血小板裂解物的組合物、用途和製備方法

2023-05-23 08:13:21

血小板裂解物的組合物、用途和製備方法
【專利摘要】在某些實施例中，本披露描述了包括耗盡了纖維蛋白原的血小板裂解物的組合物。在一個進一步的實施例中，該組合物進一步包括一種細胞培養基組分。本披露還提供了一種用於製備該組合物的方法，該方法包括以下步驟：(a)對血小板進行裂解，提供一種裂解物；(b)去除細胞碎片；以及(c)通過添加一種金屬鹽諸如氯化鈣而形成一種可去除的團塊來耗盡纖維蛋白原。另外，本披露還描述了使用所述方法生產的產物。
【專利說明】血小板裂解物的組合物、用途和製備
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月27日提交的美國臨時申請號61/501，411和2011年10月17日提交的美國臨時申請號61/547,897的優先權，兩者都通過引用以其全文特此結合。
[0003]領域
[0004]在某些實施例中，本披露描述了包括耗盡了纖維蛋白原的血小板裂解物和冷凍沉澱物的組合物。在一個進一步的實施例中，該組合物進一步包括一種細胞培養基組分。本披露還提供了一種用於製備該組合物的方法，該方法包括以下步驟:(a)對血小板進行裂解，提供一種裂解物；(b)去除細胞碎片；以及(c)通過添加一種金屬鹽諸如氯化鈣而形成一種可去除的團塊來耗盡纖維蛋白原。另外，本披露還描述了使用所述方法生產的產物。
[0005]背景
[0006]再生醫學是一個廣闊的領域，在該領域中運用了眾多技術以增強機體的自愈能力。一種這樣的技術是細胞療法。若干細胞類型已經被用於細胞療法，這些細胞類型包括但不限於胚胎細胞、新生兒細胞、體細胞、異種細胞和誘導性多功能細胞(inducedpluripotent cell)。間 充質幹細胞(MSC)通過使骨骼組織諸如骨、軟骨和腱再生同時也治療神經元變性和支持造血細胞植入而尤其具有經證實的治療效果。見例如Doucet (杜塞)等人，J Cell Phys (《細胞生理學雜誌》)，(2005)，205:228-236和Lange (蘭格)等人，JCell Physiol (《細胞生理學雜誌》)，(2007)，213:18-26。
[0007]以前的努力已經使用一種包含胎牛血清(FBS)的生長培養基來離體使供體細胞增殖。儘管在轉移到該受體之前對這些供體細胞進行了清洗，FBS在該培養基中的存在已經引起針對FBS的抗體的產生並且已經導致阿瑟氏樣反應(arthus-like reaction)。Selvaggi(塞爾瓦吉)等人，Blood (《血液》)，(1997)，89 (3): 776-9。關於動物朊病毒、病毒的和人畜共患病汙染的轉移的顧慮也圍繞著對FBS的使用。與在生長培養基中使用FBS相關聯的這些潛在的併發症已經造成了對於能夠保持細胞功能性的非異種生長補充劑的一種特別關注。
[0008]在使MSC離體增殖的努力中，自體的和同種異體的人血清都作為FBS的一種替代物進行了測試。同種異體血清導致了 MSC的細胞生長停滯和死亡。Shahdadfar(斯哈德發)等人，Stem Cells (《幹細胞》)，(2005) 23 (9): 1357-66。即使自體血清使MSC有效地增殖，務實的顧慮諸如血清的成本和可獲得性致使這種方法有些不切實際。見例如Kobayashi(小林)等人，J Bone Joint Surg Br (《骨與關節外科雜誌》)，(2005)，87 (10): 1426-33。以前的研究表明，從人血小板中釋放的生長因子有效地增強若干細胞類型包括MSC的生長。於是，最近的努力已經集中在使用血小板裂解物代替FBS作為一種細胞培養補充劑。
[0009]血小板能夠釋放多種生長因子，諸如多種血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子I (IGF-1)以及轉化生長因子β (TGF-β)。Sanchez (桑切斯)等人，Int J OralMaxillofac Implants (《口腔與上頜面植入國際雜誌》)，(2003)，18 (I):93-103。為了對細胞培養基補充這些生長因子的目的，血小板裂解物顯示出是優於血小板粘附和血小板凝集兩種方法的。Doucet(杜塞)等人，J Cell Phys(《細胞生理學雜誌》)，(2005)，205:228-236。[0010]儘管增強細胞生長，對未經處理的血小板裂解物的使用造成了它自身的一組併發症。直到最近，對離體細胞療法的臨床使用已經使用FBS作為一種細胞培養生長補充劑，而關於在臨床應用中使用血小板裂解物的考慮因素仍然有待解決。這些考慮因素包括細胞碎片、凝血因子和冷凍沉澱物的存在，連同在血小板裂解物的存在下所培養的細胞的這些免疫抑制特性。另外，在細胞培養物中對未經處理的血小板裂解物的使用導致了纖維蛋白原向纖維蛋白的轉化。一般而言，直接將肝素添加至該細胞培養物以防止這種轉化。見例如Schallmoser (斯卡爾莫斯)等人，Tissue Eng Part C Methods (《組織工程學部分C方法》)，(2008)，14(3): 185-96。儘管有對肝素的這種使用，大纖維束可以在這些培養基之內形成並且附著於MSC單層。 這帶有將這些纖維束輸注入患者的風險，潛在地導致微型閉塞或大型閉塞。因此，有需要去找到將纖維束的產生降低的改進的方法。
