用於評價患牙周炎的危險率的方法和裝置的製作方法

2023-05-23 23:46:16

專利名稱：用於評價患牙周炎的危險率的方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於測定病人患活性牙周炎或在口腔中患牙周炎的危險率方法的改進。
斑細菌移生到牙齒的侵入處並且引起細菌毒素、酶和可迅速發展成局限在齦組織的炎症(齦炎)的代謝產物。局部宿主組織對細菌病原體的侵入的炎症應答包括在對抗由斑病原體及其產物所帶來的組織損傷中擔任各種角色的多種類型的細胞(如多形核白細胞、淋巴細胞、血漿細胞、巨噬細胞)的浸潤。在許多個體中，斑病原體及與之相關的炎性應答的持續存在導致了牙周炎，包括對用於接合牙齒的結締組織以及支持牙齒的牙槽骨的進行性損害。
牙周附著器官由牙骨質、牙周韌帶和把牙齒連接到牙槽骨的槽部的牙周韌帶的組元纖維組成。對健康的牙周而言，牙周正好附著在牙齒釉質及牙根的牙骨質之間的接界的尖端。在臨床上，對牙齒上的一個特定部位牙周附著部分的損壞測定是一個校準過的牙周探頭測量根牙骨質界與釉質之間的距離和對牙周探針的探測產生機械阻力的牙周袋的基託的水平而完成的。如果存在附著損失，還可能出現牙周袋。如果由牙周病原體移生所致的附著損失的情況繼續發展，則可能導致牙槽骨損失。這種組織的損害可能放慢，但是用傳統的治療手段無法逆轉。
在患牙周炎的人口中，疾病發展的速度相差很大;此外，對個別的病人，疾病在口腔中的不同部位發展的速度也有很大不同。在口腔中，個別的牙齒及其相應的牙根表面所發生的牙周炎的嚴重程度有顯著的不同。目前，據認為該病的發展模式既可以是隨時間呈慢性地線性發展，也可以是按緩解時間區分的疾病活性突然發作的模式。顯然，在每一種情況下，對一患者群體作跟蹤時間考察時，在臨床上可表現出的疾病進行的情況患者的不同及在每個患者口腔中的部位不同會有明顯的不同。
檢測出發病危險率高的病人和部位可以事先區分出哪些病人和哪此部位是急需治療的或需要預防性處置的，以便阻止疾病發展到損害組織的階段。
目前，尚沒有有效的手段來評價患持續性的附著損失的病人或部位急性發病的危險率。疾病進行的臨床測量可提供早期疾病活性的測量結果，但是並不能提供區分各部位或各患者未來疾病活性水平高低的手段。
對斑病原體的宿主免疫應答包括同時產生出能使齦組織免受侵入的細菌的摧毀作用的分子以及在發生可摧毀牙周組織的宿主應答的分子。例如，淋巴細胞會產生可中和細菌及其有毒產物的阻止斑病原體的抗體。同時，炎性細胞能夠釋放出各種能分裂並降解關鍵的牙周組織結構成分中的蛋白質和多糖的水解酶。
為對抗牙周病原體而產生的抗體結合到病原體或它們的產物上，成為抗原-抗體複合體。這些抗原-抗體複合體導致了病原體及其產物的中和和凝集。複合體還通過多形核白細胞(PMN)促進了對病原體和其產物的吞噬作用、殺滅作用和降解。不過，這些抗原-抗體複合體中的一些會因為其激活補體體系的能力而引起次級炎性反應，所述的補體體系是能夠激活各種炎性機制的蛋白質水解酶的一個級聯。
作為一種水解酶和PMN激活的酶標誌的β-葡萄糖醛酸酶(BG)參與了粘多糖/蛋白多糖的酸降解。事實上，據報導，隨著牙周炎患者中發生活性牙周炎機會的增加，齦縫流體(GCF)中BG的水平也增加。因此，看來伴隨著活性牙周炎，牙周病原體在齦組織之中或周圍被PMN銜接的機會也增加了。
由於細菌病原體為發育齦炎和牙周炎所必需，因此測量特定的細菌病原體本身的存在與否並不是預測患活性疾病可能性的足夠的或有效的手段。結果，尋找預測未來疾病活性的手段的工作已集中於在在疾病過程中因宿主因子應答而流出的齦縫流體中可見的各種分子的締合(見Lamster，I.B.等人，縫流體中的酶活性對患慢性牙周炎病的患者中臨床附著損失的檢測和預測，J.Periodontol.，59，第516-523，(1988)(以後稱為Lamster)，及Palcanis，K.G.等人，用彈性硬蛋白酶做為牙周疾病進程的指示物，J.Periodontol.，63，第237-242，(1992)(以後稱為Palcanis))。
GCF包括與那些由在齦組織或齦縫中的宿主細胞相同的分子。因此，GCF提供了一個存在於齦組織中的宿主分子的圖象，並且可用於指示其中發生的應答和響應。目前的研究正傾向於集中在測量可以與破壞齦組織有關的宿主分子的存在。因此，測量可在齦縫流體中發現的各種炎性介體(例如前列腺素E2)、公認的組織破壞/水解酶(例如β-葡萄糖醛酸酶和彈性硬蛋白酶)以及作為細胞死亡的酶標誌(例如天冬氨酸轉氨酶)的含量並同牙周附著中測不出臨床變化的情況進行比較，以判斷這些數據與患活性疾病的危險增加的那些患者或部位的關係(見Lamster和Palcanis)。現已證明這些分子的存在與未來疾病活性的相關性尚未強到使足以成為一種普遍接受和可靠的預測疾病活性的方法。
本發明的一個目的是提供一種檢測人類及較低等的動物牙周疾病發生的增加危險率的方法。
本發明的一個進一步的目的是提供用於檢測和評價病人或人類或較低等動物中特定牙周位置的疾病發展的危險率的診斷裝置。
本發明涉及用於檢測或評價目前或以後發生活性牙周炎的危險率的方法和裝置，包括(a)採集槽縫流體;(b)測量槽縫流體中IgA的量;(c)測量槽縫流體中多形核白細胞標誌物的量;(d)比較步驟(b)與(c)中所得的量與一標準值的比值。
