一種分離純化胰蛋白酶的方法

2023-05-24 00:33:21

專利名稱：一種分離純化胰蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及純化胰蛋白酶的方法。
背景技術：
胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點約為pH8. 9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近(23300)，其等電點約為pH10. 8，最適pH7. 6 8. 0，在pH = 3時最穩定，低於此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH > 5時易自溶；Ca2+離子對胰蛋白酶有穩定作用。胰蛋白酶能催化蛋白質的水解，對於由鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸)的羧基與其他胺基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專ー性。此外還能催化由鹼性胺基酸和羧基形成的醯胺鍵或酯鍵，其高度專ー性仍表現為對鹼性胺基酸一端的選擇。胰蛋白酶作為蛋白酶的ー種，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的胺基酸排列中，它成為不可缺少的工具。此外還有抗炎症作用。臨床上用於膿胸、血胸、外科炎症、潰瘍、創傷性損傷、瘻管等所產生的局部水腫、血腫及膿腫等。還可用於治療毒蛇咬傷，也常用於動物細胞培養前對組織的處理。用傳統的方法僅提取胰蛋白酶是相當困難的。2006年7月上海阿敏製藥有限公司公開了ー種糜胰蛋白酶的製備方法(200610023582. 0)，其採用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、こ醇醇析的產品エ 藝，得到糜胰蛋白酶。2011年I月馬忠仁等申請了ー種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682. X)，其採用了 CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時加入飽和度的(NH4)2SO4，使其生成硫酸鈣沉澱吸附糜胰蛋白酶，經過洗脫、鹽析、超濾和凍幹獲得白色的糜胰蛋白酶的凍乾粉末。產品均為糜胰蛋白酶，沒有單純的胰蛋白酶提取分離純化。

發明內容
本發明的目的是將提取的胰蛋白酶純化，得到較高純度的胰蛋白酶。相對於現有技術，本發明成本低，產品胰蛋白酶效價高，適合於規模化生產。本發明的技術方案是將胰蛋白酶粗品溶解後，經鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍幹的方法，即可得較高純度的胰蛋白酶，包括如下步驟(I)投料稱取胰蛋白酶粗品，按每克胰蛋白酶粗品加2 4ml的水攪拌溶解，調節pH至3. 0±0. 5，以助其溶解，攪拌10 16小時；計量溶液體積，按400 500g/L比例加入固體硫酸銨，待其溶解後，靜置沉澱10 16小時；(2)鹽溶將溶液過濾，稱量濾餅重量,先按每克濾餅加入2_4ml的水，攪拌溶解後，調節pH至3. 0±0. 4，再按每克濾餅加入I 3ml的飽和硫酸銨溶液靜止沉澱10 16小時；
(3)鹽析將溶液過濾，量取濾液體積，加入等體積量的飽和硫酸銨溶液，靜置沉澱10 16小時；
(4)洗鎂將上清液棄去，沉澱物真空抽濾，並在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置I分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏鬥上剩餘的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重，待活化；
(5)活化稱濾餅重量為A千克，將濾餅溶於3A 5A升的O. 001 O. 01mol/L鹽酸溶液，另加入O. 5 2mol/L氯化鈣溶液A 3A升及pH7. 5 8. 5硼酸緩衝液4A 6A 升，再加入6A 9A升的水,調節pH至7. O 8. O,最後每克濾餅加5 15mg的結晶胰蛋白酶進行活化，將溶液置O 10°C中靜置60 80小時進行活化，pH控制在7. O 8. O ;
(6)除鈣活化後的溶液，調節pH至3. 0±0. 4，再按200 300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在O 10°C中存放32 60小時使硫酸鈣沉澱，過濾，濾液按150 250g/L 加入固體硫酸銨，在O 10°C中靜置10 14小時，過濾，得濾餅；
(7)結晶按每克濾餅加入I 2ml ρΗ8· O 10. O硼酸緩衝液，調節pH至8.0±0. 4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，O 10°C時浸於外透液中，結晶3 7天；
(8)透析取出結晶液過濾得結晶物，再按每克結晶物加入I 3ml水溶解，調節 pH至3. 0±0. 5 ;將溶液透析2 4天，去除雜質，每10 14小時左右透析池換水一次，溫度控制在O 10°C ；
(9)凍幹取出透析液，加入少量硅藻土，抽濾，得濾液，調節pH至6. O±0. 4，進凍幹機凍幹後得結晶胰蛋白酶成品。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明