[0011]酶原凝血素在肝中產生。它在兩個位點被因子Xa酶促切割，產生凝血酶。凝血酶轉而通過纖維蛋白原向纖維蛋白的轉化介導凝血。纖維蛋白可以與轉穀氨醯胺酶因子XIII交聯，形成一種凝塊。該纖維蛋白可以聚結為纖維束，這些纖維束如果被轉移到患者體內是危險的，正如以上所說明的。肝素可以用於增加抗凝血酶對凝血酶和因子Xa兩者的親和性，潛在地擾亂凝血級聯。
[0012]概述
[0013]在某些實施例中，本披露描述了包括耗盡了纖維蛋白原的血小板裂解物和冷凍沉澱物的組合物。在一個進一步的實施例中，該組合物進一步包括一種細胞培養基組分。本披露還提供了一種用於製備該組合物的方法，該方法包括以下步驟:(a)對血小板進行裂解，提供一種裂解物；(b)去除細胞碎片；以及(c)通過添加一種金屬鹽諸如氯化鈣而形成一種可去除的團塊來耗盡纖維蛋白原。另外，本披露還描述了使用所述方法生產的產物。
[0014]在某些實施例中，該血小板裂解物組合物實質上耗盡了纖維蛋白原。在一些實施例中，該組合物所具有的纖維蛋白原的濃度為小於或大約2或4 μ g/mL。在一些實施例中，該組合物所具有的I3DGF-BB的濃度為多於或大約15、30或40ng/mL。在一些實施例中，該組合物不包含酸性檸檬酸鹽右旋糖(ACD)或不包含大量的鈣螯合性抗凝劑諸如酸性檸檬酸鹽。在一些實施例中，該組合物實質上不含有細胞碎片。在一些實施例中，該組合物實質上不含有冷凍沉澱物。在一些實施例中，該組合物實質上耗盡了凝血酶。
[0015]在一些實施例中，本披露涉及一種使用包括所述組合物的一種細胞培養基培養細胞的方法。典型的細胞培養基包含胺基酸和可任選的胰島素、激素、抗生素和糖類。在一些實施例中，這些經培養的細胞為體細胞、新生兒細胞、胚胎細胞、異種細胞或多功能細胞。在一些實施例中，這些經培養的細胞為MSC。
[0016]在一些實施例中，本披露涉及從選自以下的物種中擴增細胞:嚙齒類動物、豬、靈長類動物、人類靈長類動物和非人類靈長類動物。
[0017]在一些實施例中，本披露涉及一種製備該組合物的方法，該方法包括以下步驟:(a)對血小板進行裂解，提供一種裂解物；(b)去除細胞碎片；以及(C)實質上耗盡纖維蛋白原。在某些實施例中，該方法進一步包括以下步驟:(d)去除鈣螯合性抗凝劑，例如ACD，並且對該組合物進行再鈣化。在一些實施例中，在纖維蛋白原耗盡之前、在纖維蛋白原耗盡之後、或在纖維蛋白原耗盡之前和之後都將該細胞碎片去除。在一些實施例中，在去除細胞碎片之前、在去除細胞碎片之後、當對細胞碎片的去除未完成時、在耗盡纖維蛋白原之前、在耗盡纖維蛋白原之後、或在對纖維蛋白原的耗盡完成之前對多種血小板裂解物進行合併。在一些實施例中，該合併發生在過濾之前或之後。在一些實施例中，通過一次或多次解凍對血小板進行裂解。在一些實施例中，一種金屬鹽，諸如二價金屬鹽，典型的是一種鈣鹽，被添加至單獨的或經合併的裂解物中。在一些實施例中，肝素被添加至單獨的或經合併的裂解物中。在一些實施例中，對經合併的裂解物進行觀察，直至一種可見的凝塊出現。在一些實施例中，將所述可見的凝塊去除，例如通過離心。
[0018]在一些實施例中，本披露涉及通過在本文中所披露的方法生產的產物。在一些實施例中，該產物是滅菌的或實質上是不含有細菌的，例如是支原體陰性的。在一些實施例中，該產物所具有的纖維蛋白原的濃度為小於2、3、4、5、10、20或50 μ g/mL。在一些實施例中，該產物所具有的I3DGF-BB的濃度為大於1、5、10、15或40ng/mL。
[0019]在某些實施例中，披露涉及治療或預防在本文中所提供的疾病或病症的方法，這些方法包括將一個有效量的、包括經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物或組分的一種藥用組合物給予一名需要其的受試者。