本發明涉及檢測人類及較低等的動物中病人或牙周位置患活性牙周炎的危險性的診斷方法。這些方法包括測量GCF中IgA和PMN標誌的水平，計算這些值的比率，並且用這個比率估價患活性牙周炎的危險率。出人意料的是，IgA/PMN標誌的比值看來反映出了宿主應答機制處於平衡態或非平衡態，從而指示了活性牙周炎發生的可能性。當一病人或一部位的IgA/PMN標誌的比值低於沒有患活性牙周炎的危險率的病人或部位中的所得的IgA/PMN標誌的比值時，該病人或部位患活性牙周炎的危險率在增加。
「牙周附著」在此處指支持牙槽骨的槽中的牙齒的結締組織的附著。
「牙周炎」一詞在此處指包括牙周附著和/或牙槽骨吸收在內的破壞組織的疾病。
「齦組織」在此處指牙齦組織和環繞牙齒和牙槽附著和牙槽骨的粘液膜。
「齦縫」在此處指同牙周附著的水平有關的、位於自出齦的內側部分與牙釉質或與牙骨質之間的空間。
「牙周槽」指與由齦附著向牙根的尖移行引起的牙周疾病有關的、異常深的齦縫。
「活性牙周炎」在此處專指一種牙周炎，其中發生了臨床上可檢測得到的結締組織附著損失和/或牙槽骨吸收的增加。
「非活性牙周炎」在此處指不可檢測出結締組織附著損失和/或牙槽骨吸收的增加的疾病。
「齦縫流體」和「GCF」在此處指從自由齦中的毛細管漏流所產生的在齦縫中採集的血漿漏出液。
「齦炎」在此處指齦組織的炎症。
「疾病」在此處指牙周炎。
「部位」在此處指為檢查牙周炎的有無而監視的牙周圍特定的位置(如在牙根的正中、遠中、頰向或舌向表面)。
「標誌」在此處指可以檢測和測量並且可指示是否存在一個或多個與疾病病理學機理相關的一個或多個特異性的分子。
「IgA」在此處指血清型免疫球蛋白A。
「PMN」在此處指多形核白細胞。
「GCF樣品」在此處指從一個部位或一個患者的齦縫所採集的相當數量的GCF。
「GCF試驗樣品」在此處指稀釋進一個標準體積的緩衝液中的GCF樣品，從所述的緩衝液中取出多個等分量用於隨後的GCFIgA或GCFPMN標誌的分析。
「GCFIgA」在此處指在一個GCF試驗樣品中檢測出的齦縫流體血清型IgA。GCFIgA包括IgA1及IgA2同位素，並且不限於對特定的抗原特異的IgA抗體。
「GCFBG」在此處指在一個GCF試驗樣品中所檢測到的活性β-葡萄糖醛酸酶的量。
「GCFPMN」在此處指從齦組織移生進齦縫的齦縫多形核白細胞。
「PMN標誌」在此處指用於一GCF試驗樣品中所檢測到的活性多形核白細胞的多種特定的標誌中的任何一種。
「GCFPMN的活化」在此處指GCFPMN與齦縫、牙周袋或牙周組織中的細菌的應答過程，所述的應答形成了對PMN代謝產物、酶和/或副產品的加工。
患活性疾病的危險率與IgA/PMN標誌的比值的相關性大小依賴於所選擇的PMN標誌。一些IgA/PMN標誌的比值相對於其他的比值而言是更可靠的預測值。用於本發明目的的待測的適用的PMN標誌包括那些代表PMN活化和去粒水平的標誌。這些標誌包括(但不限於)β-葡萄糖醛酸酶、水解酶、彈性硬蛋白酶、組織蛋白酶(如組織蛋白酶B/L及組織蛋白酶G)以及明膠酶，反映PMN的早期活化事件的髓過氧化物酶膠其代謝產物(如LTB4或LTC4)。優選的PMN標誌為彈性硬蛋白酶和β-葡萄糖醛酸酶。
可以用很多種方法得到GCFIgA/PMN標誌比，這些方法包括用一個GCF樣品中所存在的GCFIgA的總量除以一個GCF樣品中所存在的PMN標誌的總量;用GCF試驗樣品的一個標準可分量中所存在的GCFIgA的總量除以GCF試驗樣品的一個標準可分量中所存在的GCFPMN標誌的總量;用一個GCF試驗樣品中所存在的GCFIgA的濃度除以該GCF試驗樣品中所存在的GCFPMN標誌的濃度;或者用GCFIgA的濃度除以GCFPMN標誌的濃度。
可以用多種方法採集GCF。其中，這些方法包括Lamster、Hartley和Vogel等人的「關於齦縫流體的生化技術的進展」，J.Periodontology，56(增補)13-21，(1985)(以後稱為LamsterⅡ)，在此引入以供參考。通過採用上述那些採集方法，可以獲得GCF樣品。
測量GCFIgA的方法有許多方法可以用來測量GCF樣品中IgA的含量。這些方法包括(但不限於)採用酶連接免疫吸著測定(ELISA)技術的測定法，或者用作為檢測系統的放射免疫法(RIA)測定法。
用ELISA進行GCFIgA測量的方法見Sengupta等人，治療對患慢性牙周炎的成年患者的齦縫液體中的IgG、IgA、IgM和α-2-巨球蛋白的作用，Arch.Oral.OralBiol.，33，No.6，第425-431頁(1988年6月)(以後稱為Sengupta)，這篇文獻在此引入以供參考。這些敘述的方法以及改進了的ELISA法採用了一種非人類(最好是非靈長類)抗人類IgA「俘獲」抗體，該抗體是一種多克隆或單克隆抗IgA抗體製劑。所用的俘獲抗體對IgA特異並且不與人類IgG、IgM、IgE或IgD發生交叉反應。
此抗IgA「俘獲」抗體通常可與一種固體支持器(如一種微滴定培養板)或與一種顆粒基質(如膠乳)發生交聯。
在對試驗樣品培養期間，此「俘獲」抗體從GCF已溶解進的試驗樣品緩衝液或直接從GCF樣品本身俘獲GCFIgA，並且把它保持在用於有關的免疫測定試驗中的固體支持物/顆粒基質上。然後可以將所俘獲的IgA從剩下的GCF樣品成分中分離出來，分離的方法通常可以是輕洗GCFIgA所複合的表面或者過濾俘獲IgA所複合的顆粒狀複合體。接著使所俘獲的抗體-GCFIgA複合體暴露於一種抗體酶軛合物(如過氧化物酶-軛合的兔IgG)。