實施例1
1.投料
1.1稱取胰蛋白酶粗品100. 0g，先用300ml純化水攪拌溶解，加2. 5mol/L硫酸溶液調節PH至3. O,以助其溶解，攪拌12小時；
1. 2計量溶液體積298. 4ml，加入固體硫酸銨140. 9g，待其溶解後，靜置沉澱12小時；
1. 3將溶液真空過濾，稱量濾餅重量96. 6g,加純化水289. 9ml,攪拌溶解後加2.5mol/L硫酸溶液調節pH 至3. 0，加入飽和硫酸銨溶液193. 2ml，靜止沉澱12小時；
1. 4將溶液過濾，量取濾液體積479. 3ml，加入飽和硫酸銨溶液479. 3ml，靜置沉澱 12小時；
1. 5洗鎂將上清液棄去，沉澱物真空抽濾，並在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液， 靜置I分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏鬥上剩餘的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重 93. 3g，待活化；
2.活化
將濾餅溶於373. 2ml0. 005mol/L鹽酸溶液，另加入lmol/L氯化鈣溶液186. 6ml及 PH8. O硼酸緩衝液466. 5ml，再加入746. 4ml純化水，調節pH至7. 4，最後加933mg活力較高的結晶胰蛋白酶進行活化處理，將溶液在5 10°C中靜置72小時進行活化，第二天測pH值為7. 4 ;3.除鈣活化後的溶液用2. 5mol/L硫酸溶液調節pH至3. 1，溶液體積為1873ml，再加入固體硫酸銨455. 2g，攪拌溶解，在0 10°C中存放48小時使硫酸鈣沉澱，過濾，濾液加入固體硫酸銨369. 0g，在0 10°C靜置12小時，過濾，得濾餅重量45. 6g ；4.結晶濾餅加入pH9. 0硼酸緩衝液68. 4ml,用2. 5mol/L硫酸溶液調節pH至8. 0,攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5 10°C浸於外透液中，結晶5天，每2小時搖包一次；5.透析取出結晶液過濾得結晶物28. 7g，加純化水43.1ml溶解，用2. 5mol/L硫酸調節pH至3. 0 ;將溶液裝透析袋，然後掛於透析池中透析3天，去除鹽類雜質，每12小時左右透析池換水一次，溫度控制在5 10°C ；6.凍幹取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏鬥抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調節PH至6. 0，進凍幹機凍幹後得結晶胰蛋白酶成品6. 2g，經測定其活性效價為2600iu/mg ；實施例21.投料

1.1稱取胰蛋白酶粗品120. 0g，先用300ml純化水攪拌溶解，加3. Omol/L硫酸溶液調節PH至3. 1，以助其溶解，攪拌12小時；1. 2計量溶液體積320. 4ml，加入固體硫酸銨128. 2g,待其溶解後，靜置沉澱12小時；1. 3將溶液真空過濾，稱量濾餅重量98. 3g,加純化水393. 2ml,攪拌溶解後加
2.5mol/L硫酸溶液調節pH至3. 2，加入飽和硫酸銨溶液294. 9ml，靜止沉澱12小時； 1.4將溶液過濾，量取濾液體積680.1ml，加入飽和硫酸銨溶液680.1ml，靜置沉澱15小時；1. 5洗鎂將上清液棄去，沉澱物真空抽濾，並在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置I分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏鬥上剰餘的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重96. 8g，待活化；2.活化將濾餅溶於484. OmlO. 01mol/L鹽酸溶液，另加入1. 5mol/L氯化鈣溶液193. 6ml及PH8. 5硼酸緩衝液387. 2ml，再加入677. 6ml純化水，調節pH至7. 5，最後カロ 970mg活力較高的結晶胰蛋白酶進行活化處理，將溶液在5 10°C中靜置72小時進行活化，第二天測PH值為7.4；3.除鈣活化後的溶液用3. 0mol/L硫酸溶液調節pH至3. 2，溶液體積為1892ml，再加入固體硫酸銨473. Og,攪拌溶解，在0 10°C中存放54小時使硫酸鈣沉澱，過濾，濾液加入固體硫酸銨370. 0g，在0 10°C靜置12小時，過濾，得濾餅重量47. 2g ；4.結晶
濾餅加入pH9. O硼酸緩衝液94. 4ml,用3. Omol/L硫酸溶液調節pH至8.1,攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5 10°C浸於外透液中，結晶5天，每2小時搖包一次；
5.透析
取出結晶液過濾得結晶物29. 5g，加純化水59. Oml溶解，用3. Omol/L硫酸溶液調節pH至2. 9 ;將溶液裝透析袋，然後掛於透析池中透析3天，去除鹽類雜質，每12小時左右透析池換水一次，溫度控制在5 10°C ；
6.凍幹
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏鬥抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調節PH至6. 2，進凍幹機凍幹後得結晶胰蛋白酶成品7. 4g，經測定其活性效價為2590iu/ mg ；