[0020]在一些實施例中，本披露涉及作為一種局部試劑的用途和/或在眼科學中細胞產物的產生。在某些實施例中，本披露涉及治療或預防一種眼部疾病或病症的方法，這些方法包括將一個有效量的、包括在本文中所披露的組合物的一種藥用組合物給予一名需要其的受試者。在某些實施例中，該受試者對其有需要，因為該受試者被診斷為患有以下疾病、面臨以下疾病的風險或表現出以下疾病的症狀:鞏膜炎，角膜炎，角膜潰瘍或擦傷，角膜血管新生，Fuch營養不良，角膜結膜炎，虹膜炎，葡萄膜炎，白內障，脈絡膜視網膜炎，後睫狀體炎，脈絡膜視網膜瘢痕，脈絡膜視網膜變性，脈絡膜營養不良，脈絡膜出血或破裂，脈絡膜脫離，視網膜脫離，視網膜劈裂症，高血壓性視網膜病變，糖尿病性視網膜病變，與年齡相關的黃斑變性，黃斑變性，色素性視網膜炎，黃斑水腫，青光眼，飛蚊症，視神經病變，視神經乳頭玻璃疣，弱視，暗點， 夜盲症，紅眼，眼乾燥症，或失明。
[0021]在某些實施例中，本披露涉及治療或預防一種眼部疾病或病症的方法，這些方法包括將一個有效量的、包括在本文中所披露的血小板裂解物組分的一種組合物給予一名需要其的受試者。
[0022]在某些實施例中，通過將一種包括在本文中所披露的一種組合物的溶液滴在該受試者的眼中來給予該組合物。在某些實施例中，向眼的內部給予該組合物，例如通過穿過外眼的細胞插入至水狀液或玻璃狀液中的注射器或其他輸送裝置諸如細導管或管。
[0023]在某些實施例中，本披露想到使用經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物用於免疫抑制性單核細胞的繁殖。
[0024]在某些實施例中，本披露想到使用在本文中所產生和披露的間充質幹/基質細胞以在體內產生成骨細胞、脂肪細胞、和軟骨細胞、肌細胞和神經元。
[0025]在某些實施例中，本披露涉及組合物，這些組合物包括與通過一種凍融工藝產生的血小板裂解物相比較纖維蛋白原的量降低的血小板裂解物組分，例如其中該組合物實質上耗盡了纖維蛋白原並且這些血小板裂解物組分沒有實質上耗盡roGF。在某些實施例中，該組合物是一種具有小於2或4μ g/mL的纖維蛋白原濃度的水溶液，其中roGF-BB的濃度大於15ng/mL。在某些實施例中，本披露涉及多種組合物，這些組合物通過從在本文中所披露的血小板裂解物組合物中通過凍幹法去除水的工藝製成。[0026]在某些實施例中，本披露想到培養細胞的方法，其中細胞在一種培養基中進行培養，該培養基包括在本文中所披露的血小板裂解物組分。在某些實施例中，這些細胞為祖細胞或幹細胞諸如多功能幹細胞(pluripotent stem cell)、多潛能幹細胞(multipotentstem cell)、體幹細胞、間充質幹/基質細胞、脂肪來源幹/基質細胞、內皮幹細胞、牙髓幹細胞、胚胎幹細胞、骨髓或造血幹細胞、羊膜幹細胞、淋巴樣或髓樣幹細胞。
[0027]在某些實施例中，本披露想到治療一種創傷或創傷閉合的方法，這些方法包括向該創傷施用一種組合物，該組合物包括在本文中所披露的血小板裂解物組合物或組分。在某些實施例中，本披露想到創傷敷料，該創傷敷料包括在本文中所披露的血小板裂解物組合物或組分。創傷敷料的實例包括繃帶、紗布、膠例如氰基丙烯酸酯膠、或縫合線。在某些實施例中，該創傷敷料進一步包括一種抗生素。
[0028]附圖簡要說明
[0029]圖1顯示了圖形數據，這些圖形數據表明儘管有在纖維蛋白原上的降低，FD-PL和PhPL包含相似水平的所希望的生長因子如H)GF、TGF- β、EGF和BDNF，正如通過ELISA所測量的。
[0030]圖2顯示了在儲存7天之後進行的顯微鏡分析，該顯微鏡分析表明FD-PL (頂部)基本上不含有碎片，而PhPL (底部)包含不同大小的顆粒。
[0031]圖3顯示了 MSC在FBS、phPL和FD-PL中進行離體擴增的數據，這些數據證明與FBS和phPL兩者相比較，在FD-PL中培養MSC能夠顯著縮短倍增時間。
[0032] 圖4顯示了關於當在從FD-PL (GMP)和phPL (RG)中培養時，基於IDO誘導的MSC的INF- Y響應能力的數據，這些數據表明經FD-PL擴增的MSC具有優良的免疫抑制潛能。
[0033]圖5顯示了對FD-PL (頂部)、phPL (中間)和血清(底部)進行的顯微鏡分析(右側為左側的擴展視圖)，該顯微鏡分析表明FD-PL能夠促進一種⑶Ilb和⑶33陽性單核細胞群的附著和擴增。
[0034]圖6顯示了關於使用phPL (左側)、FD-PL (中間)和血清(右側)使人角膜上皮細胞(HCEC)生長的增殖(頂部)和生活力(底部)的數據。
[0035]詳細說明
[0036]使用肝素和金屬鹽類將纖維蛋白原從血小板裂解物中耗盡
[0037]血小板或凝血細胞是來源於前體巨核細胞破碎的不具有包含DNA的細胞核的細胞。血小板在哺乳動物的血液中循環，並且涉及止血，導致血液凝塊的形成。血小板去除法指的是收集這些血小板的方法。可以從全血中或通過一種裝置對血小板進行合併，該裝置將這些血小板分離並且將血液的其他部分返回到供體。典型地，在被稱為一種「軟旋轉(soft spin)」的事物中，血清被放入一種大離心機中。在這些設置下，這些血小板仍然懸浮於該血漿中。從這些RBC中將該富血小板的血漿(PRP)去除，並且然後在一種更快的設置下進行離心以從該血漿中收穫這些血小板。典型地，對這些所收集的血小板進行冷藏，以減緩這些細胞的降解。