這種抗體-酶軛合物中採用了一種對人類IgA免疫球蛋白特異的、並且不與抗體-IgA俘獲抗體交叉應答的抗體。此抗體通常與一種產色酶(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶或糖苷酶)或與生物素相軛合/連接。如果發生生物素化抗體與所俘獲的IgA複合，隨後再用一種抗生物素抗體-酶軛合物(例如用一種上述的產色酶)或一種抗生物素蛋白-產色酶軛合物進行培養。然後可將上述俘獲-抗體-IgA-抗體-產色酶複合物暴露在適用於相應的軛合酶(如分別用於HRP和鹼性磷酸酯酶的鄰苯二胺二鹽酸鹽和對硝基苯酚磷酸酯)的產色底物。然後在一種適當的緩衝液中培養這個混合物，使發生一種產色反應，該反應的吸收和/或強度正比於被俘獲抗體所束縛的IgA的量(關於ELISA方法的背景，見Notermans，S.等人，用酶連接免疫吸收測定法(ELISA)檢測和確定肉毒梭菌毒素A、B和E，METHODSINENZYMOLOGY，84，pp223-238，(1984)(以後稱為Notermans);Butler，J.E.，放大的ELISA;在生化分離中相當數量的綱和亞綱的抗體以及抗體分布及抗原方面的原理和應用，METHODSINENZYMOLOGY，73，第483-523(1981)(以後稱為Butler);SigmaImmunoChemicalsCatalog1992(SigmaChemicalCompany)，(以後稱為Sigma);Engvall，E.等人，酶連接免疫測定法，ELISA，Ⅲ.由酶標誌抗免疫球蛋白對塗覆抗原的管中特異抗體進行定量化，J.OFIMMUNOL.109，pp，129-139(1972)(以後稱為Engvall);Kato，K.等人，酶聯免疫測定免IgG的FAB片段與大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的結合及其免疫測定應用，J.OFIMMUNOL.116，第1554-1564(1976)(以後稱為Kato);及Guesdon，J.L.，磁性固相酶免疫測定法用於對抗原和抗體的定量化人類免疫球蛋白E的應用，METHODSINENZYMOLOGY，73，第471-482，(1981)，在此引入每一篇文獻以供參考)。
適用的非人類「俘獲」抗體包括從鼠、兔、豚鼠和山羊得到的抗血清(見Sengupta和Butler)。
適用的固體支持器包括聚苯乙烯，濾紙、硝化纖維素、尼龍、鐵磁珠和溴化氰活化紙。聚苯乙烯和硝化纖維素最為優選(見Butler;PappasM.G.，點型ELISA在免疫寄生物學中最新的用途，VET.PARASITOLOGY，29，第105-129，(1988);LehtonenO.P.等人，ELISA中的抗原附著，J.IMMUNOL.METHODS，34，第61-70，(1980);Smith，K.O.等人，磁傳送裝置在固相放射免疫測定法和酶連接免疫吸收測定法中的應用，J.INFECT.DIS.，136，第S329-336，(1977);Hendry，R.M.等人，用尼龍耦合的酶連接免疫測定法對流感抗原的檢測和鑑定，J.VIROL.METHODS，6，第9-17，(1983)(以後稱為Hendry);Maiolini，R.等人，酶免疫測定的疊層法。I.在鼠和人類α-胎兒蛋白的應用;J.IMMUNOL.METHODS，8，第223-234，(1975)，以及SamantaA.K.等人，用硝化纖維素盤作為固相對睪酮的免疫測定，J.CLIN.CHEM.BIOCHEM.28，第943-947，(1990)，在此引入每篇文獻以供參考)。
可以使用的顆粒基質包括聚苯乙烯、膠乳、尼龍、磁珠、玻璃、瓊脂糖和瓊脂糖。串珠狀的聚苯乙烯和膠乳最為優選(見NilssonB.，一種用於放大ELISA的通用試劑，J.Immunol.Methods，114，第89-93，(1988);Henry;Gundersen，S.G.，磁珠抗原俘獲，用於血吸蟲陽極抗原的快速檢測的微滴定盤中的酶連接免疫測定法，J.Immunol.Methods，148，第1-8，(1992);Oku，Y.，用高靈敏珠的ELISA法檢測細菌蛋白質毒素的進展，Microbiol.Immunol.，32，第807-816，(1988);以及Harada，T.等人，用酶連接免疫吸收測定法檢測對B類嗜血桿菌流感的囊特異性多糖特異的黏膜和血清抗體，Microbiol.Immunol.29，第591-600，(1985);及Sigma，在此引入每篇文獻以供參考)。
適用的抗體酶軛合物及俘獲抗體對包括與辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酯酶、β-半乳糖苷酶或糖苷酶、鹼性焦磷酸酶或脲酶軛合的IgG或IgM同型的小鼠、山羊和兔抗人類IgA抗體(見Sigma;Notermans;Butler;Kato;Engvall;及Cerrone，M.C.等人，用於有限稀釋微培養分析的脲酶基微ELISA法的介紹，J.Immunol.Methods，138，第65-75，(1991)(以後稱為Cerrone)，在此引入以供參考)。
適於與HRP和鹼性磷酸酯酶及脲酶相軛合的適用的產色底物包括鄰苯二胺二鹽酸鹽、對硝基苯酚磷酸酯及脲分別加上一種pH指示劑(見Notermans;Butler;Cerrone和Sigma)。
用於本發明的合適的緩衝劑尤其包括磷酸鹽(0.001-0.1M)緩衝(pH＝6.6-7.4)鹽水溶液(0.10-0.20NNaCl)加上吐溫(0.01%-0.1%)(即PBST)。優選的緩衝劑為PBST，包括pH為7.01的0.01M磷酸鹽緩衝劑加上含有0.05%吐溫的0.15N的鹽水溶液。
