包封有腫瘤化療藥物和基因治療藥物。進一步的，上述藥物組合物的劑型為納米粒、毫微球或膠束。本發明可降解PCFC—PEI聚合物能夠將和厚樸酚、薑黃素或紫杉醇等化療藥物與裝載有EGFR、FAK等基因的表達載體同時傳輸，並且由於有PCFC的引入，帶來了好的可降解性具有很好的具有可控的可降解性、合格的安全性、好的機體適應性。形成的納米粒子的粒徑均一，穿透性好；裝載了藥物的本發明可降解PCFC—PEI聚合物納米膠束療效更強，節約藥物的用量；也更能保護基因治療藥物的的活性不致失去，更為穩定；比現有技術的安全性更好，克服了現有技術的種種弊端。本發明可降解PCFC—PEI聚合物製備方法步驟簡單，成本低廉，條件可控，適用於大規模生產。圖1為GMA-PCFC-GMA(GCFCG)的合成產物的4-NMR核磁圖譜。圖2為PCFC-PEI25000交聯共聚物的4-NMR核磁圖譜。圖3為PCFC合成產物的4-NMR核磁圖譜。圖4為PCFC-PEI1800交聯共聚物的111-NMR核磁圖譜。圖5為直觀表示PCFC-PEI交聯共聚物具有裝載小分子化療藥物薑黃素curcumine的能力。圖e為用凝膠阻滯分析證明PCFC-PEI交聯共聚物同時裝載小分子化療藥物和基因治療藥物的能力。圖7表示裝載有pcDNA3.1的PCFC-PEI1800交聯共聚物膠束將pcDNA3.l轉入HEK293細胞(a):HEK293細胞在轉染24小時後的綠色螢光顯色圖，膠束與DNA的w/w為80;(b):表示對照組24小時後的綠色螢光顯色圖，少見有綠色螢光蛋白表達。圖8為PCFC—PEI1800與pcDNA3.l形成的膠束納米粒子的粒徑，(本申請中PCFC—PEI常簡寫為PEAs)。圖9為PCFC—PEI1800與pcDNA3.1形成的膠束納米粒子的ZETA電位。圖10為PCFC—PEI25000與pcDNA3.1按不同N/P值製成的膠束納米粒子在瓊脂糖凝膠電泳中的表現。圖12-a表明隨PCFC—PEI25000用量的增加，pcDNA3.l得到更好的包封；圖12-b，為將製得的膠束納米粒子用足量DNasel處理後，再用lmg/ml的肝素處理使納米粒子中裝載的pcDNA3.l釋放後再進行電泳，DNA+泳道為經DNasel處理後的pcDNA3.1。圖11為PCFC—PEI1800與pcDNA3.1按不同N/P值製成的膠束納米粒子在瓊脂糖凝膠電泳中的表現。圖12為經不同濃度PCFC-PEI交聯共聚物(PEAs，由數均分子量25000的PEI製得)和數均分子量25000的PEI處理後的293細胞生存率。細胞生存率為570nm下試驗組的吸收值/對照組吸收值X100。/。.。圖13為經不同濃度PCFC-PEI交聯共聚物(PEAs，由數均分子量1800的PEI製得)和數均分子量1800的PEI處理後的293細胞生存率。具體實施方式主要儀器及試劑MALVERN粒徑儀(MALVERNNanoZS，英國)、GMA(甲基丙烯縮7K甘油酯，Aldrich，美國)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP，Aldrich，美國)，辛酸亞錫(Stannousoctoate，Sigma，美國)，薑黃素(curcumine，Aldrich，美國)，e-己內酉g(Sigma，美國)，DMSO(dimethylsulfoxide,Sigma，美國)，泊洛沙姆(平均分子量1100-12500的多種，Sigma，美國)，聚乙烯亞胺(平均分子量範圍1800—25000的多種，Sigma，美國)，旋轉蒸發儀(BUchi，2升，瑞士)，水為雙蒸水，其餘試劑為常規市售AR級(分析純)試劑。實施例一本發明PCFC—PEI的製備泊洛沙姆(Pluronic105)Mn=1900g/mole-己內酉g(e-CL)Mn=114g/mol甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)Mn=142g/mold=l.04g/ml二甲氨基吡啶DMAPMn=122g/mol分枝PEI(Sigma，美國)Mn=25000g/mol1、PCFC合成在裝有攪拌器的三口燒瓶中按反應式加入的Pluronic105(Mn=1900)和己內酯(e-CL)，以辛酸亞錫為催化劑，在130。C氮氣保護下反應5h，然後將反應體系抽至真空。