[0038]如在本文中所使用的，術語「血小板裂解物」指的是血小板裂解的這些產物。該血小板裂解物還可以包括在其中包含這些經裂解的血小板的任何培養基。在本披露中，凍融是用於對細胞進行裂解的典型的但不是唯一的方法。機械裂解，典型地通過使用剪切力的使用，是所想到的用於產生一種裂解物的另一種方法。裂解緩衝液，典型地通過將這些細胞放置在一種低滲溶液中來起作用，是又另一種選項。該裂解工藝可以由這些方法的組合組成。
[0039]在某些實施例中，本披露涉及多種方法，其中將肝素和鈣鹽直接添加至血小板裂解物中，以便耗盡纖維蛋白原，使該裂解物再鈣化並中和檸檬酸鹽。在另一個實施例中，該產生的裂解物與細胞培養基結合。以前，在補充血小板裂解物之前，肝素被直接添加至細胞培養基；使用這種現有方法沒有呈現出纖維蛋白原耗盡的證據。見例如Schallmoser (斯卡爾莫斯)等人，Tissue Eng Part C Methods (《組織工程學部分C方法》)，(2008)，14(3): 185-96。
[0040]在一些實施例中，本披露涉及血小板裂解物的組合物，其中補體實質上耗盡。這種耗盡可以是通過多種手段獲得的，如在本文中所說明的。這種耗盡的一種用途是，這些實施例可以對於非人類細胞使用，同時最小化由人血小板裂解物產生的針對這些非人類細胞的任何補體介導的免疫反應性的風險。
[0041]典型地，酸性檸檬酸鹽右旋糖(ACD)被用作一種抗凝劑。見例如美國已公布的專利申請號12/441，870(A⑶被描述為「一種重要的血液抗凝劑」)。通過降低鈣的可獲得性，A⑶使該韓喪失了它所依賴的凝血機制。見例如Reich-Slotky (萊希-斯洛特克)等人,J ClinApher (《臨床血漿分離交換術雜誌》)，(2009)，24(6):265-8。用於在正常細胞活動中使用的鈣也被ACD降低，從而呈現出潛在的毒性。在本披露中，肝素被用作該抗凝劑，從而避免了 A⑶的這些潛在毒性的、鈣耗盡性的影響。添加一種鹽諸如一種鈣鹽，理想的是CaCl2，進一步中和了檸檬酸鹽毒性並且使該血小板裂解物再鈣化。在一些實施例中，該CaCl2溶解於一種緩衝液中，例如勃脈力(Plasmalyte) A。在一些實施例中，該CaCl2溶解於一種在大約pH7.4下的滅菌的、等滲的電解質溶液中。在某些實施例中，去除ACD (—種鈣螯合性抗凝劑)是在本文中所披露的方法的一部分。鈣螯合劑對細胞培養物是有害的，並且對鈣的充分提供導致了最佳的功能。另外，對生長因子的肝素誘導性穩定化以及對該產物的淨化是在本披露中所包含的結果。在某些實施例中，在本文中所披露的方法不要求使用ACD。
[0042]經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物(FD-PL或Multiplate FD)比未經處理的血小板裂解物有益。益處包括但不限於以下發現=Multiplate FD在對MSC進行擴增中優於未經處理的血小板裂解物和FBS，Multiplate FD是非異種的(即它不造成人畜共患病或朊病毒傳染的風險)，Multiplate FD去除了對在培養基中額外的肝素的需要，Multiplate FD避免了纖維束形成於培養基中並且附著於MSC單層的風險(即降低了微型閉塞或大型閉塞的風險)，Multiplate FD在製造用於自體免疫和同種免疫療法的MSC中在穩定性上優於未經處理的血小板裂解物，Multiplate FD保留了使用胎牛血清所見到的這些免疫抑制特性並且用於對來自多種譜系和物種的細胞進行擴增比未經處理的血小板裂解物更加通用。
[0043]在本披露中所描述的這些實施例可以應用至用於再生醫學、免疫療法、釋放生物活性因子、癌以及其他相關領域的臨床治療。
[0044]對血小板裂解物中蛋白成分的分析
[0045]使用RayBio'?人細胞因子抗體陣列C系列4000，對大約174種蛋白的相對表達水平進行了比較。在四種溶液(人血清、貧血小板血漿、粗血小板裂解物(PhPL)以及經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物(FD-PL))中的至少一種中對蛋白進行了檢測。在這116種蛋白中，87種可以在FD-PL中檢測到，而在phPL中，113種蛋白是可檢測的。在血清中，67種被檢測到，而在PPP中，60種蛋白被檢測到。典型地，在所有樣品中的這些最豐富的蛋白是MSP- a、ACRP30、血管生成素和RANTES。