用於本發明的ELISA還可以在溶液中進行，其中用目視法觀察顯色反應以給出所存在的IgA的水平。還可用生色的酶(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶和脲酶)來進行這些顯色反應，還可以同產螢光的底物偶合(見Notermans;Butler;Sigma和Magnusson，K.E.等人，用於定量分析對食物抗原的抗體的螢光連接免疫吸收測定法(FLISA)，Immunol.Invest.，16，第227-240，(1987)，在此引入以供參考)。
利用分光光度裝置或通過採用目視測定法，可以用這些顯色測定法來進行定量評估。這些測定法可包括採用包括一種酶-抗體軛合物及其相應的產色底物的PBST溶液。可以把這些溶液顏色的變化同由相應於特定濃度的IgA在標準試驗樣品中所引發的產色底物的顏色變化的一系列顏色標準的圖進行比較。通過將顏色的改變同相當的顏色標準進行對照，可以確定試驗樣品中IgA的水平。
當採用辣根過氧化物酶時，上述抗體軛合物的相應的產色底物可以包括鄰苯二胺二鹽酸鹽;當採用鹼性磷酸酯酶時，可以包括對硝基苯酚磷酸酯;並且當採用脲酶時，可以包括脲加上一種pH指示劑。
可以按下述方法建立一系列顏色標準對包括IgA濃度範圍已知的多個標準試驗樣品進行一系列比色測定，然後通過使顏色標準與強度和/或吸收相對照以建立這些顏色標準。這些顏色標準可以呈能代表一定範圍的顏色強度/吸收的某種形式的圖，所述的顏色強度/吸收相應於一個在試驗樣品中可以發現的很寬範圍的IgA濃度。
這些免疫測定法可以與固相支持器、微珠、凝膠、其它顆粒物或濾器聯合使用，其中顏色改變的最終產品被俘獲在一個固相支持器上。
適用的固體支持器包括聚苯乙烯、濾紙和硝化纖維素。聚苯乙烯和硝化纖維素最為優選。
可以採用的顆粒基質包括聚苯乙烯、膠乳、尼龍、磁珠、玻璃、瓊脂糖和瓊脂糖。串珠狀聚苯乙烯和膠乳較為優選。
如上所述的溶液測定法，對GCFIgA水平的目視定量測定是通過將GCF樣品的比色反應強度與代表GCFIgA水平範圍的一系列顏色標準進行比較而確定的。
可以按下述方法建立一系列顏色標準對包括IgA濃度範圍已知的多個標準試驗樣品進行一系列比色測定，然後通過使顏色標準與強度和/或吸收相對照以建立這些顏色標準。這些顏色標準可以呈能代表一定範圍的顏色強度/吸收的某種形式的圖，所述的顏色強度/吸收相應於一個在試驗樣品中可以發現的很寬範圍的IgA濃度。
測量試驗樣品中由GCF而來的IgA的另一個方法是放射免疫測定法(RIA)。Nerenberg和Prasad，MethodsinEnzymology，73，IMMUNOCHEMICALTECHNIQUESPartB，第666-691(1981)中介紹了此方法的一個例子，在此引入此文以供參考。
測量GCFPMN標誌的方法活化的PMN存在的標誌包括β-葡萄糖醛酸酶、水解酶、彈性硬蛋白酶、組織蛋白酶(如組織蛋白酶G和組織蛋白酶B/L)，以及反映PMN早期活化活動的明膠酶、酶髓過氧化物酶及其代謝產物(如LTB4或LTC4)。優選的PMN標誌為β-葡萄糖醛酸酶(BG)和彈性硬蛋白酶。
可以用各種方法測定BG，這些方法包括(但不限於)比色法和螢光分析法。
LamsterⅡ中介紹了測量BG的比色法。這些比色測定法包括測量從酚酞葡糖醛酸中釋放出的苯基酞。可以用這些測定法來定性及定量地確定GCFBG的水平，比如用分光光度法或採用目視測定法。
可以用分光光度法來確定GCFBG的水平，步驟包括將一個等分量(50ul)的試驗樣品加入到100ul的0.075M的乙酸鹽緩衝液(pH4.5)、50ul的0.15MNaCl鹽水和50ul的0.03M的酚酞葡糖醛酸(pH4.5)，並且在56℃下培養2小時。加入350ul的0.1M2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝液(pH11)以終止反應。測量在550um處相對於試劑空白的吸收，並且與一個酚酞標準曲線進行對照。用這些結果來計算每個GCF試驗樣品中BG的水平。
可以用目視測定法通過一種改進了的上述的分光光度測定法來確定GCFBG的水平。具體地說，可以按上述方法分析試驗樣品，直到加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝液為止。同時，將目視的顏色吸收/強度與代表BG標準曲線的吸收/強度範圍的顏色圖進行比較。將試驗樣品的目視顏色強度/吸收值與標準曲線進行對照;以給出GCF試驗樣品中BG的水平。
對上述試驗的一個進一步的改進是用產色底物對硝基苯基β-D-葡糖苷酸代替酚酞葡糖醛酸。在這種情況下，水解時BG所釋放出的黃顏色可做為試驗樣品中BG水平的一個量度。
可用螢光測定分析法對GCFBG進行定量分析，如Pope，M.等人在J.DentalResearch，70，Abstract704，1991年4月中所述，在此引入該文以供參考。螢光分析測定法包括對螢光分子的β-葡糖醛酸衍生物所釋放出的螢光副產品進行分光光度/目視測量。對BG的螢光測定法已可用於其他用途。這些測定法見Papasian等人的「用一種產螢光的β-D-葡糖醛酸酶測定法對大腸桿菌的快速鑑定，DIAG.MICROBIOL.INFECT.DIS.，8(4)，第255-8，(1988年12月)，在此引入以供參考。如LamsterⅡ中所述，通過用產螢光的前體底物4-甲基7-羥基香豆素基-β-D-葡糖醛酸化物代替酚酞葡糖醛酸，然後通過BG釋放出的螢光副產品(4-甲基-7-羥基香豆素)的量評價BG的水平，可以將這些技術用於檢測GCF中的BG。測定所釋放出的螢光副產品水平的方法是將待測物暴露在360nm紫外光下，並且將所得的螢光強度與包括已知BG濃度的各種試驗樣品標準曲線所顯示的強度進行比較。