1h後，終止反應，待反應體系溫度降至室溫，用三氯甲烷溶解聚合物，然後將其倒入冷石油醚中沉澱，如此溶解沉澱處理3次，最後將純化的聚合物真空乾燥後備用，理論數均分子量PCFC二2900g/mo1。反應方程式如下，式中X、Y、Z均為正整數準確稱量合成的PCFC，溶於無水二氯甲烷中，攪拌使其充分溶解。溶解完全後，迅速轉移到充滿氮氣的三頸瓶中。然後準確量取GMA加入上述反應體系中，繼續攪拌使其充分混合均勻。準確稱取DMAP溶於少許無水二氯甲烷中，攪拌使其充分溶解。溶解完全後，迅速轉移到上述反應體系中。氮氣環境、室溫下反應、48小時後反應結束。實驗完畢後，除去部分溶劑，用冷的石油醚洗滌產品，反覆數次，以除去過量的GMA。最後真空、室溫，乾燥l-2天，產品留以備用。理論數均分子量二3100-3200g/mo1，產物的核磁圖譜如圖l所示。反應方程式如下formulaseeoriginaldocumentpage8稱取GMA-PCFC-GMA溶於一定量的無水二氯甲烷，攪拌使其充分溶解，溶解完全後，轉移到充滿氮氣的三頸瓶中。準確稱取branchPEI(Mn=600-25000)溶於一定量的無水甲醇中，攪拌使其充分溶解，溶解完全後，轉移到上述反應系統中。4(TC氮氣保護反應48小時，進行麥可氏加成反應。反應驗結束，除去部分溶劑，用冷的石油醚洗滌產品，反覆數次。常溫，真空乾燥數小時。所得產品溶於水，用Mw5000的透析袋透析3-4天。最後冷凍乾燥，得產品。反應方程式如下，X、Y均為大於l的正整數formulaseeoriginaldocumentpage9上述製備得到的PCFC和PCFC-PEI共聚物的核磁圖譜如圖2所示，結果表明其均已成功合成。用凝膠排阻色譜(SEC)-多角度雷射散射(multipleanglelaserlightscattering，MALLS)聯用測得其數均分子量為4.3X104，重均分子量為l.0X105。實施例二本發明PCFC—PEI的製備泊洛沙姆(Pluronic105)Mn=1900g/mol己內酉g(e—CL)Mn=114g/mol甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)Mn=142g/mold=l.04g/ml二甲氨基吡啶DMAPMn=122g/mol分枝PEI(Sigma，美國)Mn=1800g/mol使用M『1800的PEI合成本發明PCFC-PEI交聯共聚物具體反應條件見實施例一。主要步驟為1、PCFC合成；2、GMA-PCFC-GMA(GCFCG)的合成，產物的核磁圖譜如圖3所示；3、麥可氏加成反應合成PCFC—PEI，產物的核磁圖譜如圖4所示，結果表明產物成功合成。實施例三PCFC—PEI納米膠束的製備和裝載化療藥物稱取1OmgPCFC—PEI共聚物加入到50°C的1毫升的蒸餾水中，5分鐘後由於溫度引起的PCFC—PEI膠束形成。將PCFC—PEI膠束冷卻到37'C保存備用。用馬爾文粒度儀檢測其粒徑大小，發現本隨著PCFC—PEI膠束的粒徑、Zeta電位隨著溫度有所變化。結果表明可通過溫度來控制PCFC—PEI納米膠束的尺寸。化療藥物薑黃素、和厚樸酚、紫杉醇等容易裝載於本發明PCFC—PEI共聚物納米膠束中，方法為將上述小分子化療藥物加入到製備好的PCFC—PEI膠束中，採用超聲分散器(JY92一2D，寧波新芝)進行超聲分散，30分鐘後，化療藥物一膠束的混合物採用高速離心的方法進行分離，將沒有裝載到納米膠束內部的化療藥物沉澱分離出來，所得的澄清膠束溶液即為載有化療藥物的PCFC—PEI膠束溶液。通過本發明所製備的載有化療藥物的PCFC—PEI納米膠束，經Malvern粒徑儀檢測平均粒徑小於200nm，且均一性好。使用本發明PCFC—PEI載體裝載基因藥物。過程如下在37。C下，將不同重量比例的pDNA加入到上述製備的PCFC—PEI膠束溶液中，10分鐘後，即可得到載有基因治療藥物的複合藥物。使用本發明PCFC—PEI載體同時裝載化療藥物和基因藥物。過程如下在37。C下，將不同重量比例的pDNA(質粒pcDNA3.1，含有綠色螢光蛋白基因作為報告基因，Invitrogen，USA)加入到上述製備的載有化療藥物的PCFC—PEI膠束溶液中，10分鐘後，即可得到同時載有化療藥和基因治療藥物的複合藥物。