巨噬細胞刺激蛋白(MSP- α鏈)也被稱為HGF樣蛋白(肝細胞生長因子樣蛋白)和MSTl (巨噬細胞刺激I)。它是一種70kDa的由二硫鍵連接的雜二聚物(47和22kDa亞基)並且當有活性時通過⑶136進行信號傳導。30kDa的脂肪細胞補體相關蛋白(ACRP30)在結構上與脂連蛋白相同並且是一種強有力的胰島素增強劑。血管生成素也是一種由肝產生的豐富的血漿蛋白並且已經顯示出具有血管生成和抗炎兩種性質。Rantes或CCL5主要因它作為一種趨化細胞因子的活性而聞名，但是可以在宿主防禦中作為一種直接抗病毒劑而具有一種潛在的作用。既然每種或這些蛋白能夠被認為是血漿的一種正常組分，在所測試的各種溶液之間它們的水平無怪乎是相似的。於是在血清對PPP,FD-PL對PPP以及phPL對PPP之間進行了一種比例分析，以確定由於血小板脫粒/凝血或裂解，哪些因子被釋放或耗盡。六種蛋白顯示出了在FD-PL中提高的相對蛋白表達，而37種蛋白是降低的。特別令人感興趣的是與phPL相比較在FD-PL中在瘦蛋白、PDGF-AA和PDGF-AB水平上的提高，以及在若干MMP和炎性趨化因子上的降低。
[0046]在一項單獨的分析中，正常人血清、貧血小板血漿、粗血小板裂解物(phPL)和經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物(FD-PL)經過了胰蛋白酶消化並且使用質譜分析法針對蛋白表達進行了分析。載脂蛋白類是所檢測的蛋白的最高代表性的家族(N=3)，隨後是補體級聯的成員(N=6)。證實了我們的ELISA數據，MS分析顯示血小板裂解物的該製造方案耗盡了纖維蛋白原。與PhPL相比較，在FD-PL中纖維蛋白原水平降低了至少10倍，相比於貧血小板血漿更類似於血清水平。該製造方案還選擇性地耗盡了補體4、補體Cls亞組分以及補 體因子B，它們在phPL和PPP中被保留。與血清和PPP兩者相比較，血小板裂解物(phPL和FD-PL)包含可檢測的水平的若干種細胞骨架蛋白和細胞骨架關聯蛋白，如肌動蛋白、細絲蛋白、踝蛋白和斑聯蛋白。兩種PL都包含可檢測的水平的胸腺素β 4，FD-PL具有大約兩倍的phPL的ThB4的量。進一步，FD-PL耗盡了包括以下各項的因子:血液結合素、載脂蛋白CII1、載脂蛋白Al、α-2-巨球蛋白和α-1B-糖蛋白，但是針對a-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白L1、叢生蛋白/載脂蛋白J和血小板鹼性蛋白是增加的。
[0047]除了對補體和MMP的耗盡以外，纖維蛋白原和纖維蛋白耗盡增強了 FD-PL產物的安全性。纖維蛋白原被轉化為纖維蛋白。纖維蛋白據報導會誘導炎症。見Rowland (羅蘭)等人，Curr Eye Res.(《當前眼科研究》)1985，4(5):537-53。纖維蛋白能夠促使CEC產生IL-8。見Ramsby (拉姆斯拜)等人，Invest Ophthalmol Vis Sc1.(《眼科學及視覺科學研究》)1994，35 (12): 3980-90 以及 Drew (杜魯)等人，Invest Ophthalmol Vis Sc1.(《眼科學及視覺科學研究》)2000，41 (I):67-72.)。另外，纖維蛋白原能夠在單核細胞上通過TLR4直接進行信號傳導，以增加MCP-1MIP-1 α，MIP-1 β和ΜΙΡ-2。見Smiley (斯邁利)等人，J Immunol.(《免疫學雜誌》)2001，167 (5): 2887-94以及Sitrin (斯汀)等人，JImmunol (《免疫學雜誌》)161:1462 - 1470，1998。它能夠通過結合到在嗜中性粒細胞表面上的⑶Ilb/⑶18的α亞基上並且從而激活Erk信號傳導途徑來延長嗜中性粒細胞的炎症響應。見Rubel (魯貝爾)等人J Immunol (《免疫學雜誌》)166:2002 - 2010，2001。最後，已經顯示出的是，被吸附的纖維蛋白原是造成對許多植入材料的急性炎症響應的主要血漿組分。見Tang (唐)等人，JExp Med (《實驗醫學雜誌》)178:2147 - 2156，1993。因此，將纖維蛋白原從我們的血小板裂解物中耗盡降低了這種產物在培養中不利地影響細胞(如表達TLR4的MSC)的機會，並且創造了一種針對將這種產物向患者進行直接局部施用的更好的安全性屬性。
[0048]治療適應證
[0049]在某些實施例中，本披露想到在本文中所包含的經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物組合物可以直接使用或通過工藝諸如凍幹法，即冷凍乾燥法耗盡水分，以提供脫水產物，這些脫水產物可以被添加至細胞培養物和藥學上可接受的賦形劑中並且用於在本文中所提供的治療應用中。