通過採用一種酶俘獲測定法，也可以檢測出GCFBG的水平。這些方法的例子見Holt等人的《用於快速檢測特蠣中大腸桿菌的酶俘獲測定法》，55，(1)，第229-32，(1989年1月)，在此引入以供參考。將這種技術應用於檢測試驗樣品中GCFBG的步驟包括製備對人類BG(與大腸桿菌BG相反)的抗體製劑，並且將抗人類BG抗體製劑附著在一個微滴定板或其他適當的表面。隨後，與LamsterⅡ中所述的情況相同，加入試驗樣品並且進行培養。
可以用各種方法來測定GCF彈性硬蛋白酶的含量，這些方法包括(但不限於)比色測定、ELISA以及螢光分析法。一般而言，這些測定法包括從被彈性硬蛋白酶特異的水解的衍生肽中釋放出產色的或產生螢光的化合物。
可以用比色和螢光測定法來定量確定GCF彈性硬蛋白酶的水平，比如，通過分光光度法及通過目視測定法。
螢光分析法包括對從螢光分子的肽基衍生物釋放出的螢光副產品進行分光光度/目視測量。各種測量GCF彈性硬蛋白酶水平的螢光分析法見Cox，S.W.和EleyB.M.，用7-氨基-4-三氟甲基香豆素的肽基衍生物檢測牙周炎患者的齦縫流體中組織蛋白酶B-和L、彈性硬蛋白酶、類胰蛋白酶、胰蛋白酶及二肽基肽酶Ⅳ類活性，J.PERIO.RES.，(24)，353-361，(1989)(以後稱為CoxⅠ)以及在Cox等人的「用於測定齦縫流體中的蛋白酶的一種簡便的組合的產螢光的和產色的方法，J.PERIO.RES.，(25)，164-171，(1990)(以後稱為CoxⅡ)，在此引入這兩篇文獻以供參考)。
測量GCF樣品中PMN彈性硬蛋白酶水平的適用的比色分析法見CoxⅡ，AsmanB.，PeripheralPMNcellsinJuvenilePeriodontitis;IncreasedReleaseofElastaseandofOxygenRadicalsafterStimulationwithOpsonizedBacteria.，J.CLIN.PERIODONTOL.，(15)，360-364，(1988)(以後稱為Asman)，以及Kramer等人的「MeasurementofFreeHumanLeukocyteElastase/alpha-1ProteinaseInhibitorComplexedbyanEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay」，J.IMMUNOLOGICALMETHODS，(131)，41-48，(1990)(以後稱為Kramer)，SuomalainenK.的「CharacteristicsofNeutralProteasesinInflamedHumanGingiva」，SCAND.J.DENT.RES.，(97)，346-354，(1989)(以後稱為Soumalainen)，以及Palcanis，在此引入這些文獻中的每一篇文獻以供參考。
GCFIgA/PMN標誌比的確定可以計算某個患者或某個部位的GCFIgA/MPN標誌比。為確定某一個別患者患牙周炎危險的等級，需確定取自每個有關部位的每個GCF樣品的GCFIgA和PMN標誌的水平，並且隨後確定取自每個有關部位的每個GCF樣品的GCFIgA/PMN標誌比。反過來，可以計算取自口腔中所有試驗部位的GCF樣品的IgA/PMN標誌比的平均值，得到對於給定的患者的IgA/PMN標誌比。
GCFIgA/PMN標誌比的絕對值是所測的特定的PMN標誌、所用的檢測系統以及用於表示這些結果的單位的函數。GCFIgA可以表示為GCF中所存在的IgA的質量(如ng/樣品)、每個樣品的ELISA單位的總數(如吸收單位)、每個樣品的RIA單位或用於目視ELISA測定的標準標度的分值。例如，PMN標誌、BG和彈性硬蛋白酶可以表示為酶單位/樣品，或表示為用於目視酶俘獲測定的標準標度的分值。採用IgAELISA單位(如每個樣品的吸收單位)將給出一個與採用每個樣品IgA的ng數不同的代表GCFIgA/BG比的絕對值。這些，對本發明的每個實施例而言，須將所述的計算結果校準為特定的值以用於表示所檢測的IgA/PMN標誌的水平。
IgA/PMN標誌比的校準測量IgA和PMN標誌的濃度的結果所參照的比較標準可以通過臨床試驗來加以確定。一種獲得一個標準的方法是要縱向評價正常的健康患者和牙周炎患者的群體以便根據各個IgA/PMN標誌比在隨後的臨床參數中變化校準相應的IgA/PMN標誌比。給定一個用於GCFIgA和PMN標誌濃度的定量化特定的裝置，可以採用從上述群體得到的IgA/PMN標誌比，估計統計標準方差，以便將某一標誌比範圍分成代表低、中、高活性牙周炎的發病率。