圖5為直觀表示PCFC-PEI交聯共聚物具有裝載小分子化療藥物薑黃素curcumine的能力'l'瓶是非常渾濁的薑黃素水混懸液；'2'瓶為裝載薑黃素的PluronicF127膠束；'3'瓶是裝載薑黃素的PCFC-PEI交聯共聚物.圖e為用凝膠阻滯分析證明PCFC-PEI交聯共聚物同時裝載小分子化療藥物和基因治療藥物的能力。第l道是單獨的DNA(質粒pcDNA3.1)，第12道為maker.第2道到第6道分別為裝載有薑黃素的PCFC-PEI交聯共聚物膠束與DNA(質粒pcDNA3.l)形成的複合物，膠束與DNA的重量比分別為1:4，1:2，1:1，2:1and4:1;第7道到第11道分別為裝載有和厚樸酚的PCFC-PEI交聯共聚物膠束與DNA(質粒pcDNA3.l)形成的複合物，膠束與DNA的重量比分別為1:4，1:2，1:1，2:1and4:1。圖7表示裝載有pcDNA3.1的PCFC-PEI1800交聯共聚物膠束將pcDNA3.l轉入HEK293細胞(a):HEK293細胞在轉染24小時後的綠色螢光顯色圖，膠束與DNA的質量比為80:1;經流式細胞儀檢測轉染效率為17%;(b):表示對照組(同樣質量比的PEI1800)24小時後的綠色螢光顯色圖，少見有綠色螢光蛋白表達，轉染效率為0.5%。從上可見，在超聲波的幫助下，和厚樸酚和薑黃素都容易被裝載入PCFC-PEI交聯共聚物膠束，這表明本發明PCFC-PEI交聯共聚物具有同時傳輸至少兩種不同的化療藥物的能力。另夕卜，包埋了小分子藥物的PCFC-PEI膠束的zeta電位並沒有受到明顯的影響，同時還具有裝載DNA的能力。凝膠阻滯實驗表明PCFC—PEI可以保護DNA，而防止DNA的降解。同時PCFC—PEI裝載小分子藥物和基因藥物具有可降解和緩釋效果在載藥轉染HEK293細胞(PCFC-PEI/DNA質量比是3:1)的轉染24小時後還能檢測到所攜帶的質粒子上的基因的表達。同時，所裝載的和厚樸酚也從PCFC—PEI膠束中逐漸緩慢。表明至少24小時內，該載體所裝載的小分子藥物和基因治療藥物都能緩慢釋放並持續發揮作用。試驗例一本發明PCFC—PEI交聯共聚物的包封試驗本試驗是對PCFC—PEI交聯共聚物的包封方法，尤其是對質粒DNA的包封條件進行探討。由於本發明PCFC—PEI交聯共聚物易於與小分子藥物和DNA形成膠束，而小分子化療藥物一般用量較少，這裡主要對PCFC—PEI交聯共聚物與DNA的配比進行試驗(PCFC—PEI交聯共聚物與質粒DNA的重量比用N/P表示)。分別使用上述製備的PCFC—PEI25000和PCFC—PEI1800與pcDNA3.1按不同的質量比製成膠束納米粒子進行試驗。PCFC—PEI25000和PEI25000分別按不同的質量比與pcDNA3.l形成的膠束納米粒子的粒徑見表l，ZETA電位見表2。結果表明PCFC—PEI25000形成的粒子粒徑更大，ZETA電位明顯更低tableseeoriginaldocumentpage12PCFC—PEI1800與pcDNA3.l形成的膠束納米粒子的粒徑見圖8，ZETA電位見圖9。結果表明隨PCFC—PEI1800用量的增加，包封形成的膠束納米粒子的粒徑變/、ZETA電位變大。tableseeoriginaldocumentpage12圖1O為PCFC—PEI25000與pcDNA3.1按不同N/P值製成的膠束納米粒子在瓊脂糖凝膠電泳中的表現。圖10-a表明隨PCFC—PEI25000用量的增加，pcDNA3.l得到更好的包封，N/P值l以上就包封得較好；圖10-b，為將製得的膠束納米粒子用足量DNasel處理後，再用lmg/ml的肝素處理使納米粒子中裝載的pcDNA3.l釋放後再進行電泳，結果表明N/P值2及以上，均能很好的抵抗DNasel的降解作用。圖11為PCFC—PEI1800與pcDNA3.1按不同N/P值製成的膠束納米粒子在用瓊脂糖凝膠電泳中的表現。結果表明N/P值0.5時能較好的包封。試驗例二本發明PCFC—PEI交聯共聚物的細胞毒性實驗採用MTT法評價本發明PCFC—PEI交聯共聚物對293細胞毒性作用。293的培養基為DMEM，細胞在5%C02和37。C條件下培養待用。以104細胞/孔的密度將細胞接種於96孔板。培養24小時後，用無血清培養基置換，分別加入PCFC—PEI納米膠束，使之終濃度為l、2、5、7、10和20yg/ml。生理鹽水和PEI25000(1、2、5、7、10和20yg/ml)為對照組。