[0050]乾眼是在造血幹細胞移植之後與慢性移植物抗宿主病相關聯的一種主要併發症。Pezzotta (皮札特)等人，Bone Marrow Transplant (《骨髓移植》)，2012，do1: 10.1038/bmt.2012.64，報導了自體血小板裂解物可以用於對眼部GvHD的治療。在某些實施例中，本披露涉及對乾眼的治療，該治療包括向一名受試者的眼睛給予一個有效量的、在本文中所披露的一種經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物組合物。
[0051]Sandri (山德利)等人，Int J Pharm (《國際藥劑學雜誌》)，2012，426 (1-2): 1-6報導了包含血小板裂解物的滴眼液對角膜潰瘍的治療是有用的。在某些實施例中，本披露涉及對角膜疾病或病症的治療，該治療包括向一名受試者的眼睛給予一個有效量的、在本文中所披露的一種經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物組合物。
[0052]FD-PL和phPL具有很多相似性，但是由於我們的製造步驟，存在對很多蛋白的一種選擇性耗盡和積累，這使得FD-PL成為一種獨特的產物。特別令人感興趣的是以下事實:FD-PL具有增加的量的TB4，TB4是一種具有血管生成、促存活和抗炎性質的因子，並且目前正在針對眼部組織再生進行臨床評價。
[0053]Ranzato (蘭扎特)等人，J Cell Mol Med (《細胞和分子醫學雜誌》)，2009, 13 (8B): 2030-8，報導了血小板裂解物促進人成纖維細胞的創傷擦傷閉合。在某些實施例中，本披露涉及經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物組合物或組分用於創傷癒合應用的用途。在某些實施例中，本披露涉及治療創傷的方法，這些方法包括向該受試者或在帶有一種創傷的該受試者的一個區上給予或施用一種包括經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物組分的組合物。該藥用組合物可以是處於一種洗劑或油或水溶液的形式，該洗劑或油或水溶液包含經纖維蛋白原耗盡的血小板裂解物組合物。
[0054]術語
[0055]如在本文中所使用的，術語「細胞培養基」指的是能夠支持哺乳動物細胞的體外增殖的任何培養基。典型地，這將包括一種在大約pH7.4下的等滲溶液，該等滲溶液包含胺基酸、一種或多種抗生素、維生素、鹽和葡萄糖。包含這些標準中的一些或全部的培養基的實例包括但不限於DMEM和RPMI。
[0056]如在本文中所使用的，術語「肝素」指的是具有抗凝劑性質的硫酸化多糖類、片段或衍生物中的任何種類。典型地,肝素類組合物是一種具有從大約3kDa至大約30kDa的一系列分子量的混合物。肝素結合至酶抑制劑抗凝血酶(AT)。當結合時，AT經受一種構象變化，並且被激活。該經激活的AT能夠使凝血酶和其他蛋白酶失活。這防止凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，從而擾亂凝血過程。
[0057]如在本文中所使用的，術語「MSC」指的是一種間充質幹細胞，也稱為一種間充質基質細胞。典型地，一種人MSC是通過表面標記物進行識別的，這些表面標記物包括CD29、CD44、CD45、CD51、CD71、CD73、CD90、CD105、CD 106 和 CD166。MSC 是多功能細胞，這些多功能細胞可以從機體內的多種位置獲得，諸如從骨髓、脂肪組織或血液。MSC是使用在本披露中所描述的這些實施例進行增殖的典型的但不是唯一的細胞類型。
[0058]如在本文中所使用的，術語「PDGF」指的是一種血小板衍生生長因子。在人血小板裂解物中，有多種類型的I3DGF(Gen Bank登錄號AAA60552.1)，包括TOGF-AB、PDGF-AA和PDGF-BB (Gen Bank登錄號CAA45383.1)。所有三種PDGF亞型都結合至PDGFR α，而PDGF-AB和PDGF-BB結合至TOGFRP。兩種TOGFR都是酪氨酸激酶受體。一旦被I3DGF結合，TOGFR就被磷酸化。這轉而刺激激酶催化活性連同針對包含SH2的下遊信號傳導分子的結合位點的形成。見Heldin (海爾丁)等人，Mechanism of action and in vivorole of platelet-derived growth factor (血小板衍生生長因子的作用機制和在體內作用)，Physiol Rev (《生理學評論》)，(1999)，Oct; 79 (4): 1283-316。PDGF 向 PDGFR 的結合能夠誘導許多生物效應。