可以在研究過程中登記多個牙周健康患者組(即牙袋深度不超過4mm並且有關部位的附著損失不大於2mm)以及多個成人牙周炎患者組。可取的是每個組中至少有10個患者較好;更可取的是每組中至少有40個患者。在每個患者的一系列預定的試驗部位採集GCF樣品，可取的是每個患者至少採集2個部位時。更可取的是每個患者至少採集2個部位時更好。然後用上述一個或多個特定的測定方法(或其他方法)確定GCFIgA和PMN標誌的水平。然後對每個患者口腔中每個特定部位進行基線臨床測量，如測量牙周附著水平或牙槽骨高度。然後可對患者進行給定的常規牙周保持護理，如進行刮牙和牙根修整，並且指導他們在一個標準時期(最好約6-12周)內保持他們正常的口腔衛生習慣。指定的時期過後，召集所有的患者，並且確定他們相應的牙周附著損失水平。疾病進程達到有意義的水平的那些患者和部位被認為是活性疾病患者/部位。疾病進程達到有意義的水平的標誌可以是損失增加，如至少一個部位的附著損失超過2mm並且/或骨損失達到一個可觀的水平(即損失大於所用的測量手段的統計偏差)。為確定將個體患者的比值所進行比較的標準，計算患活性疾病的患者組和未患活性疾病的患者組GCFIgA/PMN標誌比的平均值。(以後將這些值分別稱為「活性組平均值」和「非活性組平均值」)。對於一個有效的標準，非活性組平均值與活性組平均值之間的差值必須大於它們的標準偏差之和。為確定將個體部位的比值所進行比較的標準，另外還須計算患活性疾病的部位及未患活性疾病的部位的平均GCFIgA/PMN標誌比(以後稱這些值為「活性部位平均值」和「非活性部位平均值」)。對於一個有效的標準，非活性部位平均值與活性部位平均值之間的差別必須大於標準偏差之和。
其後，當採用同樣的IgA和PMN標誌測定法時，將平均總的口腔IgA/PMN比值高於一個低於非活性組平均值的標準偏差的任何患者稱為低危險患者。與此相似，將平均總的口腔IgA/PMN比值低於一個高於非活性組平均值的標準偏差的任何患者稱為高危險患者。將那些平均總的口腔IgA/PMN比值在一個高於活性組平均值的標準偏差和一個低於非活性組平均值的標準偏差之間的患者稱為中等危險患者。
與此相似，當採用與用於確定活性和非活性部位手段相同的IgA和PMN標誌測定法時，將平均總的口腔IgA/PMN比值高於一個低於非活性組平均值的標準偏差的任何部位稱為低危險部位。與此相似，將平均總的口腔IgA/PMN比值低於一個高於非活性組平均值的標準偏差的任何部位稱為高危險部位。將那些平均總的口腔IgA/PMN比值在一個高於活性組平均值的標準偏差和一個低於非活性組平均值的標準偏差之間的部位稱為中等危險部位。
診斷裝置本發明還涉及檢測或評價人類或較低等動物中目前或以後患活性牙周炎的危險率的診斷產品。這些診斷產品包括一個用於測量存在於所診斷的人類或較低等動物口腔中一個或多個部位中的齦縫流體中所存在的IgA量的裝置和一個用於測量PMN標誌的量的裝置。
這類診斷產品的一個例子是用於檢測和評價人類或較低等動物中的患者或部位疾病發展的危險率的診斷用品。
一種用於確定患者/部位的IgA/PMN標誌比的診斷用品包括確定IgA和一種指定的PMN標誌的存在所必需的材料。
對分光光度ELISA分析而言，此診斷用品內必須包括一種採集一個或多個GCF樣品的裝置以便可以得到IgA和PMN標誌中GCF水平的測量結果。為實現此目的，所述的用品可包括多個預先切割好的濾紙塊、毛細管、毛細吸管、微量吸管、衝洗齦縫的試劑(例如，與微珠、凝膠或磁性顆粒交聯以從齦縫中收集IgA和BG的特定的抗體)。
為分析IgA，用品可包括容器、試管、培養管、試劑瓶以及含有緩衝鹽水溶液的微型離心管，所述的緩衝鹽水溶液包括必要的試劑並且/或者為檢測GCFIgA的存在所製備的樣品和所進行的測定都是在這些溶液中完成的。這些組分可包括緩衝範圍為pH＝6.6-7.4的磷酸鹽(0.001-0.1M)、NaCl(0.10-0.20N)以及吐溫(0.01-.10%)(即PBST)，並且PBST溶液包括必要的試劑和產色底物。最好PBST包括0.01M的磷酸鹽緩衝劑(pH＝7.01)、帶0.05%吐溫的鹽水(0.15NNaCl)。
診斷用品還可包括進行測定所需的培養容器。適用的培養容器可包括試管、培養管、小杯和微滴定板。優選的培養容器為微滴定板。培養容器為96凹坑的聚苯乙烯微滴定板更好，比如可以是Nunc型免疫板1(丹麥的Roskilde)。
診斷用品還可包括一個用於從試驗樣品中俘獲IgA並且在ELISA(如抗血清)的發育過程中把它保持在微滴定井的底部的裝置。適用的抗血清可包括非人類的抗人類IgA「俘獲」抗體，如多克隆或單克隆抗IgA抗體製劑，它對IgA特異並且人類IgG、IgM、IgE或IgD交叉反應。抗血清取自非靈長類較好，最好取自山羊抗人類IgA。更為優選的是山羊IgG抗人類IgA抗血清和一種碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝溶液(最好為pH9.6的0.1M的緩衝溶液)。在4℃下將俘獲抗體在多個微滴定板中的碳酸氫鹽緩衝溶液中培養48小時，以使俘獲抗體附著在微滴定板凹坑的底部。
診斷用品中可能需要包括一種被誘導的抗血清以利於檢測由俘獲抗體所保持的IgA。最好被誘導的抗血清為上述的那類未標誌的抗血清。適用的標誌可包括酶標誌(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶或脲酶)、生物素標誌、放射標誌和螢光標誌。優選的抗血清為辣根過氧化物酶標誌的山羊IgG抗人類IgA。
如果所述的用品包括一種生物素標誌的抗IgA抗血清，那麼在PBST緩衝溶液中還可包括一種抗生物素蛋白標誌的軛合物。抗生物素蛋白標誌的軛合物特異地與抗生物素結合併且使得可用IgA和俘獲抗體檢測生物素標誌的抗IgA抗血清複合物。在軛合物中的抗生物素蛋白上的適用的標誌包括酶標誌(如帶有辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶的酶標誌)、放射標誌和螢光標誌。優選的抗生物素蛋白標誌的軛合物是一種抗生物素蛋白酶軛合物，最好是一種抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶軛合物。