48小時後，去除含納米膠束培養基，每孔加入100ul新鮮培養基和10ulMTT溶液(5mg/ml)在37。C下孵育4小時，吸棄培養基，用無血清培養基洗1次，然後每孔加入200ul鹽酸-異丙醇(0.lmol/L)，混勻，使紫色結晶完全溶解。以570nm波長測定光密度值。結果PCFC—PEI(PEI25000)納米膠束的體外細胞毒性研究結果見圖ll。總的來說，PCFC—PEI納米膠束對人293細胞等毒性作用均較低。與對照組相比，PCFC—PEI納米膠束在5、7、10和20yg/ml的中高處理濃度下，毒性作用顯著低於相同濃度的PEI25000。本發明還評價了PCFC—PEI(其中PEI分子量1800)與的PEI1800(數均分子量為1800)的細胞毒性，試驗方法同上，結果表明PCFC—PEI(其中PEI分子量1800)對293T細胞的毒性仍然小於相同濃度的PEI1800，結果見圖12。結果表明本發明所製備的PCFC—PEI膠束等納米粒子細胞毒性小，且PCFC—PEI納米粒子細胞毒性與PEI膠束相比明顯的小。總之，本發明載體材料具有良好的生物相容性。上述實例表明，本發明提供了一種能夠同時裝載化療藥物和基因治療藥物的新型PCFC—PEI交聯共聚物載體材料。由於PCFC—PEI具有良好的生物相容性，能夠同時裝載化療藥物和基因藥物，並且可以生物降解。因此，該新型載體在抗腫瘤藥物的製備領域具有廣闊的應用前景。權利要求1.可降解PCFC-PEI聚合物，其特徵在於由聚己內酯-泊洛沙姆-聚己內酯偶聯聚乙烯亞胺而得到的交聯共聚物。2根據權利要求1所述的可降解PCFC—PEI聚合物，其特徵在於其中聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯共聚物的分子量為3000-100000道爾頓。3根據權利要求1所述的可降解PCFC—PEI聚合物，其特徵在於聚乙烯亞胺的分子量範圍為600-25000道爾頓。4根據權利要求2任一項所述的可降解PCFC—PEI聚合物，其特徵在於所述的聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯共聚物中泊洛沙姆嵌段的分子量為1100-12500道爾頓。5一種藥物釋放納米載體，其特徵在於由權利要求14任一項所述的可降解PCFC—PEI聚合物所製備而成。6一種製備權利要求14任一項所述的可降解PCFC—PEI聚合物的方法，其特徵在於包括以下步驟a、準備聚己內酯-泊洛沙姆一聚己內酯；b、稱量PCFC溶於溶劑中，轉移到惰性氣氛下，然後取甲基丙烯酸縮水甘油酯加入反應體系中，混合均勻，取二甲氨基吡啶溶於溶劑後，轉移到上述反應體系中，反應得GMA-PCFC-GMA;c、取GMA-PCFC-GMA溶於溶劑，轉移到惰性氣氛中，稱取PEI溶於溶劑中，轉移到反應系統中，惰性氣氛下在37。C6(TC下反應得PCFC—PEI交聯聚合物。7權利要求14任一項所述的可降解PCFC—PEI聚合物在製備藥物組合物中的用途。8藥物組合物，其特徵在於由權利要求14任一項所述的可降解PCFC—PEI聚合物作為載體包封藥物有效成分所製備而成。9.根據權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於同時包封有腫瘤化療藥物和基因治療藥物。10.根據權利要求8或9所述的藥物組合物，其特徵在於所述的藥物組合物的劑型為納米粒、毫微球或膠束。全文摘要本發明屬於藥用高分子材料領域，具體涉及一種能同時傳輸化療藥物和基因藥物的可降解聚乙烯亞胺(PCFC-PEI)交聯聚合物及其製備方法和用途。本發明PCFC-PEI載體是由聚己內酯泊洛沙姆-聚己內酯偶聯聚乙烯亞胺而得到的一種新型載體材料，其中泊洛沙姆為聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇三嵌段共聚物，其分子量為1100-12500，聚乙烯亞胺段的分子量為600-25000。該可降解聚乙烯亞胺交聯聚合物可以作為新型藥物釋放載體使用，能夠將小分子化療藥物與基因治療藥物同時傳輸，這在抗腫瘤藥物的製備中具有廣闊的應用前景。文檔編號C08G81/00GK101665574SQ200910308100公開日2010年3月10日申請日期2009年10月9日優先權日2008年10月9日發明者霞趙,鄧洪新,錢志勇,魏於全申請人:四川大學