I3DGF具有多種多樣的生物功能。TOGF對胚胎發育是關鍵的，涉及中樞神經系統的發育，保持間質流體壓力，對血管系統具有一種血管生成作用，並且已經顯示出提高創傷癒合的速度。在體外，TOGF作為人血小板裂解物的一種組分，為了增殖細胞，尤其是MSC，已經顯示出是FBS的一種可行的替代物。見例如Horn (霍恩)等人,Impact of individual platelet lysates on isolation and growth of humanmesenchymal stromal cells (單獨血小板裂解物對人間充質基質細胞的分離和生長的影響)，Cytotherapy (《細胞療法》)，(2010)，12(7): 888-98。術語PDGF並非意在被限於任何特定序列，假定存在充分的序列同源性和功能屬性的話。
[0059]實驗
[0060]實例1:用於回收和纖維蛋白原耗盡的PL的製造。
[0061]大約10%體積的作為一種鈣螯合劑起作用的檸檬酸鹽被添加至血小板去除法產物(phPL)中，以防止在患者輸注之前該產物不慎凝結。對將一個再鈣化步驟插入至該phPL製造工藝中進行了測試，以評價是否產生了一種更加穩定和均勻的產物。照此，對氯化鈣的若干濃度和孵育時間進行了評價。
[0062]在這些研究期間，對以下條件進行了評價。
[0063]1.PL+5mM CaCl2, RT (112 小時)
[0064]2.PL+5mM CaCl2, 37°C (1-12 小時)
[0065]3.PL+1OmM CaCl2, RT (1-12 小時)
[0066]4.PL+1OmM CaCl2, 37°C (1-12 小時)
[0067]5.PL+16mM CaCl2, RT (1-12 小時)
[0068]6.PL+16mM CaCl2, 37。。(1-12 小時)
[0069]7.PL+20mM CaCl2, RT (1-12 小時)
[0070]8.PL+20mM CaCl2, 37。。(1-12 小時)
[0071]來自這些研究的數據證實了 5mM CaCl2在兩種溫度中任一種下都不能夠形成一種凝塊。IOmM 0&(:12在37°C下12小時能夠形成一種凝塊，然而這種凝塊幾乎完全固化，允許對上清液進行非常少的回收。CaCl2的這些更高的濃度也普遍地形成了完全剛性的凝塊，如果允許進行超過I小時的孵育的話。在隨後的實驗中，對在6-10mM之間的CaCl2濃度進行了評價。如果凝塊出現，它普遍地快速出現並且是完全的。另外，在啟動凝塊形成所必要的CaCl2濃度下，在多個批次之間有著變異性。
[0072]為了進一步改善這種工藝I)以2U/mL的濃度添加肝素，以控制該凝結步驟2)CaCl2溶解於勃脈力與水中，以提高穩定性3)進行一種雙凍融，以提高血小板膜裂解，和4)允許該凝塊在RT或37°C下形成持續I小時，然後在4°C過夜下。一旦將未經改性的phPL在細胞培養基中稀釋，在這些基礎培養基中存在的鈣足夠壓倒檸檬酸鹽螯合能力，這允許游離纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，該纖維蛋白然後能夠合併以形成一種凝塊。
[0073]使用了來自我們的第一次實驗的組5-8。所有的組都顯示出一定程度的凝塊形成，並且這些溶液在4度的過夜孵育允許該凝塊的穩定化。與我們的第一次實驗相比較，所實現的這些變化允許我們在第二天旋轉該溶液，並且回收這些溶液的大部分(即70%-80%)，而在更高CaCl2濃度下的這些第一次實驗中，我們的回收率接近20%。通過將肝素添加至該溶液，存在一些殘留的纖維蛋白原，然而這不足以導致隨後的凝膠形成的發生。變得明顯的是，使用一種雙凍融導致了像TOGF-BB之類的生長因子的釋放。基於這些實驗，一種雙凍融步驟之後是在2U/mL肝素的存在下用20mM CaCl2進行重新鑑定。其後在很多製造運行中進行這種工藝，以確立一致性。可以可靠地生產FD-PL產物，使得纖維蛋白原含量小於4ug/ml，在多個批次之間變異性大約為12%。未經處理的phPL典型地具有纖維蛋白原含量60 μ g/mL。特別令人感興趣的是以下事實:儘管有在纖維蛋白原上的降低，FD-PL和phPL包含相似水平的所希望的生長因子如H)GF、TGF-β、EGF和BDNF，正如通過ELISA所測量的。見圖1。
