系列瓊膠低聚糖的製備和檢測方法
2023-05-23 16:04:01 2
專利名稱：系列瓊膠低聚糖的製備和檢測方法
技術領域：
本發明涉及了一個天然的系列有機聚合物一瓊膠低聚糖。特別是涉及一個系列瓊膠低聚糖的製備和檢測方法。
利用瓊膠酶製備瓊膠低聚糖的研究仍然著重於對結構的分析。其降解產物多為對最終產物的研究，。有關瓊膠的降解無論是酸解還是酶解主要是在降解終產物的分離和結構分析方面的研究和報告。沒有降解瓊膠的全部可溶性的低聚糖製備和檢測方法的報告和相關專利的提出。國外對降解瓊膠的研究多集中在對最終產物的結構分析，而國內對降解瓊膠沒能提出有效地檢測方法。
Jorge Vera等1998年(Identification of a Marine Agarolytic Pseudoalteromonas Isolate andCharacterization of Its Extracellular Agarase.Applied and Environmental Microbiology.，1998 64(11)4378-4383)利用微生物產生的瓊膠酶降解瓊膠，NMR檢測降解的終產物是新瓊四糖和新瓊六糖。
美國專利6,599,729(A-AGARASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME.，Jun Tomono，Kyoto(Japan)；Yoshiko Nomura，Kyoto(Japan)；Hiroaki Sagawa，Shiga(Japan)；Takeshi Sakai，Aomori(Japan)；andIkunoshin Kato，Kyoto(Japan).，Assigned to Takara Shuzo Co.，Ltd.，Kyoto(Japan).)報導了利用基因工程的方法生產具有α-瓊膠酶活性的多肽和利用多肽製備瓊膠寡糖的方法，其最終的產物為瓊二糖，瓊四糖和瓊六糖。
美國專利5,418,156(Agarase enzyme system from alteromonas strain 2-40.，Stosz；Sarah K，et al)報導了瓊膠酶降解瓊膠的最終產物為新瓊二糖，新瓊四糖和新瓊六糖。
美國專利5,834,257(alpha-agarase and production process of oligosaccharides and monosaccharides.，Sugano；Yasushi(Tokyo，JP)；Terada；Ichiro(Kanagawa，JP)；Kodama；Hisashi(Tokyo，JP))利用vibrio sp.JT0107產生的瓊膠酶製備瓊寡糖，最終產物為瓊五糖，瓊三糖，3，6-內醚-L-半乳糖。以上均沒有關於系列低聚糖產物的報導。
中國專利申請號00136891.8報導了一種利用蝸牛酶降解天然產物及多糖的方法，可將包括纖維素、人參、黃芪、甘草等天然產物以及殼聚糖、果膠、卡拉膠、瓊膠、褐藻膠、黃原膠、田菁膠、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等多糖原料降解成具有一定生物活性的小分子的功能物質和聚合度為3-20的寡聚糖。但無系列低聚糖產品的製備和檢測方法。
中國專利申請號00115094.7報導了一種瓊膠低聚糖及瓊膠寡糖的製備方法。此方法使用酸降解，且沒有說明寡糖的不同分子量範圍的製備和檢測方法。
本發明的目的是提供一種製備過程簡單，結果清晰的一系列瓊膠低聚糖的製備方法，以及對低聚糖產物組成和分子量範圍的檢測方法。該降解產物包括了分子量小於5000Da的水溶性瓊膠低聚糖的任意片斷。該系列產品可用於有效地活性分析，用於藥物和保健食品的開發。
系列瓊膠低聚糖的製備和檢測方法，包括使瓊膠溶於水，加入瓊膠酶進行反應，用沸水浴加熱使酶失活，離心後除去沉澱雜質，濃縮後乙醇分級，冷凍乾燥後用離子交換色譜分離瓊膠低聚糖片段，基體輔助雷射解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)確定低聚糖片斷的組成和分子量範圍。
本發明的製備方法對環境設備要求不高，簡單易行，成本低廉，適於推廣。
下面通過實施例說明本發明。
2％的瓊膠底物1000mL.，加熱使其充分溶解，冷卻至40℃左右。加入100mL瓊膠酶製品，35℃反應12h，沸水浴加熱使酶失活加入2倍體積的乙醇離心3000rpm，10min去除雜質，得到上清液。旋轉蒸發得到濃縮液，依次加入同等體積的乙醇，調pH7.0-8.0，依次離心得到系列低聚糖產品。
乙醇分級的降解產物採用陰離子交換柱進行分離。將具有相近分子量，不同硫酸基團的降解產物分離開。
基體輔助雷射解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)分析降解產物以9倍體積乙醇分級得到產物為例，經陰離子交換柱層析分離出兩個樣品峰F1和F2。質譜分析(見
圖1，圖2)可知F1為不帶有硫酸基、聚合度6-22的瓊膠低聚糖的混合物。
F2為帶有1個硫酸基、聚合度16-24的偶數糖的混合物。
本發明通過控制瓊膠酶水解瓊膠的工藝條件製備不同聚合度的低聚糖片段。再通過乙醇分級法將降解產物進行分級。用陰離子交換柱層析將有硫酸基團取代和沒有硫酸基團取代的，具有相同分子量範圍的分級產物進行分離。基體輔助雷射解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)分析得到不同聚合度的降解產物。利用此種方法可獲得分子量低於5000Da的水溶性瓊膠低聚糖的任意片段。
權利要求
1控制瓊膠酶水解瓊膠的工藝條件製備不同聚合度的低聚糖片段。再通過乙醇分級法將降解產物進行分級。用陰離子交換柱層析將有硫酸基團取代和沒有硫酸基團取代的，具有相同分子量範圍的分級產物進行分離。
2保護利用基體輔助雷射解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)檢測低聚糖片斷的組成和分子量範圍。
全文摘要
本發明涉及了一個天然的系列有機聚合物－瓊膠低聚糖。特別是涉及一個系列瓊膠低聚糖的製備和檢測方法。本發明的目的是提供一種製備過程簡單，結果清晰的一系列瓊膠低聚糖的製備方法，以及對低聚糖產物組成和分子量範圍的檢測方法。該降解產物包括了分子量小於5000Da的水溶性瓊膠低聚糖的任意片斷。該系列產品可用於有效地活性分析，用於藥物和保健食品的開發。系列瓊膠低聚糖的製備和檢測方法，包括使瓊膠溶於水，加入瓊膠酶進行反應，用沸水浴加熱使酶失活，離心後除去沉澱雜質，濃縮後乙醇分級，冷凍乾燥後用離子交換色譜分離瓊膠低聚糖片段，基體輔助雷射解吸離子化飛行時間質譜(MALDI－TOF－MS)確定低聚糖片斷的組成和分子量範圍。本發明的製備方法對環境設備要求不高，簡單易行，成本低廉，適於推廣。
文檔編號G01N33/00GK1546500SQ200310114439
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月8日 優先權日2003年12月8日
發明者江曉路, 王靜雪 申請人:中國海洋大學