為通過產生一種可見的色基而檢測IgA俘獲抗體複合物，診斷用品還可包括一種含有一種生色團體系的緩衝溶液。適用的生色團體系包括正鄰苯二胺和對硝基苯酚磷酸酯。如果緩衝液包括鄰苯二胺，那麼它還可包括約0.01%-1%的過氧化氫。
為使pH值保持在一個人類PMN標誌實現最佳的酶機能相一致的範圍，診斷用品可包括一種緩衝溶液。適用的緩衝包括pKa處於pH4.9周圍0.5pH單位的緩衝溶液，比如一種乙酸鹽緩衝溶液。優選的緩衝溶液是醋酸鈉緩衝溶液。如果採用的是乙酸鹽，優選的濃度在約0.01M-約0.5M之間。緩衝溶液優選的pH在約4.5-約5.5之間，最好在約4.9左右。
診斷用品還可包括一種可與聚苯乙烯或其他固體支持器(如濾紙、硝化纖維素、凝膠、微膠囊或微珠)連接的抗血清β-葡糖醛酸酶抗體。優選的情況是，抗人類BG抗體連接到聚苯乙烯上，連接到聚苯乙烯微滴定板上更好。
為檢測人類BG的存在，用品還可包括一種用於人類BG的產色底物。這類底物包括β-D-葡糖醛酸的軛合物，如酚酞葡糖醛酸，4-硝基苯基β-D-葡糖苷酸以及4-甲基-7-羥基香豆素基-β-D-葡糖苷酸。優選的底物為酚酞葡糖醛酸。如果用品中包括了酚酞葡糖醛酸，最好以pH為約4.5至約5.5的狀態提供這種酸。
診斷用品還可包括一種鹽水溶液，以便用這種溶液在IgA的ELISA測定法的各個培養步驟之間衝洗來自ELISA板的試劑。適用的鹽水衝洗溶液包括磷酸鹽緩衝的鹽水吐溫溶液。
也可以將一種HCl溶液加入到ELISA反應中，以便在用分光光度測定法讀取吸收值時使反應終止。這些，用品還可包括一種HCl溶液，用它來終止ELISA測定工作。所述的HCl溶液最好為濃度約為0.1M的溶液。
為終止BG的測定，用品中有必要包括一種緩衝劑。適用的緩衝劑包括氨基醇，如2-氨基-醇。優選的緩衝劑為2-氨基-2-甲基-1-丙醇。優選的緩衝液為濃度為約0.01M至約1M的水溶液，濃度為約0.1M更好。緩衝液的pH值為約9-至13，為約11更好。
在診斷用品中包括這些用於相應測定的標準曲線是有用的。這些標準曲線可以將用例如吸收單位和色強度獲得的相應的IgA和PMN標誌測定的數據轉換成試驗樣品中的IgA和PMN標誌的水平。因此，用相應的測定單位(例如吸收單位和色強度)的數據可以表示為水平或濃度(例如IgA為mg/ml或μg/μl或PMN標誌活性為單位/ml)(例如吸收單位或色強度)的函數。標準曲線可以通過製備代表GCF中IgA和PMN標誌濃度的整個範圍的標準試驗溶液，然後通過進行相應的IgA和PMN標誌的比色測定並且將結果圖示的方式測定那些標準溶液來得到。這樣的曲線可以表示為對應於標準試驗測定的吸收值的圖形，這個圖形作為相應的測定結果對由附加到相應的試驗樣品上的等級所表示的IgA和PMN標誌的濃度的關係曲線。
方法和診斷用品的例子下列非限定性例子以舉例的方式說明了本發明內容的相應的方法和診斷用品。
例1下面是本發明方法的一個代表性的例子。
測定患活性疾病的危險率的分光光度法包括首先在每個牙周炎患者的16-20個部位採集GCF樣品。採集工作是按照LamsterⅡ中所述的操作進行的。
隨後是按照Sengupta中所述的方法對GCFIgA水平的分光光度分析;按照LamsterⅡ中所述的方法對GCFBG水平的分光光度分析。然後計算IgA/部位的平均值(如每30秒所採集的GCF中IgA的ng數)以及BG/部位的平均值(如每30秒所採集的GCF中BG活性的單位)。再計算每個患者IgA/BG比的平均值[(即對每個目標準(平均的IgA/部位)/(平均的BG/部位)]。
舉例來說，用上述方法從一個患者(「MG」)採集GCF，然後測定該患者的平均IgA/GCF樣品/部位為45ng，而平均BG/GCF樣品/部位為2.3單位。再通過計算確定該患者MG的平均IgA/BG比為19.6。
採用與上述相同的分光光度測定法進行的臨床研究表明，患活性牙周炎的患者的平均IgA/BG比為21.1±7.2;而沒有出現附著損失的患者的平均IgA/BG比為125.2±46.6。
用臨床研究結果作為標準，並且將MG比值與所述標準進行比較，患者MG的IgA/BG比值低於上述的那些患活性牙周炎的目標值的平均值的一個標準偏差。這樣，MG患者處在患活性牙周炎的高危險率區(或然率大於80%)。
例Ⅱ下面是說明本發明方法的另一個例子，並且是對IgA和BG測定的一種目視定量方法。
按照LamsterⅡ中所述方法採集GCF;按照Sengupta所述方法進行GCFIgA的測定，所不同的是通過將所測定的溶液的顏色的改變與代表GCFIgA濃度範圍的一個標準系列的顏色強度進行比較來評價產色反應。
用LamsterⅡ中所述方法來進行GCFBG的分析，所不同的是通過將所測定的溶液的顏色的改變與代表在人類GCF中所發現的GCFBG水平的範圍內BG產色反應的一個標準系列的顏色強度進行比較來評價BG的水平。
這些比較顏色改變的顏色標準是通過對一系列試驗樣品進行IgAELISA和BG酶測定而得到的。每個試驗樣品包括不同的已知濃度的IgA和BG，以及代表一個寬範圍IgA和BG濃度的系列物。然後將每個相應的樣品的產色的顏色反應與包括適當的染料的個別的溶液相對照以得到一系列與所試驗的IgA和BG樣品顏色相同的溶液，進而得到一系列代表不同IgA和BG濃度的有色溶液。此系列溶液是同從待估價牙周炎發病危險率的患者所採集的GCF樣品所進行的產色的顏色反應測定結果相比較的顏色強度標準。
通過將由所測的GCF樣品所得的IgA和BG顏色強度與一個基質表上的相應的顏色標準進行對照，可以確定IgA/BG比，所述的矩陣表的Y軸代表人類GCF中所發現的BG濃度的增加，其X軸代表IgA濃度的增加。由相應的「X」和「Y」值所確定的矩陣表上的點落在一個危險率將為高、中等或低的區域中;代表低IgA/BG比的、離Y軸較低的三角形區域代表較高的危險率。