[0074]以下提供了一種從冷凍人血小板去除法產物中對FD-PL (Multiplate FD)進行的典型GMP製備。將大約五種人供體經復檢的過期的血小板去除法產物從冰箱中移出，並且在4°C過夜解凍。為了在_20°C重新冷凍，這些樣品然後被轉移到一種10，000級cGMP潔淨室。從每個樣品 中取小等分試樣用於微生物測試。具有無汙染的等分試樣的樣品然後在4°C過夜解凍。然後將樣品在4000rpm離心15分鐘，以便使用一種COBE細胞處理器使細胞碎片成為丸形。然後將來自每個樣品的上清液通過40μπι過濾器，並且然後合併在一起。然後將這種經合併的樣品濾液放置於250mL離心管中用於在3000g在4°C離心15min，以使任何剩下的碎片成為丸形。然後給予該產生的經合併的樣品上清液一種基於日期的八位數字ID (例如2010年12月13日=13122011)。然後添加16_20mM CaCl2 (溶解於勃脈力A中)，以再鈣化並中和該樣品中的檸檬酸鹽成分。然後將1.5-2.5單位/mL肝素(1000單位/mL貯液)添加至該樣品，以調整這種工藝。該樣品保持在37°C +/_2°C持續2-4小時，直至一種可見的凝塊出現。然後將該樣品放置於4°C持續16-24h，直至凝塊大小穩定化。將該樣品在3000g尚心15min。然後通過0.2um過濾對該樣品進彳丁淨化。然後將該樣品儲存於4 C或低至-80°C ±10°C冷凍。如果進行冷凍，取經合併的樣品的一個小等分試樣用於支原體無菌性測試以及纖維蛋白原/PDGF定量。如果支原體檢測是陰性的，纖維蛋白原濃度小於
2μ g/mL,並且F1DGF-BB濃度大於15ng/mL的話,該樣品被認可。
[0075]實例2:纖維蛋白原水平的最佳降低未顯著地改變生化或生長因子、細胞因子或趨化因子。
[0076]通過一種40 μ m PALL 輸血過濾器(PALL BIOMEDICAL, INC Fajardo, PR)對經解凍的血小板單位進行單獨過濾，並且允許合併入一個收集袋中。經合併的、經過濾的裂解物被平均等分入經標記的250ml錐形管(Corning? Lowell1MA USA)中，並且在室溫下在4600rpm旋轉20分鐘。對經旋轉的裂解物進行再次過濾(40 μ m)，等分入新的經標記的250mL錐形管中，並且逐步過濾至0.2 μ m(未經改性的PL)。然後將未經改性的血小板裂解物的等分試樣與各種濃度的CaCl2結合，並且在多個特定溫度下進行持續各種時間的孵育。一種優選的配方被發現是這些血小板單位的一種雙凍融，隨後再鈣化至20mM CaCl2並結合有2U/ml硫酸肝素，隨後在37V +/_2°C孵育2小時，以允許一種凝塊形成。這隨後是在4°C的16小時孵育，以允許凝塊大小穩定化。這個步驟允許纖維蛋白原大於150倍的降低，批次間變異性大約10%。在生物化學上，添加CaCl2至Multiplate FD導致了滲透摩爾濃度以及鈣和氯濃度高於未經處理的血小板裂解物的滲透摩爾濃度以及鈣和氯濃度，然而許多其他因子即Na、K、葡萄糖、總蛋白和白蛋白水平在未經改性的PL和Mul t ip late FD之間是沒有顯著差異的。
【權利要求】
1.一種組合物，包括與通過一種凍融工藝生產的血小板裂解物相比較纖維蛋白原的量降低的血小板裂解物組分。
2.如權利要求1所述的組合物，其中該組合物實質上耗盡了纖維蛋白原。
3.如權利要求1所述的組合物，其中這些血小板裂解物組分沒有實質上耗盡TOGF。
4.如權利要求1所述的組合物，其中該組合物是一種具有小於50μg/mL的纖維蛋白原濃度的水溶液。
5.如權利要求4所述的組合物，其中纖維蛋白原的濃度小於4μ g/mL。
6.如權利要求4所述的組合物，其中I3DGF-BB的濃度大於15ng/mL。
7.一種組合物，該組合物通過從如權利要求4所述的組合物中去除水的工藝而製成。
8.一種培養細胞的方法，其中在如權利要求1所述的培養基中對細胞進行培養。
9.如權利要求8所述的方法，其中這些細胞為祖細胞或幹細胞。
10.如權利要求9所述的方法,其中這些幹細胞為多功能幹細胞(pluripotentstemcell)、多潛能幹細胞(multipotent stem cell)、體幹細胞、間充質幹細胞、脂肪來源幹細胞、內皮幹細胞、牙髓幹細胞、胚胎幹細胞、骨髓或造血幹細胞、羊膜幹細胞、淋巴樣或髓樣幹細胞。
11.一種治療或預防一種眼部疾病或病症的方法，該方法包括將一個有效量的、包括如權利要求1所述的組合物的一種藥用組合物給予一名需要其的受試者。
12.—種治療創傷或創傷閉合的方法，該方法包括向該創傷施用包括如權利要求1所述的組合物的一種組合物。
13.—種創傷敷料，包括如權利要求1所述的組合物。
14.如權利要求13所述的創傷敷料，選自繃帶、紗布、氰基丙烯酸酯膠或縫合線。
15.如權利要求13所述的創傷敷料，進一步包括一種抗生素。
【文檔編號】C12N5/071GK103702674SQ201280036793
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年6月26日 優先權日:2011年6月27日
【發明者】伊恩·B·科普蘭, 雅克·加利波 申請人:愛默蕾大學, 亞特蘭大兒童醫療保健公司