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的 任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
權利要求
1.一種分離純化胰蛋白酶的方法，其特徵在於將胰蛋白酶粗品溶解後，經鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍幹，即可。
2.根據權利要求1分離純化胰蛋白酶的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟(1)投料取胰蛋白酶粗品，加水溶解，調節PH，攪拌；加入硫酸銨，溶解，靜置；(2)鹽溶過濾,濾餅加水,攪拌溶解,調節pH，加入飽和硫酸銨溶液，靜置；(3)鹽析過濾，濾液中加入飽和硫酸銨溶液，靜置；(4)洗鎂將上清液棄去，抽濾，並在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置I分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏鬥上剩餘的硫酸鎂溶液傾去，濾餅待活化；(5)活化將濾餅溶於鹽酸溶液，加入氯化鈣溶液及硼酸緩衝液，再加水，調節pH，最後加入結晶胰蛋白酶進行活化，將溶液靜置；(6)除鈣將活化後的溶液調節pH，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置，過濾，濾液加入固體硫酸銨，靜置，過濾，得濾餅；(7)結晶濾餅中加入硼酸緩衝液，調節pH，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸於外透液中；(8)透析過濾得結晶物，加水溶解，調節pH;將溶液透析，去除雜質；(9)凍幹取出透析液，抽濾，得濾液，調節pH，凍幹後得結晶胰蛋白酶成品。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(I)中，胰蛋白酶粗品用水溶解，粗品與水的重量比為1: 2-1 4，調節pH至3. 0±0. 5，攪拌10 16小時；每升溶液加入 400 500g固體硫酸銨，待其溶解後，靜置沉澱10 16小時。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，稱取濾餅重量，加水的重量為濾餅重量的2 4倍，攪拌溶解後，調節pH至3. O ±O. 4，加入濾餅重量I 3倍的飽和硫酸銨溶液，靜置10 16小時。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(3)中，量濾液體積，加入等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置10 16小時。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(5)中，稱濾餅重量，加O.001 O.01mol/L鹽酸溶液將濾餅溶解，加入O. 5 2mol/L氯化鈣溶液，以及ρΗ7· 5 8. 5的硼酸緩衝液，再加入水，調節ΡΗ7. O 8. 0，最後每克濾餅加5 15mg的結晶胰蛋白酶進行活化處理，pH值控制在7. O 8. O ;所述鹽酸溶液的加入量為濾餅重量的3 5倍，所述氯化鈣溶液的加入量為濾餅重量的I 3倍，所述硼酸緩衝液的加入量為濾餅重量的4 6倍。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(6)中，活化後的溶液調節pH至3.0±0. 4，再按200 300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在O 10°C中存放32 60小時使硫酸鈣沉澱，過濾，濾液中按150 250g/L加入固體硫酸銨，O 10°C時放置10 14小時，過濾，得濾餅。
8.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(7)中，按每克濾餅加入I 2mlpH8. O 10. O硼酸緩衝液，調節pH至8. 0±0. 4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸於外透液中，溫度控制在O 10°C。
9.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(8)中，按每克結晶物加入I 3ml 水溶解，調節pH至3. O±O. 5，溫度控制在O 10°C，透析2 4天。
10.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(9)中，調節pH至6.0±0.4。
全文摘要
本發明公開了一種分離純化胰蛋白酶的方法，技術方案是將胰蛋白酶粗品溶解後，經鹽溶、鹽析，再用活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉變為有活性的胰蛋白酶，被激活的酶溶液再經結晶透析、凍幹，獲得較高純度的胰蛋白酶。胰蛋白酶精品收率在6％以上，活性效價在2500iu/mg以上。
文檔編號C12N9/76GK103060297SQ20121059801
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者劉冠男, 王議鋒, 劉翠珍, 宋超龍 申請人:青島九龍生物醫藥有限公司