例Ⅲ下面是本發明的一個用品的一個有代表性的例子。
一個用於IgA/BG分析的分光光度用品被指定與一個微滴定板讀出器和一個分光光度計一同使用以便讀出測定結果。
為了採集GCF，用品包括20個預裁好的濾紙帶。
為了分析GCFIgA部分，用品包括20個包括PBST(0.01M磷酸鹽緩衝的、pH為7.01的0.15N的NaCl鹽水，帶0.05%的吐溫)的微離心管50mlPBST衝洗溶液;4個微滴定板;10ml在0.1MpH為9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝劑中稀釋成1∶256000的山羊抗人類IgA抗血清;10ml過氧化物酶標誌的山羊抗人類IgA，在PBST緩衝劑中稀釋為1∶4000;10ml的0.1M包括30mg鄰苯二胺與0.3%過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝溶液;10ml的0.1MHCl溶液，以及一個IgA測定用的標準曲線。
為了測定BG部分，用品包括10mlpH為4.9的0.075M乙酸鹽緩衝溶液;5mlpH為4.5的0.03M酚酞葡糖醛酸溶液;5ml0.15N的NaCl鹽水溶液;50mlpH為11的0.1M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩衝溶液;以及一個用於測定BG的標準曲線。
用品還包括一個矩陣表，其中所標定的X軸代表IgA水平的增加，所標定的Y軸代表在人類GCF中所發現的BG水平的增加，並且該表具有為表示出在高、中等和低危險率意義的標誌區域中上面有相應的IgA和BG坐標限定點的標誌的表區域。
例Ⅳ下面是本發明的一個用品的另一個有代表性的例子。
用於分析IgA/彈性硬蛋白酶比的分光光度用品包括GCF採集部分20個預裁好的濾紙帶。
GCFIgA分析部分20個包括PBST(0.01M磷酸鹽緩衝的、pH為7.01的0.15N的NaCl鹽水，帶0.05%的吐溫)的微離心管;50mlPBST衝洗溶液;4個微滴定板;10ml在0.1MpH為9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝劑中稀釋成1∶256000的山羊抗人類IgA抗血清;10ml過氧化物酶標誌的山羊抗人類IgA，在PBST緩衝劑中稀釋為1∶4000;10ml的0.1M包括30mg鄰苯二胺與0.3%過氧化氫的檸檬酸鹽緩衝溶液;10ml的0.1MHCl溶液，以及一個IgA測定用的標準曲線。
彈性蛋白酶測定部分2ml的TST緩衝溶液(50mM的TrisHCl，pH為7.0，0.15NaCl以及1%的三硝基甲苯X-100;如CoxⅡ中所述)，2個白色塑料盤;40個6mm直徑的Whatman3MM紙盤，用一種彈性硬蛋白酶底物(即溶於50mMTrisHCl中的250μM的甲氧基琥珀醯-Ala-Ala-Pro-Val-7-氨基-4-三氟甲基香豆素，pH為9.0，以及350mMNaCl和5%的二甲基甲醯胺並且乾燥一整夜)浸漬過;以及1ml溶於1.0N的HCl中的1%的對二甲氨基肉桂醛。
然後將相應樣品的產色的顏色反應同含有適當的染料的溶液相對照以得到一系列與所試驗的IgA和彈性硬蛋白酶樣品同樣顏色的溶液，進而得到一系列代表不同濃度的IgA和彈性硬蛋白酶的有色溶液。這個系列溶液就是同對取自危險率待測的患者的GCF樣品所做的產色的顏色反應測定所得結果所以比較的顏色強度標準。
確定IgA/彈性硬蛋白酶比的方法包括將由所測定的GCF樣品得到的IgA和彈性硬蛋白酶顏色強度與相應的在一個基質臺上的顏色標準相對照，所述的基質臺的Y軸代表人類GCF中所發現的彈性蛋白酶濃度的增加，並且X軸代表IgA濃度的增加。由坐標所確定的基質臺上的點落在一個將在確定為高、中等或低危險的區域中;越靠近Y軸的區域危險率越高。
權利要求
1.一種檢測或評價目前或以後患活性牙周炎的危險率的方法，包括a)採集齦縫流體；b)測量齦縫流體中IgA的含量；c)測量齦縫流體中多形核白細胞的標誌的含量；d)將從步驟(b)和(c)所得的量的比與一個標準進行比較。
2.如權利要求1所述的方法，其中IgA為總血清形IgA，並且多形核白細胞的標誌為β-葡萄糖醛酸酶。
3.如權利要求1所述的方法，其中IgA為總血清形IgA，並且多形核白細胞的標誌為彈性硬蛋白酶。
4.一種用於檢測或評價目前或以後患活性牙周炎的危險率的用品，包括(a)一個用於測量一個或多個齦縫流體樣品中IgA的量的裝置;(b)一個用於測量一個或多個齦縫流體樣品中多形核白細胞標誌的量的裝置;以及(e)一個由步驟(a)和(b)的裝置所確定的量的比值所進行比較的標準。
5.如權利要求4所述的用品，其中測量多形核白細胞標誌的量的裝置是一個測量β-葡糖醛酸酶的裝置。
6.如權利要求4所述的用品，其中測量多形核白細胞標誌的量的裝置是一個測量彈性硬蛋白酶的裝置。
全文摘要
本發明涉及檢測或評價目前或以後患活性牙周炎的危險率的方法和用品，包括(a)採集齦縫流體；(b)測量齦縫流體中IgA的量；(c)測量齦縫流體中多形核白細胞的標誌的量；(d)將從步驟(b)和(c)所得的量的比與一個標準進行比較。
文檔編號G01N33/68GK1093168SQ9311933
公開日1994年10月5日 申請日期1993年9月18日 優先權日1992年9月18日
發明者R·E·辛格 申請人:普羅格特-甘布爾公司